プロトコルは、心臓機能を光を使用して特徴付けおよび制御できるショウジョウバエモデルを提示します。これにより、研究者は無傷の動物を使用してショウジョウバエのヒト心臓病を研究することができます。この方法は、ショウジョウバエの心機能の非侵襲的なOCTイメージングと光遺伝学的制御を確実に達成することができます。
高効率と高品質です。光遺伝学的ペーシングは、不整脈疾患を治療するための治療法として、電気的ペーシングの代替となる可能性があります。OCTイメージングと光遺伝学的ペーシングは、心臓オルガノイド、ゼブラフィッシュ、胚性の喉や心臓などの他のモデルシステムに拡張できます。
まず、バイアルごとにTM6ダブルタビーバージンメスとUAS Opsおよびストックからの2〜3匹のオスのハエの上に5つの手のGAL4を組み合わせます。翌日、ブルーミントンショウジョウバエストックセンターの指示に従って、ホットプレートの容器に100ミリリットルのショ糖あたり5.14グラムを加えて、半定義の食品を準備します。次に、絶えず攪拌しながら摂氏60度に冷却します。
次に、各バイアルに50マイクロリットルの100ミリモルのオールトランスレチナールエタノール溶液を加えて、ナローフライバイアルを調製します。血清学的ピペットを使用して、狭いフライバイルあたり5ミリリットルのフライフードを処分します。最高速度で10秒間ボルテックスした後、これらのバイアルを差し込み、暗い布で包み、光から保護します。
翌日、着実に産卵しているハエを、全トランス網膜エタノール含有食物を含むバイアルに移します。バイアルでラックを光から保護します。24〜48時間後、産卵数に応じて、バイアルの過密を防ぐために両親を捨てます。
次に、心臓イメージングのためにタビー以外の子孫を収集します。バイアルからUASオプションの手GAL4幼虫または蛹を選び、ティッシュの上に置き、ペイントブラシを使用して体表面からメディアをそっと拭き取ります。中央に両面テープの小片を付けて顕微鏡スライドを準備します。
次に、ブラシまたは細かいピンセットを使用して、背側を上にしてスライドの長辺に垂直になるように、幼虫または蛹をテープ表面にそっと置きます。穏やかな圧力を加えて、幼虫または蛹をテープの表面に取り付けます。次に、幼虫または蛹を下に向けてイメージングステージにスライドをセットアップし、レーザー制御ソフトウェアによって光干渉断層撮影またはOCT光源をオンにします。
カスタム記述スペクトルドメインOCT制御ソフトウェアを開きます。次に、プレビューウィンドウをクリックします。次に、スペクトルドメインOCTソフトウェアでスキャンパラメータを設定します。
マイクロマニピュレーターを使用してサンプルステージを制御し、フライハートに焦点を合わせます。焦点位置を調整して、フライキューティクル表面からの光の反射を最小限に抑えます。また、反射を最小限に抑えるために、幼虫または蛹の表面に鉱油を塗布することを検討してください。
次に、MモードOCT画像取得のスキャンパラメータを設定し、赤色光刺激パルスなしで5セットの制御データを取得して、安静時心拍数を計算します。カスタムOCT制御ソフトウェアでペーシング刺激の光パルスを設計します。このためには、設定タブをクリックし、設計された光パルスシーケンスを追加して、さまざまな刺激プロトコルに従ってパルス周波数、パルス幅、刺激時間、および待機時間を制御します。
次に、ライトコントローラーソフトウェアを開いて、赤色光パルスを生成します。モード選択でパルスモードを選択します。パルスプロファイル設定の図をダブルクリックし、フォロワーモードを選択します。
オフ強度をゼロに保ち、実際の電力密度を計算するときにオン強度のパーセンテージを設定します。OCT制御ソフトウェアの[取得]をクリックして、光刺激で鼓動するショウジョウバエの心臓のMモードビデオを取得します。画像取得中にハエの心臓に赤い光が点滅するのを記録します。
赤方偏移チャネルロドプシンおよびNPHRフライモデルでハエの心臓機能を制御するには、異なるペーシング設定が必要であることに注意してください。カスタム開発されたハエの心臓セグメンテーションソフトウェアを開き、ファイルの選択をクリックします。次に、グラフィカルユーザーインターフェイスで分析するファイルを選択します。
心臓領域の垂直方向と水平方向の両方の境界を、上部のテキスト ボックスにピクセル単位で入力します。[サイズ変更]をクリックします。下部のスライダーを使用して、心臓領域全体が表示され、コレクション全体のボックス全体がいっぱいになっていることを確認します。
予測タブをクリックすると、プログラムはコレクション内のすべてのスライスを調べ、約3分で心臓領域を選択します。予測が完了したら、HRプロットをクリックして、時間の経過に伴う心臓領域のプロットを新しいウィンドウに表示します。正しいピークエリアまたはバレーエリアを選択し、パルスタブを選択してからHRタブを選択して、最終的な数値を生成します。
機能パラメータは同時にCSVファイルに保存されます。手のGAL4ドライバーの組織特異性を、緑色蛍光タンパク質発現のイメージングによって検証した。ここでは、幼虫と蛹の体の断面の典型的なOCT画像を示します。
さまざまな心臓の状態を模倣するために、4種類の光パルスが設計されました。5秒間の待機時間の後、10秒間続く単一の脈拍は、回復可能な心停止を引き起こした。安静時心拍数よりも低い周波数での心臓ペーシングには、ペーシング周波数が安静時心拍数の半分に等しい2つの光パルスシーケンスと、安静時心拍数の4分の1が8秒間続き、その間に6秒の待機時間が使用されました。
赤方偏移チャネルロドプシン活性化による心拍数を増加させる刺激パターンは、光パルスの3つのシーケンスで構成されていました。光信号に続く心臓収縮頻度の低下は、幼虫と蛹を模倣する心拍数の低下をもたらしました。異なる刺激周波数の一連の3つの光パルス列を幼虫に適用し、蛹の心臓は光パルスに続いて心拍数の増加をはっきりと示しました。
正しい子孫の準備の選択、標本の取り付け、およびイメージング手順が不可欠です。私たちは、光遺伝学的ペーシング技術をより大きな動物モデルに移し、哺乳類の心臓病を研究し、不整脈を治療するための新しい治療アプローチを探求したいと考えています。
