毒性試験および表現型薬物スクリーニングのためのiPS細胞由来心筋細胞におけるカルシウムシグナルのハイスループット光学制御および記録(英語)

iPS細胞由来心筋細胞におけるあらゆる光制御と誘発細胞活性の観察のための無数の方法を、ハイスループット薬物スクリーニングおよび毒性試験のために実証します。時間と空間における表現型パターンのマルチパラメトリック定量を可能にし、数時間または数日にわたって薬物の効果を観察することを可能にします。この方法は、神経細胞やベータ細胞などのさまざまな種類の細胞に適用して、機能スクリーニングや毒性試験を行うことができます。

手順を実演するのは、私の研究室のバイオイメージングエンジニアであるWan-Chi Suです。iPS細胞心筋細胞を解凍のために冷蔵倉庫から取り出しる前に、マルチウェルプレートを準備します。96ウェルマイクロプレートの各ウェルに、フィブロネクチン1ミリリットルあたり50マイクログラムを含む100マイクロリットルの0.02%ゼラチン溶液でコーティングして、すべての表面を完全に覆います。

iPS細胞心筋細胞を液体窒素貯蔵タンクから摂氏37度の水槽に移します。バイアルをクラス2のバイオセーフティキャビネットに入れ、9ミリリットルの室温培地を含む新しい15ミリリットルのコニカルチューブに内容物をそっと移します。細胞を200倍Gで室温で3分間遠心分離します。

上清をピペットで捨て、10マイクロモルのROCK阻害剤Y27632を含む1ミリリットルの培地に細胞を静かに再懸濁します。プレートセルは、製造元の指示に従って、1平方センチメートルあたり100, 000〜150, 000セルの密度で96ウェルプレートをコーティングしました。24時間後、プレートの表面に付着した細胞が他の細胞と接触していることを確認します。

細胞を72時間プレーティングした後、GECIウイルスキットを氷上で解凍します。メンテナンス培地を使用して倍強度ウイルスキットストック溶液を調製します。培地容量をウェルあたり100マイクロリットルに調整して、感染用の細胞を準備します。

100マイクロリットルのプレミックスウイルス溶液をウェルに加え、摂氏37度で8〜16時間インキュベートします。インキュベーション後、200マイクロリットルの予熱培地と交換します。イメージングシステムを使用して、形質導入の24時間後にGECIの発現を視覚化します。

機能アッセイを実行する前に、加湿インキュベーター内の細胞を維持します。ハイコンテントイメージングシステムのすべてのデバイスの電源を入れます。チャンバーの温度が摂氏37度に達することを確認します 5%二酸化炭素補給。

イメージングソフトウェアを開き、96ウェルプレートのプレート設定を選択します。蓋なしの96ウェルプレートをチャンバーに入れ、生細胞シールリングを上部にロードします。必要な空間分解能に応じて、20X、60X、および20Xの水浸対物レンズを選択してください。

実験的な取得前に、鮮明な画像を撮影するためにフォーカスを調整します。カルシウム活性記録のために、ウェルごとにランダムに3〜5つの領域を選択します。さまざまなインジケーターに適切なフィルターを選択します。

使用するイメージングチャネルごとに適切な発光ダイオード電力を設定します。カメラの露光時間を最大40ミリ秒または25ヘルツに設定し、心筋細胞で発現するMNG-GECOおよびK-GECOプローブによって報告されたカルシウム過渡現象を観察するためのストリーム取得の記録時間を30秒に設定します。フレームレートが高い場合、信号対雑音比が2未満の場合は、LEDの電力を増やします。

光遺伝学的刺激のために、1ヘルツで青色光のパワーと周波数を最適化し、取得を開始します。E4031ドフェチリドとベラパミルをDMSOに再懸濁し、タイロードのバッファーで希釈します。化合物を対応するターゲットウェルに配置します。

自動マイクロ流体システムを介して100マイクロリットルの倍強度化合物をウェルに追加し、目的のインキュベーション期間後に取得を開始します。ソフトウェアを使用してパルス機能を経時分解能で自動的に検出することにより、信号領域をバックグラウンドから分離します。カルシウムピーク解析ソフトウェアを使用して、鼓動周波数、ピーク信号、カルシウム過渡持続時間50%カルシウム過渡持続時間90%立ち上がり時間、および減衰時間を解析します。

薬物治療の有無にかかわらず、iPS細胞由来心筋細胞によって発現されるNMG-GECOにおける自発的なカルシウム振動の観察がビデオで実証されています。MNG-GECOを使用して得られたキネティックトレースは、小分子イオンチャネル阻害剤ベラパミル、ドフェチリド、およびE4031が予想通りカルシウム過渡現象に影響を与えることを示しました。標準化されたペース条件下でのE4031の線量反応を評価するために、チャネルロデプシン-2、およびiPSC CMを発現するK-GECOを1ヘルツおよび470ナノメートルパルスの光を用いて光学的に制御し、赤色K-GECOシグナルを用いて観察した。

ピーク振幅の漸進的な減少、およびカルシウム過渡現象の減衰時間の増加は、E4031の濃度の増加と共に起こる。E4031の用量依存効果は、ピーク振幅の減少に対して最も明白であった。透明なカルシウムトランジェントは、ウイルス形質導入後1か月後、または光学ペーシングに使用される追加の光なしで目に見えるままです。

グラフは、LVNC iPSC CMモードで拍動速度を増加させ、収縮間隔を規則化し、一過性カルシウム振幅を増加させるように見える薬物を示しています。拍動周波数の変動性、およびその後のカルシウム過渡持続時間への影響も、iPSC CMが培養中に維持されるにつれて変化します。ER LAR-GECO、MTG-Sepia、NIR-GECOを含むいくつかのGECIは、小胞体、筋小胞体、ミトコンドリア、およびサイトゾルでそれぞれ生じるリアルタイムのカルシウム活性測定のために、細胞モデルで単独で、または組み合わせて発現するために開発されています。

GECIをiPSC CMモデルで組み合わせて、さまざまな細胞内カルシウム貯蔵を研究することができます。心筋細胞を発現するK-GECOは、経時的に一貫した拍動挙動を示した。しかし、Fluo-4の負荷は、このモデルの拍動周波数とCTDの両方に影響を与え、Fluo-4自体がそのような実験の結果に影響を与える可能性があることを示唆しています。

コントロール細胞や患者由来細胞から表現型プロファイルを簡便に研究する方法を提供し、iPS中間体は様々な疾患における創薬に光を当てる可能性がある。