このビデオでは、7点スコアリングシステムを使用して、C.elegansのドーパミン作動性ニューロンデンドライト形態の変化を定量化する方法を示します。現在、ワームの神経変性を定量化する分析方法には大きなばらつきがあります。さらに、一部の既存のスキルは細胞体のみに焦点を当てており、特定の種類や損傷レベルに敏感ではありません。
このスコアリングシステムを導入する目的は、あらゆるレベルの損傷で神経変性の包括的な画像をキャプチャする能力を提供し、C.elegansドーパミン作動性神経変性研究全体の一貫性をサポートする普遍的なシステムを提供することです。ここでは、蛍光下でニューロンを画像化し、それらのニューロンの樹状突起にスコアを割り当て、結果を表示および解釈する方法をプレビューする方法を示します。実験グループごとに、ピペットまたは20〜30個のワームをイメージング顕微鏡と互換性のあるイメージングプラットフォームにピックします。
最も一般的なプラットフォームには、カバースリップ付きのガラススライドに取り付けられた2%のアガロースパッドと、液体媒体の100マイクロリットル以下でウェルボリュームを含む96ウェルプレートが含まれます。ワームが完全に麻痺することを許可します。これには数分かかる場合があります。
準備されたイメージングプラットフォームをzスタックキャプチャが可能なイメージング顕微鏡にロードします。最初に明るいフィールドでワームの頭部領域を見つけ、次にイメージング顕微鏡を使用して単一色のGFP蛍光の下に位置付けます。このワームは400倍の倍率でここに示されています。
フォーカスをスクロールして、樹状突起がはっきりしている上限と下限を見つけます。Z スタック イメージ キャプチャの上限と下限として設定します。希望のピッチを選択します。
ここでは、1マイクロメートルを使用します。クリックすると、Z スタック イメージが GFP 蛍光チャネルにキャプチャされます。各 z スタックについて、顕微鏡ソフトウェアまたは外部イメージ解析ソフトウェアを使用してイメージファイルを開きます。
スタックをソフトウェアにロードし、スタックを単一のフラット化されたイメージに圧縮します。手動で、または自動巻き上げソフトウェアを使用して、処置グループ間で画像を整列させます。一度に 1 つのニューロンイメージを操作します。
4 つの CEP デンドライトのいずれかを選択して、曲げ、キンク、曲線などのブレブ、ブレーク、および不規則性を評価します。マウスが画像の上部にある場合は左から右にスコアリングを行い、スコアリングの再現性を確保することをお勧めします。これらのガイドラインを使用して、各樹状突起に 1 つのスコア値を割り当てます。
目に見える損傷のないデンドライトのスコア、不規則性はあるがブロブや破損のないデンドライトのスコア、5つ未満のブレブを持つデンドライトのスコア2、5~10ブレブのスコア3、10以上のブレブのスコア4、および/またはブレークジを割り当て デンドライトの25〜75%を除去する破損のスコアは5で、デンドライトの75%以上が存在しない場合は6のスコア。1 つの樹状突起内で複数の基準が満たされている場合は、最高得点に対応する基準を考慮してください。このビデオに関連する資料の図 1 に示されているこれらの代表的なスコアリング イメージを参照として使用できます。
スコアリングを実証するために、いくつかの例のニューロン画像にスコアを割り当てる方法について説明します。最上部のデンドライトから始めると、目に見えるブレブ、休憩、または凹凸はありません。ゼロのスコアを割り当てます。
2番目の樹状突起には約14のブレブがあり、目に見える休憩はありません。4 のスコアを割り当てます。第3の樹状突起は、樹状突起2と重なるために完全に見ることができず、得点することができない。
一番下の最もデンドライトは約11ブレブといくつかの休憩を持っています。5 のスコアを割り当てます。この画像では、1つの樹状突起がzスタックキャプチャで完全にキャプチャされなかったため、3つの樹状突起だけがスコレブルです。
3つの目に見える樹状突起にはブレッピングはありません。したがって、これはゼロ、ゼロ、そしてここでのキンクのために、上から下に得点されます。最後に、この画像では、4つの樹状突起はすべて75%以上失われています。
ここのすべての樹状突起は6のスコアを受け取ります。すべてのスコアを記録します。スコアは、現時点では盲目になる可能性があります。
ここで使用するスコアテンプレートは、補足ファイルにあります。治療群で採点された樹状突起の総数で神経変性スコアを割る。各神経変性スコアにおいて治療群内の樹状突起の割合としてデータを提示する。
我々のスコアリングシステムは、ロテノーン曝露後のL4幼虫期BY200 C.エレガンスにおける神経変性を評価するために使用された。各実験グループの各スコア値における樹状突起の総数の比率と同様にデータが表示されます。各デンドライトはn1として得点したと考えています。
この図では、ロテノーン曝露に対する用量依存性神経変性応答が理解でき、スコア分布の具体的な内訳が明確に示されている。これらの実験群は、複数の比較のためのボンフェローニ補正によって補足された独立性のためのカイ二乗検定に従って統計的に異なっていた。このビデオでは、C.elegansのドーパミン作動性ニューロン形態変化および変性のレベルを定量化するために、研究室で開発された7点スケールを使用する方法を実証しました。
スコアリング法を用い、分析の一貫性を促進し、ワームにおける神経変性研究の比較を可能にする。我々のスコアリングシステムは、ドーパミン作動性ニューロンの可視化を可能にするdat-1ドーパミントランスポーター遺伝子などの細胞特異的蛍光レポーターを用いたC.elegans実験から得られたデータを分析するために使用することができる。さて、この記事の補足資料で、この方法に新しい研究者のトレーニング、キャリブレーション、評価に使用できる解説付きの画像の練習セットを見つけてください。
