精巣上体白色脂肪組織を用いた脂肪被覆膵島移植

このプロトコルは、白色脂肪組織への膵島生着のメカニズムを評価することを可能にする。この脂肪で覆われた膵島移植法の主な利点は、技術的に複製が容易であることです。この方法は、他の疾患モデルにも適用することができる。

例えば、癌のマウスモデルを作成するために使用することができる。手順のデモンストレーションは、福岡大学の坂田直明准教授です。解剖顕微鏡下で、P 200マイクロピペットを使用して、腺房組織や線維組織を含む膵臓消化物から余分な膵島成分を除去します。

次に、セルストレーナーを使用して、単一の腺房細胞をろ過します。ろ過した膵島を、ウシ血清またはアルブミンを添加した適切な培養液または緩衝液を含む新しい培養皿に移し、皿を旋回させて膵島を中央に配置します。P 200マイクロピペットを使用して、個々の膵島を適切な収集チューブにピッキングします。

新しい40マイクロメートルのセルストレーナーを50ミリリットルのプラスチックチューブの上に置きます。1000マイクロリットルのピペットを使用して膵島をストレーナーに追加し、膵島と単一の腺房細胞を分離します。鉗子を使用して、ウシ血清またはアルブミンを添加した培養培地または適切な緩衝液を含む新しい60または100ミリリットルサイズの未処理培養皿にストレーナーを反転させます。

新鮮な培地またはバッファーを使用して膵島を新しい培養皿に洗い流し、次に培養皿に十分な培地または緩衝液を加えて、総容量が約20ミリリットルになるようにします。顕微鏡下で膵島を数え、ドナー動物の数に応じて、個々の1.5ミリリットルのプラスチック遠心管間で膵島の数を均等に分割します。膵島を2, 100 Gで室温で1分間遠心分離し、上清を廃棄します。

通常、約20〜30マイクロリットルの残留溶液がチューブに残ります。感染を防ぐために腹部から毛を取り除いた後、マウスを仰臥位に置きます。腹部と鼠径部を消毒した後、中央下部の皮膚を切開し、長さ約2センチの皮膚切開を行います。

左腹壁を鉗子または開創器で固定し、組織をマウスの左側に引っ張って手術野を固定します。綿棒を使用して、小腸と大腸をマウスの右側に動員します。腹腔内の左表皮白色脂肪組織は左鼠径部に位置する。

表皮の白い脂肪組織と左の精巣を腹部の外側に動員し、組織を伸ばします。P 200マイクロピペットを使用して、1.5ミリリットルのチューブから膵島の全容量を採取し、採取時にチューブ内に膵島が残らないように注意します。集めた膵島を重力によってピペットの先端に沈降させます。

マイクロピペットチップを膨張した脂肪組織に軽く置き、チップ内の培地またはバッファーが過度に洗い流されないように注意します。膵島を組織に慎重に播種します。播種後、解剖顕微鏡で膵島の正しい配置を確認します。

膵島を表皮白色脂肪組織で覆い、次に左精巣を上体白色脂肪組織の下に置き、組織を腹腔内腔に戻す。4-o縫合糸を使用して皮膚を2層に閉じます。終了したら、マウスをヒートランプの下に置き、完全に回復するまで監視します。

脂肪で覆われた膵島移植と腹腔内膵島移植後の移植効果を比較するため、対照レシピエント糖尿病動物の左傍結腸腔の腹膜に同数の膵島を移植した。脂肪で覆われた膵島移植マウスの血糖値は、腹腔内膵島移植マウスと比較して徐々に有意に低下することが観察された。腹腔内ブドウ糖負荷試験は移植後1ヶ月で行った。

脂肪で覆われた膵島移植マウスの血糖値は、腹腔内膵島移植マウスで観察されたものよりも低いレベルに維持されました。組織学的検査は、表皮白色脂肪組織への膵島生着を評価するために使用されました。脂肪で覆われた膵島移植レシピエント動物において、ヘマトキシリン始新世染色により、表皮白色脂肪組織内に膵島の存在が明らかになった。

さらに、インスリン陽性膵島の蛍光標識抗体染色は、すべてのレシピエントマウスの表皮白色脂肪組織内のフォンビルブランド因子陽性微小血管の検出を容易にした。この手順を成功させるには、膵島がピペットの先端に完全に定着し、こぼさずに脂肪組織に播種してください。