このプロトコルは、水圧破砕が近くのストリーム内の細菌に影響を与えるかどうか、そしてどのように影響するか、またストリーム自体に影響を与えるかどうかという質問に答えるために使用できます。この技術の主な利点は、データ分析を通じてサンプル収集から研究者を取るので、その全体的な性質です。この手順のデモンストレーションは、私の研究室のバイオインフォマティクス学者のジェレミー・チャンゼー、ジュニアタ・カレッジの学部生であるシドニー・リーガル、私の研究室マネージャーのギリアン・ライスターです。
核酸抽出用の沈着物サンプルを収集するには、手袋を使用して、キャップされた無菌50ミリリットルの円錐管を海岸から流水に沈めます。チューブが水没している間、キャップを取り外し、キャップを使用して、チューブに1〜3センチメートルの深さから約3ミリリットルの堆積物をすくいます。サンプルを採取した後、チューブから約1ミリリットルの水を除くすべてをダンプし、1,000マイクロリットルのピペットを使用して3ミリリットルのDNA/RNA保存剤をサンプルに加えます。
キャップ付き円錐管を5秒間旋回し、防腐剤とサンプルを完全に混合し、サンプルを氷の上に保存します。ラボに戻ると、16S DNA分析のためにマイナス20°C、メタトランスクリプトミクスRNA分析のためにマイナス70°Cでサンプルを保存します。フィルターコレクションの場合、完全にボトルを1回充填する前にボトルを条件付けするために、流水で無菌1リットルボトル全体を完全に充填して空にします。
安定した表面に、無菌のルアーロックシリンジに流水のフルボリュームを引き込み、0.22ミクロンの毛穴サイズで無菌およびDNA/RNAフリー直径1.7センチメートルのポリエーテルスルホンフィルターにシリンジを接続します。フィルターを通して流水の全容を洗い流す。サンプルの体積全体を同じように濾過したら、約20ミリリットルの空気をシリンジに引き込み、フィルターを通して空気を押し込んで、フィルターから余分な水を取り除きます。
次に、P1000マイクロピペットを使用して、フィルタのバレル内のピペットの先端でフィルターを水平に保持しながら、フィルタのより大きな開口部に2ミリリットルのDNA/RNA保存剤を追加し、防腐剤がフィルタに入ることを確認します。その後、各開口部の周りにパラフィンフィルムのしっかりと包まれた正方形でフィルターを密封し、氷の上の滅菌サンプルバッグにフィルタを置きます。サンプリングから戻ると、16Sまたはメタトランスクリプト分析用のフィルタをサンプルに保存します。
サンプルの移管を開始する前に、10%漂白剤と70%エタノールで作業領域を清掃してください。沈み込みサンプルからの核酸抽出には、炎とエタノール殺菌金属工具を使用して、約250ミリグラムのサンプルをマイクロ遠心チューブに移します。フィルターサンプルからの核酸抽出には、70%エタノールと炎殺菌バイスグリップを使用して、滅菌表面のフィルターケーシングを破り、ケーシングからコアを取り除きます。
無菌メスを使用して、コアの上部、底部、および継ぎ目に沿ってスライスし、滅菌ピンセットを使用してフィルターペーパーを折りたたみ、メスで小片に切ります。その後、フィルター片を、滅菌されていない表面に接触することなく、慎重にマイクロ遠心チューブに入れなさい。いずれかのタイプのサンプル内の細胞のリシスの場合、チューブを高速で細胞破壊器に供する。
少なくとも5分後、サンプルを遠心分離し、上清を新しい滅菌マイクロ遠心チューブに移します。溶解バッファーを上清に1対1の比率で加え、溶液を提供されたフィルターに移します。フィルターを新しいマイクロ遠心チューブに入れ、400マイクロリットルの準備バッファーをチューブに加えます。
遠心分離後、700マイクロリットルの洗浄バッファーをチューブに加え、フィルターを再び遠心分離します。フロースルーを廃棄した後、400マイクロリットルの洗浄バッファーをチューブに加えて遠心分離し、フィルターを新しい滅菌マイクロ遠心チューブに移します。DNAを溶出するには、50マイクロリットルのDNase/RNaseフリー水でフィルターを室温で5分間処理します。
その間に、3つのHRCフィルターをコレクションチューブに入れ、600マイクロリットルのHRC準備液を加えます。遠心分離後、フィルターを新しい滅菌マイクロ遠心チューブに移し、溶出したDNAを遠心分離のためにフィルターに移します。フロースルーには、抽出されたDNAが含まれています。
DNA 16S RNAライブラリーを作成するには、まず、標準的なPCRプロトコルを用いて16SリボソームRNA増幅用に新たに抽出したDNA産物を使用します。得られたPCR産物の7マイクロリットルと13マイクロリットルのDNaseフリー水を混合し、PCR溶液を2%アガロースゲルにロードします。その後、ゲルを60〜90分間90ボルトで実行し、増幅成功の証拠として386塩基対のバンドサイズを確認します。
DNA 16S リボソーム RNA ライブラリを精製するには、明るいバンドを生み出した PCR 産物の 10 マイクロリットルと、無菌マイクロ遠心チューブにかすかなバンドを生じさせたサンプルの 13 マイクロリットルをプールし、各プールされたサンプルのナノグラムを 150 ~ 200 ナノグラムの新しい 2%ゲルの個々のウェルにロードします。示されているようにゲルを動かした後、ゲルから386塩基対バンドを物品切りし、市販キットを使用してDNAを精製します。次に、精製したDNAを塩酸塩10ミリモルトリスの30マイクロリットルで溶出し、精製されたライブラリをドライアイスに詰めてから、次世代シーケンシングに向けて出荷します。
この代表的な分析では、1つを除くすべての抽出は成功と呼ばれます。PCR増幅後に観察された明るいバンドは、16Sプロトコルの成功を示します。16Sサンプルは最低1,000個の配列を持ち、少なくとも5,000個の配列が理想的であるのに対し、メタトランスクリプトサンプルは最低500,000個の配列を持ち、少なくとも200万個が理想的である必要があります。
16Sおよびメタトランスクリプト法分析のための13の異なるストリームで21の異なる部位からの沈入サンプルが示されている。これらの21のサイトのうち、12はフラッキング活動の下流にあり、油圧破砕陽性に分類され、9はフラッキング活動の上流またはフラッキングが存在せず、油圧破砕陰性に分類される流域であった。PERMANOVA分析によって評価されるように、水圧破砕正負データの間で観察された分離は、水圧破砕陽性サンプルがフラッキングの影響を受けたことを示唆している。
最も重要なランダムフォレスト予測因子は、サンプルを正しく区別するために最も重要な機能を明らかにします。ランダムフォレストモデルによって重要と識別された場合、水圧破砕陽性サンプルにおけるその抗菌性プロファイルは、負のサンプルを破砕する油圧でのプロファイルと比較することができます。それらが大きく異なる場合、それは殺生物剤を含むフラッキング流体がストリームに入った可能性があります。
微生物は至る所にあるので、汚染はこの種の作業で重大な潜在的な問題です。初期サンプル転送手順は、特にこの傾向があります。微生物の生分解や他の代謝に興味がある場合は、RNAの散弾銃シーケンシングを使用して、活性微生物遺伝子発現を調べることができます。
この技術により、その場所での細菌群集を調査するための分子技術の標準化と、細菌配列データのバイオインフォマティクス分析が可能になります。
