この作業は、NIA R00 AG053412 (KEF) によってサポートされました。

すべての手順は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用のためのガイドの勧告に従って、動物を含む生物医学研究のための国際指導原則に従って行われました。この議定書は、ノースカロライナ大学シャーロット制度動物の世話と使用委員会(プロトコル#19-020)によって承認されました。
1. 文化の準備
注:これらの手順は、組織培養指定のバイオセーフティキャビネットで無菌条件下で行う必要があります。メディアとソリューションについては 、表 1 を参照してください。
<ol><li>自己シール滅菌袋でオートクレーブすることにより、すべての解剖ツールを殺菌します。</li>
	<li>12ウェルの文化料理を扱うためのポリD-リジンの作業ストックを準備します。<ol>
<li>ポリD-リジンを1xホウ酸バッファーに100 μg/mL(10x濃縮)の濃度に溶解します。必要になるまで-20°Cで約1mLのアリコートを保管してください。</li>
		<li>10倍濃縮ポリD-リジンをdPBSで10μg/mL(1x)に希釈し、フィルター滅菌します。</li>
		<li>12ウェル培養プレートを、1xポリD-リジンのウェルあたり0.5 mLで、室温で少なくとも1時間または翌日に使用するために一晩治療します。ポリD-リジンの体積が培養領域の底部を完全に覆うのに十分であることを確認してください。</li>
		<li>使用の直前に、培養プレートからポリD-リジンを取り除き、滅菌水で3倍すすいで、細胞をプレートする準備ができるまで滅菌水に入れます。めっき細胞の前に徹底的な吸引によって液体のすべての痕跡を除去する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ニューロン成長培地とFACSバッファを準備します。フィルターは滅菌し、使用するまで4°Cで保存します。ニューロン成長培地は約2 wksのために保つことができます。FACS バッファは約 4 wk のために保つことができます。</li>
</ol>2. 胚海馬の解剖
注:この手順は、海馬の髄液および微細解剖の除去のためのステレオ顕微鏡の使用を必要とするため、ベンチトップで行うことができます。潜在的な汚染を最小限に抑えるために厳格な無菌技術に従います。
<ol><li>CO2チャンバーの胚性18日目に、時を超えた妊娠C57BL/6Jメスマウスを安楽死させる。</li>
	<li>腹部の皮膚と毛皮に70%のEtOHをスプレーし、組織鉗子で皮膚をつまみ、外科用ハサミで小さな切開を行います。腹部を切開して内臓と子宮を露出させる。</li>
	<li>標準的なパターン鉗子で子宮をつかみ、空洞から持ち上げ、細かいはさみでメソムトリウムへの接続を切断します。胚を含む子宮を氷の上に置かれた100mmの無菌プラスチック培養皿に移す。</li>
	<li>細かいはさみと細かい鉗子を使用して、慎重に子宮を切断し、胚嚢を取り除いて胚を放出する。氷の上に置かれたdPBSを含む新しい100mmの無菌プラスチック培養皿に胚を移す。</li>
	<li>細かいはさみを使用して胚の子犬を切断し、氷の上に置かれたHibernate-E培地を含む新しい100mmの無菌プラスチック培養皿に頭を移す。</li>
	<li>脳を取り除くために、片手に細かい鉗子を持って頭を持つ。一方、湾曲したデュモン#7鉗子を使用して、頭蓋骨の基部に鉗子の先端を挿入し、脳を突き刺すことなく、正中線に沿って前に動く骨と上の皮膚をつまみます。</li>
	<li>湾曲した鉗子を使用すると、皮膚と頭蓋骨を引き離して脳を露出させます。露出した嗅球から小脳まで脳の下の湾曲した鉗子を掃いて、頭蓋骨から脳を持ち上げます。氷の上に置かれたHibernate-E培地を含む新しい100ミリメートルの無菌プラスチック培養皿に脳を移す。各脳について繰り返します。 注: 実験に特化した目的で別々にする必要がない限り、すべての脳を単一の培養皿に集めてもよい。</li>
	<li>ステレオ解剖顕微鏡の下で、一度に1つの脳と2組の無菌デュモン#5鉗子で働き、嗅球をつまんで髄を引き離します。髄液の徹底除去は、他の細胞による培養汚染を避け、さらなる解剖を可能にするために必要である。</li>
	<li>髄液が適切に除去されると、皮質の上側が横に開き、海馬を露出させる。デュモン#5鉗子を使用して、付属の皮質から海馬をつまみ、氷の上に5mLのHibernate-E培地を含む無菌15 mL円錐管に隔離された海馬を慎重に移す。</li>
	<li>各胚性マウスの子犬の両方の脳半球の解剖を繰り返し、実験固有の目的のために別々に必要でない限り、すべての海馬を単一の15 mL円錐形チューブに組み合わせる。<ol>
<li>皮質ニューロンを培養するために、皮質は皮質下皮質から分離され、海馬ニューロンと同じように処理され得る。 注: この時点で、プロトコルが一時停止する可能性があります。B27を補充したハイベルネートE培地の脳または解剖カバピを保存する(2%)4 °Cで最大1ヶ月間、延長遅延は生存細胞の数を損なう可能性がある。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 海馬ニューロンの解離と培養
注:すべての手順は、組織培養指定バイオセーフティキャビネットで無菌条件下で行われるべきです。
<ol><li>海馬解離のために胚当たり0.5mLのパパイン解離液を調製する。解離に必要な解離液の量は、解剖される胚脳の数によって異なります。 注:皮質ニューロン培養の場合、1胚あたり1.0 mLのパパイン溶液を調製してください。<ol>
<li>ハイバネートE培地の1mL当たり20μLのパパイン懸濁液を約3分間ボルテックスで溶解します。</li>
		<li>パパインが溶解した後、溶液の1 mLあたり1μLのDNase Iを加えます。これは酵素を失活させることができるので、DNase Iが添加された後に溶液を渦出しないでください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>遠心分離機15 mL海馬組織を含む円錐管(ステップ2.10)で1,000xgで5分間。 上清を取り除き、パパイン溶液を加えます。数回反転して組織を再中断します。37°Cで30分間インキュベートし、10分ごとに組織を再懸濁させる。<ol>
<li>皮質ニューロンを培養する場合は、すべての皮質を新しい100mm滅菌培養皿に移し、プレートから慎重に吸引し、細かいはさみやカミソリの刃を持つミンチ組織を作ります。培養皿にパパイン溶液を加え、無菌移動ピペットを用いて15 mL円錐管にパパイン溶液を用いて皮質組織を移管する。37°Cで30分間、組織と酵素溶液をインキュベートし、10分ごとに攪拌する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>30分間のインキュベーション中に、3つの火で磨かれたガラスのパスツールピペットを準備してください:1完全に開いて、1半分開いて、そして1四分の一開き。</li>
	<li>30分インキュベーション後、消化された脳組織を含む15 mL円錐管を10分間 125xg で遠心分離する。酵素溶液を取り除き、新鮮なハイベルネートE培地の等量に置き換えます。</li>
	<li>完全に開いたパスツールピペットを使用して、組織を10倍にトリチュレートする。組織を2分間落ち着かせ、その後、上清細胞懸濁液を滅菌50 mL円錐管に移します。同じ量の休止E培地を組織に追加します。</li>
	<li>半分開いたパスツールピペットを使用して、トリチュレート組織10x。組織を2分間落ち着かせ、上清細胞懸濁液を前工程と同じ50mL円錐管に移します。同じ量の休止E培地を組織に追加します。</li>
	<li>四半期オープンパスツールピペットを使用して、トリチュレート組織10x。組織を2分間落ち着かせ、上清細胞懸濁液を前のステップと同じ50 mL円錐形に再び移します。解ciaしていない残りの組織を捨てます。</li>
	<li>遠心分離機は、細胞懸濁液からの上清を含む50mLの円錐管を 125xg で5分間用いた。まだ行われていない場合は、滅菌水でポリD-リジンコーティングされたプレートを洗浄し、遠心分離中に徹底的な吸引によって液体のすべての痕跡を取り除きます。</li>
	<li>遠心分離後、上清を捨て、細胞ペレットをニューロン成長培地の5 mLで再懸濁します。トリパンブルーとヘモサイトメーターを使用して生細胞を数えます。<ol>
<li>皮質ニューロンを培養する場合, 少ない密度の細胞とより正確なカウントのためのニューロン成長培地の少なくとも 10 mL を追加.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ニューロン成長培地を用いた細胞を希釈し、1ml当たり5 x 105個の生存細胞の最終的なめっき密度を実現し、12ウェルプレートの各ウェルに希釈細胞懸濁液1mLを加えます。5%CO2で37°Cでニューロンを維持する。 注:典型的には、1胚マウス脳からの海馬、すなわち、2海馬は、約1 x 106 生存細胞を生み出す。この数値は実験計画目的でのみ提供され、各培養のセル数の代替と見なされるべきではありません。</li>
	<li>培養後の翌日に培養後の培地の半分を取り除き、すなわち0.5mL、培養細胞を破壊しないようにウェルの側面に等量の新鮮な培地を加えて培養した。文化の寿命に対して、週2回の半分のメディア変更を完了します。</li>
</ol>4. フローサイトメトリーによるMHCI発現の評価
<ol><li>インターフェロンβ(IFNβ)またはニューロン成長培地中の希釈剤の等量を希釈することによって治療を準備する。培地交換は半量変化となるため、2倍濃縮IFNβで処理培地を用意する。すなわち、12ウェルプレートの3つのウェルを100 U/mLのIFNβで処理し、培地処理コントロール用に200 U/mL IFNβまたは同量のIFNβと等量のIFNβを1.5mL調製する。</li>
	<li>ニューロンの各ウェルから0.5 mLを除去し、各ウェルにIFNβの有無にかかわらず、ニューロン成長培地の0.5 mLを追加します。実験条件およびシグナル最適化に応じて、通常の成長条件(37°C、5%CO2)で6-72時間インキュベートします。</li>
	<li>治療時間の後、すべての培養培地を取り除き、サプリメントを欠いた冷たい神経基底培地(B27、L-グルタミン、ペンストレップ)で1回静かに洗います。</li>
	<li>1 μg/mLのFcブロックを含む非補製の冷たいニューロ基底培地を0.5 mL、各ウェルに1μg/mLの蛍光共役抗MHCI抗体を加えます。4°Cで45分間光から保護。</li>
	<li>抗体含有培地を取り除き、冷たいdPBSで一度丁寧に洗浄してください。各ウェルに0.5 mLの室温酵素フリー細胞解離バッファーを加え、攪拌して細胞を取り除きます。逆組織培養顕微鏡を使用して解離を監視します。</li>
	<li>細胞が培養皿から切り離されたら、各ウェルに0.5mLのFACSバッファーを加え、細胞をトリチュレートして塊を分散させ、各ウェルの総体積を個々の1.7 mLマイクロ遠心分離管に移します。</li>
	<li>遠心分離機 1,000 x g 5分間上清を取り除き、FACSバッファーの100 μLで細胞ペレットを再懸濁し、各チューブの総体積を96ウェルUボトムプレートの個々のウェルに移します。</li>
	<li>各ウェルに100μLの固定化試薬を加えます。細胞が凝集するのを避けるために数回トリチュレートし、光から保護された室温で15分間インキュベートします。</li>
	<li>500 x g で 5 分間の遠心分離機。上清を取り外し、FACSバッファの200 μlで再中断します。</li>
	<li>500 x g で 5 分間の遠心分離機。上清を取り除き、蛍光共役抗NeuN抗体(1:100希釈)を各ウェルに含むパーメアビライズ試薬を100μLで再懸濁します。よく混ぜ、光から保護された室温で20分間揺れ動きます。</li>
	<li>インキュベーション後、500xgで5分間遠心分離機を使用する。上清を取り外し、FACSバッファの100 μLで再中断します。2x を繰り返します。</li>
	<li>最終洗浄後、FACSバッファーで希釈した2%パラホルムアルデヒドの100 μLで細胞を再懸濁します。細胞が凝集するのを防ぐためによく混ぜます。フローサイトメーターで読み取る準備ができるまで、光から保護された4°Cで保管してください。1週間以内に、できるだけ早くサンプルを読んでください。</li>
</ol>5. データの定量化と評価
<ol><li>各蛍光色素の補償制御を測定し、スペクトルの重複を補正します。理想的な補償制御には、染色されていない培養ニューロン、抗MHCIのみで染色され、抗NeuNのみで染色されたニューロンが含まれます。</li>
	<li>可能であれば、各サンプル (少なくとも 10,000) に対して 100,000 個のイベントを記録し、FCS ファイルとして保存します。</li>
	<li>適切な解析ソフトウェアを使用してデータを分析するには、 図1A-C に示すように、NeuN-陽性ニューロンを選択するシーケンシャルゲートを設定します。<ol>
<li>SSC-A (ログ) と FSC-A (線形) をプロットします。細胞集団(P1)にゲートを描画し、細胞の破片を分析から排除します。</li>
		<li>P1細胞集団内で、FSC-H(線形)対FSC-A(線形)をプロットします。単一セルの母集団にゲートを描画します。</li>
		<li>単一セルの母集団内で、SSC-A (ログ) と NeuN (ログ) をプロットします。NeuN陽性集団に、染色されていない細胞またはMHCIのみの染色された細胞をガイドとして使用してゲートを描画します。</li>
		<li>Y軸上でモードに正規化された細胞イベントを用いてMHCI蛍光のヒストグラムをプロットする。染色されていないまたはNeuNのみの染色されたニューロンをガイドとして使用して、水平ゲートを描き、MHCIに陽性のニューロンパーセントを定量化する。</li>
		<li>統計評価およびグラフ描画のために、MHCIに陽性のパーセント細胞と、NeuN陽性集団のMHCIの蛍光強度の中央値(MFI)をエクスポートします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Galea, I., Bechmann, I., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+immune+privilege+(not).">What is immune privilege (not).</a> Trends in Immunology. 28 (1), 12-18 (2007).</li><li>Morimoto, K., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Immune+System+in+the+Development+of+the+Central+Nervous+System.">Role of the Immune System in the Development of the Central Nervous System.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 916 (2019).</li><li>Klein, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+During+RNA+Viral+Infections.">Neuroinflammation During RNA Viral Infections.</a> Annual Review of Immunology. 37, 73-95 (2019).</li><li>Janeway, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T+cell+receptor+as+a+multicomponent+signalling+machine:+CD4/CD8+coreceptors+and+CD45+in+T+cell+activation.">The T cell receptor as a multicomponent signalling machine: CD4/CD8 coreceptors and CD45 in T cell activation.</a> Annual Review of Immunology. 10, 645-674 (1992).</li><li>Peaper, D. R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+MHC+class+I+assembly+and+peptide+binding.">Regulation of MHC class I assembly and peptide binding.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 24, 343-368 (2008).</li><li>Donaldson, J. G., Williams, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Assembly+and+Trafficking+of+MHC+Class+I+Molecules.">Intracellular Assembly and Trafficking of MHC Class I Molecules.</a> Traffic. 10 (12), 1745-1752 (2009).</li><li>Charles, A., Janeway, J., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell-mediated+cytotoxicity.">T cell-mediated cytotoxicity.</a> Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition. , (2001).</li><li>Guidotti, L. G., Chisari, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncytolytic+control+of+viral+infections+by+the+innate+and+adaptive+immune+response.">Noncytolytic control of viral infections by the innate and adaptive immune response.</a> Annual Review of Immunology. 19, 65-91 (2001).</li><li>Chevalier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+are+MHC+class+I-dependent+targets+for+CD8+T+cells+upon+neurotropic+viral+infection.">Neurons are MHC class I-dependent targets for CD8 T cells upon neurotropic viral infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (11), 1002393 (2011).</li><li>Shrestha, B., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CD8++T+Cells+in+Control+of+West+Nile+Virus+Infection.">Role of CD8+ T Cells in Control of West Nile Virus Infection.</a> Journal of Virology. 78 (15), 8312-8321 (2004).</li><li>Plaisted, W. C., Weinger, J. G., Walsh, C. M., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+mediated+suppression+of+neurotropic+coronavirus+replication+in+neural+precursor+cells.">T cell mediated suppression of neurotropic coronavirus replication in neural precursor cells.</a> Virology. 449, 235-243 (2014).</li><li>Marten, N. W., Stohlman, S. A., Zhou, J., Bergmann, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+virus-specific+CD8++-T-cell+expansion+and+trafficking+following+central+nervous+system+infection.">Kinetics of virus-specific CD8+ -T-cell expansion and trafficking following central nervous system infection.</a> Journal of Virology. 77 (4), 2775-2778 (2003).</li><li>Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+I:+an+unexpected+role+in+neuronal+plasticity.">MHC class I: an unexpected role in neuronal plasticity.</a> Neuron. 64 (1), 40-45 (2009).</li><li>Corriveau, R. A., Huh, G. S., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+class+I+MHC+gene+expression+in+the+developing+and+mature+CNS+by+neural+activity.">Regulation of class I MHC gene expression in the developing and mature CNS by neural activity.</a> Neuron. 21 (3), 505-520 (1998).</li><li>Goddard, C. A., Butts, D. A., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CNS+synapses+by+neuronal+MHC+class+I.">Regulation of CNS synapses by neuronal MHC class I.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (16), 6828-6833 (2007).</li><li>Needleman, L. A., Liu, X. B., El-Sabeawy, F., Jones, E. G., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+I+molecules+are+present+both+pre-+and+postsynaptically+in+the+visual+cortex+during+postnatal+development+and+in+adulthood.">MHC class I molecules are present both pre- and postsynaptically in the visual cortex during postnatal development and in adulthood.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (39), 16999-17004 (2010).</li><li>Syken, J., Grandpre, T., Kanold, P. O., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PirB+restricts+ocular-dominance+plasticity+in+visual+cortex.">PirB restricts ocular-dominance plasticity in visual cortex.</a> Science. 313 (5794), 1795-1800 (2006).</li><li>Atwal, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PirB+is+a+functional+receptor+for+myelin+inhibitors+of+axonal+regeneration.">PirB is a functional receptor for myelin inhibitors of axonal regeneration.</a> Science. 322 (5903), 967-970 (2008).</li><li>Takai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+immunoglobulin-like+receptors+and+their+MHC+class+I+recognition.">Paired immunoglobulin-like receptors and their MHC class I recognition.</a> Immunology. 115 (4), 433-440 (2005).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+elimination+and+learning+rules+co-regulated+by+MHC+class+I+H2-Db.">Synapse elimination and learning rules co-regulated by MHC class I H2-Db.</a> Nature. 509 (7499), 195-200 (2014).</li><li>Ribic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+regulation+of+MHC+class+I+expression+in+the+developing+primary+visual+cortex+of+the+common+marmoset+monkey.">Activity-dependent regulation of MHC class I expression in the developing primary visual cortex of the common marmoset monkey.</a> Behavioral and Brain Functions. 7, 1 (2011).</li><li>Sahu, M. P., Nikkil&#228;, O., L&#229;gas, S., Kolehmainen, S., Castr&#233;n, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+primary+neurons+from+rat+hippocampus+and+cortex.">Culturing primary neurons from rat hippocampus and cortex.</a> Neuronal Signaling. 3 (2), (2019).</li><li>Gordon, J., Amini, S., White, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+overview+of+neuronal+cell+culture.">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).</li><li>Zhang, X., Hu, D., Shang, Y., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+induced+pluripotent+stem+cell+neuronal+models+to+study+neurodegenerative+diseases.">Using induced pluripotent stem cell neuronal models to study neurodegenerative diseases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1866 (4), 165431 (2020).</li><li>Berry, B. J., Smith, A. S. T., Young, J. E., Mack, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+Current+Challenges+Associated+with+the+Use+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Modeling+Neurodegenerative+Disease.">Advances and Current Challenges Associated with the Use of Human Induced Pluripotent Stem Cells in Modeling Neurodegenerative Disease.</a> Cells, Tissues, Organs. 205 (5-6), 331-349 (2018).</li><li>Ho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Single-Cell+Transcriptomics+in+Adult+Rodent+Brain:+The+Medium+Spiny+Neuron+Transcriptome+Revisited.">A Guide to Single-Cell Transcriptomics in Adult Rodent Brain: The Medium Spiny Neuron Transcriptome Revisited.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 159 (2018).</li><li>Panchision, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Flow+Cytometric+Analysis+of+Central+Nervous+System+Tissue+Reveals+Novel+Functional+Relationships+Among+Cells+Expressing+CD133,+CD15,+and+CD24.">Optimized Flow Cytometric Analysis of Central Nervous System Tissue Reveals Novel Functional Relationships Among Cells Expressing CD133, CD15, and CD24.</a> Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).</li><li>Snaidero, N., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+at+a+glance.">Myelination at a glance.</a> Journal of Cell Science. 127 (14), 2999-3004 (2014).</li><li>Martin, D., Xu, J., Porretta, C., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurocytometry:+Flow+Cytometric+Sorting+of+Specific+Neuronal+Populations+from+Human+and+Rodent+Brain.">Neurocytometry: Flow Cytometric Sorting of Specific Neuronal Populations from Human and Rodent Brain.</a> ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 356-367 (2017).</li><li>Lv, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+MHC+Class+I+Expression+Is+Regulated+by+Activity+Driven+Calcium+Signaling.">Neuronal MHC Class I Expression Is Regulated by Activity Driven Calcium Signaling.</a> PLoS One. 10 (8), 0135223 (2015).</li><li>Barco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+facilitated+L-LTP+in+VP16-CREB+mice+reveals+that+BDNF+is+critical+for+the+maintenance+of+LTP+and+its+synaptic+capture.">Gene expression profiling of facilitated L-LTP in VP16-CREB mice reveals that BDNF is critical for the maintenance of LTP and its synaptic capture.</a> Neuron. 48 (1), 123-137 (2005).</li><li>Glynn, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHCI+negatively+regulates+synapse+density+during+the+establishment+of+cortical+connections.">MHCI negatively regulates synapse density during the establishment of cortical connections.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 442-451 (2011).</li><li>Facci, L., Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Rodent+Cortical,+Hippocampal,+and+Striatal+Neurons.">Culture of Rodent Cortical, Hippocampal, and Striatal Neurons.</a> Methods Molecular Biology. 1727, 39-47 (2018).</li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルは、胚性18日目の出生前マウスの子犬からの主要な海馬ニューロンの解剖および培養を記述する。げっ歯類から培養された主要なニューロンの使用は、現代の神経生物学22で開発された最も基本的な方法論の1つである。不死化細胞株はニューロンの特定の側面をモデル化することができるが、腫瘍由来細胞としての性質、定義された軸索を発達させなかったこと、および細胞分裂を継続することは、生体内23における非実在性ニューロンの特性を忠実に再現するかどうか疑問を提起する。一次ニューロンに代わるもう一つの選択肢は、ヒト誘導多能性幹細胞(HiPSC)の使用である。HiPSCを使用する技術、特に患者由来の技術は、近年急速に進歩しています24.しかしながら、細胞株間の変動性、機能的成熟度の欠如、エピジェネティックプロファイル25の違いなど、HiPSCの取り扱いにはまだ限界がある。一次げっ歯類ニューロンの還元モデルを扱うには制限もありますが、培養ニューロンは生体内のニューロンのポストミトティックな性質を保持します。また、マウスに利用可能な広範な分子生物学ツールと遺伝子組み換えは、多くの用途でHiPSCよりも主要なニューロンの使用を好み、マウス研究は実験的な遺伝的システムを失うことなく、より複雑な生体内生物に簡単に翻訳することができます。これらの理由から, 多くの研究者は、主要なげっ歯類のニューロンを使用して、 主要な側面を検証します, ない場合は、バルク, 彼らの研究の.
あるアッセイの場合、ニューロンは脳ex vivoからの分離に続いて直接分析され得る。 これは特に、特定の実験条件に従うことができる、または複数の細胞タイプの相互作用に依存する可能性のある成体マウスを含む実験に対して望ましい。ただし、実行できる分析の種類を制限するいくつかの問題があります。ニューロンは一意に相互接続され、ミエリン26によって包まれているため、成体マウスの脳からニューロンの単一の細胞懸濁液を準備することは技術的に困難です。組織トリアーションの非酵素的方法は、組織を解離して細胞死を引き起こす際には非効率的であり、一方、酵素製剤はしばしば細胞表面抗原27を切断する。さらに、ミエリンは、胚性マウスからはほとんど存在しないが、それは、成人の脳の約20%を含み、そして生細胞の分離および妨げる流れのサイトメトリー分析28を損なう可能性がある。開発された技術の多くは、最終的に細胞質のニューロンを取り除き、主に核29からなる小さな丸みを帯びた細胞体を残す。これは一部の分析では許容されますが、細胞質や細胞外タンパク質の発現を定量化するには適していません。さらに、還元細胞培養システムは、in vivoシステムで頻繁に可能であるよりも短い時間スケールで特定の機械学的な質問をテストすることができます。
また、このプロトコルでは、IFNβを用いてMHCI発現を薬理学的に刺激する方法、およびフローサイトメトリーによる細胞外MHCI発現の定量化を行う方法も記載されている。IFNβによる刺激は、他の実験条件をテストするのに有用な陽性対照であるが、IFNγおよびカイエン酸はまた、ニューロン9、30においてMHCI発現を刺激し得る一方で、テトロドトキシンはMHCI発現14を減少させることにも留意することができる。MHCI発現を検出するための以前の方法は、その場合のハイブリダイゼーションおよび免疫ヒストリシス分析14、15、20、31に依存していた。mRNAベースのアッセイは、その場合のハイブリダイゼーションやqRT-PCRなど、時空間的局在、細胞型特異性、遺伝子転写レベルを決定できますが、これらのアッセイではタンパク質翻訳や原形質膜への輸送を評価することはできません。免疫組織化学およびウェスタンブロット分析は、タンパク質発現の違いおよび潜在的に細胞の局在化を決定できますが、正確に定量することは困難です。さらに、多くのMHCI抗体は複合体の三次構造を認識し、立体構造変化に対して非常に敏感である。このようにパーメアビライゼーションまたは変性状態は、MHCI免疫反応性32の損失をもたらす。ここで示す方法は、MHCIのsitu免疫染色で使用され、抗体を天然の立体構造で認識させ、続いて固定およびパーメアビライゼーション法を使用します。
わずかな変更を用いて、ここで説明する方法は、他の神経集団を培養したり、関心のある他の細胞外タンパク質の発現を評価するために使用することができる。このプロトコルで注目される、皮質ニューロンを培養するために行うことができる簡単な変更であるが、ここで説明する方法はまた、線条体ニューロン33のような他の神経集団を培養するために使用されてもよい。さらに、このプロトコルはMHCIおよびNeuNの免疫染色を規定しているが、他の細胞マーカーも同様の方法で同定することができる。一般に、細胞外マーカーはMHCIおよび細胞内マーカーのように扱うことができるが、NeuNのように扱うことができる。しかし、細胞解離工程中に、軸索突起はソーマから切断される。ここで定義された格子戦略は、細胞の破片を選別し、神経核マーカーNeuNに焦点を当てているため、軸索突起で排他的に発現されるタンパク質は検出されない可能性があります。
最近まで、ニューロンは、細胞傷害性CD8+T 細胞9に従事するために損傷、感染、またはインビトロサイトカイン刺激に応答するだけでMHCIを発現すると考えられていた。新しい研究は、開発中にシナプス接続を調節する際にMHCIの別の機能を解明しました13.ここで説明するプロトコルは、野生型培養ニューロンにおけるMHCI発現を刺激するためにIFNβを使用するが、同様の方法は、特定の仮説をテストするために様々な細胞刺激または遺伝子修飾と共に使用され得る。この方法により、研究者はMHCI発現を調節する分子メカニズムを研究し、これら2つの異なる細胞機能におけるMHCIの二分の役割の理解を深める。

中枢神経系(CNS)はかつて「免疫特権1」と呼ばれる免疫監視を欠いていると考えられていた。この特権は免疫成分の絶対的な欠如に相当するのではなく、免疫病理学に関連する損傷を制限する特殊な規制を意味することが明らかである。実際、CNSと免疫系との間のコミュニケーションは、健康な脳の発達と感染症への応答のために必要な継続的な会話である2,3。
主要な組織適合性複合体クラスI(MHCI)分子は、感染時にCD8+T細胞に抗原ペプチドを提示する機能について最もよく知られている多形および多形の膜貫通タンパク質である4。従来のMHCI複合体は、膜貫通α鎖とβ2マイクログロブリンと呼ばれる細胞外軽鎖から構成されています。α鎖は、プレゼンテーション5のために抗原ペプチドを結合する多形の溝を含む。細胞外膜上でのMHCIの適切な発現は、高親和性ペプチドリガンド5のローディングと共にα鎖およびβ2-ミクログロブリンの適切な折り畳みを確保するために、小胞体における分子シャペロンの協調作用を必要とする。MHCI複合体が組み立てられるのは一度だけ、小胞体から形質膜6にエクスポートされる。ペプチドを含んだMHCI複合体を伴う同結合性T細胞受容体の関与の際、CD8+T細胞は、パーフォリンおよび顆粒体を含むリティック顆粒を放出することによって細胞殺死を仲介するか、または標的細胞膜7上のFas受容体を結合することによってアポトーシスを誘導する。さらに、CD8+T細胞は、ガンマインターフェロン(IFNγ)や腫瘍壊死因子α(TNFα)などのサイトカインを産生し、細胞変性作用を伴わない感染細胞における抗ウイルス機構を活性化することができる8,9。多くの神経刺激性ウイルスの場合、CD8+ T細胞はCNS10、11、12から感染をクリアする必要があります。
ニューロンは、損傷、ウイルス感染、またはインビトロサイトカイン刺激の条件下でのみMHCIを発現すると以前考えられていた。近年、研究はシナプスリモデリングおよび可塑性13,14におけるMHCIの神経発現に対する役割を同定した。シナプス調節の基礎となる正確なメカニズムはよく理解されていないが、データはMHCI発現レベルがシナプス活性15、16によって調節されることを示す。一つの仮説は、ニューロンが対の免疫グロブリン様受容体B(PirB)を予離的に発現することを示唆し、これはMHCIを経経的に結合する13,17である。この相互作用は、シナプスリモデリングに関与する経路に反対するPirBによるシグナル伝達カスケードを開始し、シナプス接続17、18、19を強化および安定化させる。神経活性がない場合、MHCI発現は14減少し、MHCIの消失はシナプスの消失不良と誤ったシナプス回路20,21をもたらす。
ここで説明したアッセイは、シュヴァリエら9から適応したもので、フローサイトメトリック分析を用いて、マウス海馬ニューロンの一次培養物に対するMHCIの細胞外タンパク質発現を定量的に評価する。このプロトコルは、胚性マウスの子犬から海馬組織をマイクロディスセクトするための初期技術を示している。次に、組織を単一細胞懸濁液に酵素的および機械的に解離するプロセスと、培養をインビトロで維持するための方法について詳述する。 分裂しないため、培養後、ニューロンは実験エンドポイントに適した皿と密度にメッキする必要があります。次に、βインターフェロン(IFNβ)によるMHCI発現を誘導するステップ、MHCIおよび神経核マーカーNeuNの免疫標識、およびフローサイトメトリーによる細胞の分析を行うためのステップを概説する。最後に、MHCI陽性ニューロンを同定し、MHCI発現のレベルを定量化するためのフローサイトメトリーデータを評価する手順について説明する。また、このプロトコルで注目されているのは、海馬ニューロンに加えて、または代わりに皮質ニューロンを培養するために行うことができる小さな調整である。このプロトコルは、遺伝的変異または薬理学的治療を用いて特定の仮説をテストするために容易に変更することができる。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm sterile culture dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB012924</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge Tubes</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>21-103</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>21-108</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>FACS Buffer Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP82031Gal</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom plate</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-221</td>
			<td>Flow Cytometry Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borate Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28341</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Pasteur Pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13 678 20C</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Dissociation Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13 151 014</td>
			<td>Flow Cytometry Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>90083</td>
			<td>Dissociation Solution Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-235</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91113-10</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fix and Perm Cell Permeabilization Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>GAS003</td>
			<td>Flow Cytometry Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate-E Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1247601</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Sealing Sterilization Pouches</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>181254</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon Beta</td>
			<td>PBL Assay Science</td>
			<td>12405-1</td>
			<td>Flow Cytometry Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Mark Anti-NeuN-PE Antibody, clone A60</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>FCMAB317PE</td>
			<td>Flow Cytometry Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse H-2Kb Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116513</td>
			<td>Flow Cytometry Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Solution</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>Dissociation Solution Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Pattern Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91100-12</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo dissection microscope</td>
			<td>Swift</td>
			<td>M29TZ-SM99CL-BTW1</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91401-10</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipets</td>
			<td>Corning</td>
			<td>357575</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101319</td>
			<td>Flow Cytometry Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the expression of major histocompatibility complex class i on primary murine hippocampal neurons by flow cytometry

増加する証拠は、神経免疫相互作用がホメオスタティックおよび病理状態の神経系機能に影響を与えるという仮説を裏付ける。主要な組織適合性複合体クラスI(MHCI)の十分に研究された機能は、特に感染に応答して、適応免疫系への細胞由来ペプチドの提示である。最近では、ニューロン上のMHCI分子の発現が、正常な発達および神経障害の間のシナプス結合性における活性依存性の変化を調節できることが示されている。脳の健康にこれらの機能の重要性は、ニューロンのMHCI発現を容易に検出する高感度アッセイの必要性をサポートしています。ここでは、マウス海馬ニューロンの一次培養法と、フローサイトメトリック解析によるMHCI発現評価の方法について説明する。マウス海馬は、胚性18日目に出生前マウスの子犬から微小化される。組織は、酵素的および機械的手法を用いて単一細胞懸濁液に解離され、次いで非神経細胞の増殖を制限する無血清培地で培養される。インビトロで7日後、MHCI発現は、βインターフェロンで薬理学的に培養細胞を処理することによって刺激される。MHCI分子は蛍光タグ付き抗体をその時に標識し、次いで細胞が非酵素的に単一細胞懸濁液に解離される。神経細胞の同一性を確認するために、細胞はパラホルムアルデヒドで固定され、透過し、ニューロン核抗原NeuNを認識する蛍光タグ付き抗体で標識されます。MHCI発現は、次いで、フローサイトメトリック解析によってニューロン上で定量化される。神経細胞培養は、特定の仮説をテストするための遺伝子組み換えまたは薬理学的介入によって容易に操作することができる。わずかな変更を加えれば、これらの方法は、他の神経集団を培養したり、関心のある他のタンパク質の発現を評価するために使用することができる。

ここで提示された手順を用いて、海馬組織は胚18日目に出生前マウスの子犬から解剖された。組織を酵素的および機械的方法を用いて単一細胞懸濁液に解光し、次いでポリD-リジンで前処理した12のウェルプレートで培養した。インビトロで7日後、細胞は、MHCIの発現を刺激した72時間だけ、IFNβまたは培地の100 U/mLで処理した。ニューロンは、単一の細胞懸濁液に非酵素的に解離される前に、MHCIのSituに染色された。ニューロンを固定し、透過し、次にニューロン核マーカーNeuNについて細胞内染色した。サンプルをフローサイトメトリーで評価し、関連ソフトウェアを用いてデータを分析した。ニューロンは、細胞の破片およびダブレットを除外する全事象の逐次的な格言によって同定された(図1A,B)。ニューロンはNeuN陽性によって決定的に同定された(図1C)。NeuN+細胞は、Y軸上のモードに正規化された細胞数とX軸上のMHCI蛍光を用いてヒストグラム上の細胞をプロットすることによって、MHCI陽性性についてさらに分析した。正と負のピークが発散する点でMHCI+ゲートが描画されました (図 1D)。このことから、MHCI染色に陽性のニューロンパーセント(図1E)および中央値蛍光強度(MFI;図1F)が計算された。結果は、MFIが示すように、IFNβ治療がMHCIの細胞外染色に陽性のニューロンの割合と発現レベルを有意に上方制御したことを示している。統計分析とグラフィカル表現は、市販の統計ソフトウェアを使用して行われました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61436/61436fig1v2.jpg"> 図1:代表的な格言戦略とMHCI定量化。 一次海馬ニューロンは、IFNβまたは培地のみの100 U/mLで治療した。72時間後、ニューロンは太平洋ブルー共役MHCI(1μg/mL H2-Kb)で細胞外染色され、次いでPE共役NeuN(1:100希釈)で細胞内標識した。細胞蛍光をフローサイトメトリーで評価し、データを分析した。(A)合計事象はSSC-A(対FSC-A)対FSC-A(線形)としてプロットされ、細胞(P1)は破片を除外するためにゲートされた。(B) P1集団内で、細胞をFSC-H(線形)対FSC-A(線形)としてプロットし、単一細胞集団をゲートした。(C) 単一細胞母集団内で、セルを NeuN-PE (ログ) に対して SSC-A (ログ) にプロットした。NeuN+細胞は、ニューロンを同定するためにゲート付けされた。(D) ニューロンの集団の中で、細胞をx軸上にMHCI-PacBluを持つヒストグラムにプロットし、y軸上で細胞番号をモードに正規化した。MHCI染色に陽性のニューロンの割合を定量化するために水平ゲートを描いた。(E) 培地中のNeuN+細胞のMHCI+パーセントの定量化およびIFNβ処理ニューロンのみ。(F)培地中のNeuN+細胞に対するMHCIの蛍光強度の中央値(MFI)の定量化(黒)およびIFNβ処理(赤)ニューロン。統計的有意性は、非対t検定によって計算された。**,P < 0.01.<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61436/61436fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">ニューロン成長培地 (50 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>最終濃度</td>
			<td>ストック濃度</td>
			<td>50mlの場合</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27 サプリメント</td>
			<td>2%</td>
			<td>100%</td>
			<td>1.0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-グルタミン</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>200 mM</td>
			<td>0.5 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>ペニシリンストレプトマイシン</td>
			<td>100 U/ml</td>
			<td>10,000 U/ml</td>
			<td>0.5 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>神経基底培地</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>48.0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">FACS バッファー (500 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>最終濃度</td>
			<td>ストック濃度</td>
			<td>500mlの場合</td>
		</tr>
<tr>
<td>胎児牛血清</td>
			<td>2%</td>
			<td>100%</td>
			<td>10ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>エドタ</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>500 mM</td>
			<td>1ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>dPBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>489 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">パパイン解離解液</td>
		</tr>
<tr>
<td>試薬</td>
			<td>最終濃度</td>
			<td>ストック濃度</td>
			<td>1mlの場合</td>
		</tr>
<tr>
<td>パパインサスペンション</td>
			<td>20 U/ml</td>
			<td>1000 U/ml</td>
			<td>0.020 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNase I</td>
			<td>2.5 U/ml</td>
			<td>2500 U/ml</td>
			<td>0.001 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>ハイバーネート-E</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1.0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">注:パパイン解離解液の必要量は、解剖される胚脳の数によって異なります。海馬ニューロンの脳あたり0.5 ml、皮質ニューロンの脳あたり1.0 mlを準備します。</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">注:Hibernate-Eで約3分間、パパイン懸濁液をボルテックスして解離液を調製してください。パパインが完全に溶解した後、DNase Iを加えます。渦を起じないでください。</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:メディアとソリューション

Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry at JoVE.com

Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

このプロトコルは、胚性マウス脳から一次海馬ニューロンを培養する方法を説明する。培養ニューロンの細胞外表面上の主要な組織適合性複合体クラスIの発現は、次いでフローサイトメトリック解析によって評価される。

フローサイトメトリーによる主要なマウス海馬ニューロンの主要組織適合性複合体クラスIの発現の評価

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A ...

assessing-expression-major-histocompatibility-complex-class-i-on

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.3K ビュー.  University of North Carolina at Charlotte. このプロトコルは、胚性マウス脳から一次海馬ニューロンを培養する方法を説明する。培養ニューロンの細胞外表面上の主要な組織適合性複合体クラスIの発現は、次いでフローサイトメトリック解析によって評価される。

ビデオ: Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

マウス大動脈内の免疫細胞のフローサイトメトリー分析

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

免疫・感染学

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

ヒトのインビトロ</em免疫バランスの初期状態の認識のためのスクリーニングツールとして>抑制

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

フローサイトメトリーによる一次免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子の相互作用を検出

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

主要組織適合遺伝子複合体クラスII Dextramersを用いて脳および心臓において自己反応性CD4 T細胞のその場検出に

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

マウスの骨髄から形質細胞様樹状細胞の精製のために、蛍光活性化細胞選別

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

網膜ミクログリアの貪食機能を評価します<em&gt;インビボ</em&gt;フローサイトメトリーベースのアッセイを使用しました

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

蛍光ベースのノイラミニダーゼ阻害アッセイ抗ウイルスのノイラミニダーゼ阻害剤クラスにインフルエンザウイルスの感受性を評価します

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

全血によって人間の Monocyte のサブセットの解析フローのフローサイトメトリー解析

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and tumor development. The hybrid MHC I complexed with heterologous &#946;2-microglobulin (&#946;2m) substitution from different species can be stabilized in vitro. This is a feasible means to study MHC I of mammals, when the homologous &#946;2m is not available. Meanwhile, it is indicated that mammalian &#946;2m substitution does not significantly affect peptide presentation. However, there is limited summarization regarding the methodology and the technology for the hybrid MHC I complexed with heterologous &#946;2-microglobulin (&#946;2m). Herein, methods to evaluate the feasibility of heterologous &#946;2m substitution in MHC I study are presented. These methods include preparation of expression constructs; purification of inclusion bodies and refolding of the MHC complex; determination of protein thermostability; crystal screening and structure determination. This study provides a recommendation for understanding function and structure of MHC I, and is also significant for T cell response evaluation during infectious disease and tumor immunotherapy.

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &#946;2-Microglobulin

The protocol describes experimental methods to obtain stable major histocompatibility complex (MHC) class I through potential &#946;2-microglobulin (&#946;2m) substitutions from different species. The structural comparison of MHC I stabilized by homologous and heterologous &#946;2m were investigated.

異種β 2-ミクログロブリンを有するコウモリ主要組織適合性複合体クラスIの安定性と構造

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

フローサイトメトリーによる主要なマウス海馬ニューロンの主要組織適合性複合体クラスIの発現の評価

要約

さらに動画を探す