このプロトコルは、二本鎖DNA切断をもたらす任意のプロセスに適用することができ、キネティクスに関する詳細な定量データを生成します。この方法は単一分子分解能を有するが、1回の実験で最大1000個のDNAを測定し、良好な統計を提供する。この方法の主な応用は、DNA結合および修飾に関与するメカニズムを研究することにある。
例えば、DNA結合タンパク質に関連するDNA標的探索の研究に興味があります。この技術を初めて試みる際には、単一分子テザーは繊細であり、一度形成されると、注意して処理しなければならないことを覚えておいてください。機能面の適切な割合が不可欠です。
流れを作るためのいくつかのトリックがあります。データ収集中にサンプルチューブを切り替えるだけでなく、この手順に新しい人を助けることができます。カバースリップを洗う場合は、瓶を染色し、エタノールで30分間超音波処理します。
脱イオンして蒸留した水で徹底的に洗い流し、水酸化モルカリウム1個に浸し、さらに30分間超音波処理します。洗浄シーケンスを繰り返し、各洗浄後にカバースリップを水で洗い流します。洗浄したカバースリップを水で汚す瓶に保管してください。
きれいなカミソリを使用して、長さ8センチメートルのロードと出口チューブをカットし、きれいなガラススライドの穴に挿入します。エポキシチューブを使用し、それを確保するために5分間硬化させます。ガラススライドにチャネルパターンで両面テーププレカットを適用し、良好なシールを達成するためにプラスチック製の鉗子でそれを滑らかにします。
テープから裏地を剥がし、きれいなカバースリップを適用し、鉗子で滑らかにします。次いで、カバースリップのエッジをエポキシしてフローセルを密封し、硬化させる。原稿の指示に従ってPCRを行うことにより、テザリング用に標識DNAを調製します。
次に、PCR のクリーンアップ キットで PCR 製品を精製します。バッファーAの10ミリリットルを調製し、少なくとも1時間真空デシケーターで脱ガスします。フローセルを機能化するには、25マイクロリットルの抗ジゴキシゲニンおよびファブフラグメントをPBSに注入し、フローチャネルに、PE60チューブに収まるゲルローディングチップを使用します。
室温で30分間、フローセルをインキュベートします。インキュベーション後、0.5ミリリットルのバッファーAを注射器でチャネルを通して引き、チャネルに空気を導入しないように注意する。次いで、逆顕微鏡上のフローセルを山に山。
出口管をシリンジポンプに引っ掛け、注入管をバッファAを含むマイクロ遠心分離管に入れ込みます。次に、ポンプを1分間に10マイクロリットルで少なくとも5分間稼働させ、システムを平衡化します。ビーズのストックボトルをボルテックスし、ビーズのピペット1.6マイクロリットルを50マイクロリットルのバッファAに入れ、再び渦を出します。
ビーズを磁気セパレータに置き、ピペットをバッファーから外します。バッファーAの50マイクロリットルでそれらを再中断し、それらを渦。最後の洗浄後、1ミリリットル当たり160マイクログラムの最終濃度のために、100マイクロリットルのバッファーAでビーズを再中断します。
480マイクロリットルの0.5ピコモラー標識DNA基質を緩衝液Aに調製し、ピペット20マイクロリットルのビーズ懸濁液を希釈DNAに調製する。混合物を回転器に3分間置きます。3分後、1分間に10マイクロリットルの流量ですぐに試料をチャネルにロードし、または十分なビーズテザリングが観察されるまで観察される。
入口チューブをバッファーAの新鮮なチューブに切り替え、少なくとも10分間または緩いビーズが観察されないまで毎分50マイクロリットルで流すことによって、すべてのフリービーズのチャネルを洗浄します。また、インラインバルブを使用して流れを遮断し、チューブを切り替えると便利です。1つの滑らかな動きでチューブを切り替え、逆流を避けるために、新旧のサンプルチューブの液体レベルが一致することを確認します。
データを収集する前に、DNA切断酵素の正しい濃度を準備し、サンプルに入口チューブを挿入します。フローセルの上に磁石を下げます。1分間に150マイクロリットルで80マイクロリットルのサンプルを注入するようにポンプをセットし、データ収集を開始します。
データ収集に1分、ポンプをアクティブにします。ここに示されているのは、反応の前後のテザービーズの代表的な画像です。データ分析を行い、切断反応全体を通してつながれたビーズの数を定量化した。
この技術は、1ミリリットル当たり0.25〜4単位、および2つの異なるマグネシウム濃度のタンパク質濃度に対するNde1の部位特異的DNA切断率を測定するために使用された。各条件は少なくとも2回複製され、数100〜1000のテザーDNAは実験ごとに行われた。十分に低いタンパク質濃度では、速度はタンパク質に比例し、マグネシウムから独立しています。
高タンパク質濃度の場合、速度はマグネシウムに依存しますが、タンパク質濃度に依存しません。このプロトコルを試す場合、チューブおよびフロー チャネルの気泡で実験を実行できることに注意してください。チューブを切り替える間はラインに空気を入れないようにし、使用する前にすべてのバッファを脱気してください。
テザリング法は、反応に対するDNAの緊張の影響を探索することを可能にする。これは、磁石の強度を変化させるか、データ収集中に流れを適用することによって達成することができます。
