pMCS-AAT_PB-PGKpuroTKおよびpCMV-hyPBaseプラスミドを共有してくださった遊佐浩介に感謝します。ゲノム編集に関する有益な議論をしてくれたJia-Yin Yang氏とKaramjit Singh-Dolt氏に感謝します。D.C.H.ラボは、チーフサイエンティストオフィス(TC/16/37)および英国再生医療プラットフォーム(MR/L022974/1)からの賞によってサポートされています。Y.W.は、中国奨学金評議会とエジンバラ大学が資金提供する博士課程の奨学金によって支援されました。

1. CRISPR/Cas9n-sgRNA発現プラスミドの設計と構築
<ol><li>改変部位付近の5'-NGGのすぐ上流にある20 bpのガイド配列を検索します。 化膿レンサ 球菌由来のCas9ニッカーゼ(Cas9n)を使用する場合は、一対のシングルガイドRNA(sgRNA)が必要です。sgRNAのペアは、-4〜20 bpのオフセット6でニッキング時に5'のオーバーハングを生成できなければなりません。</li>
	<li>必要なオリゴとpSpCas9n-2A-プロベクターを注文します。</li>
	<li>sgRNAをpSpCas9nベクターにクローニングして、公開されたプロトコル12に従ってCas9nと共発現させる。</li>
</ol>2. piggyBacベースのターゲティングベクターの設計と構築
<ol><li>標的遺伝子配列をダウンロードし、改変部位付近のTTAA部位を検索する。 注: TTAA サイトと変更予定サイトの間の距離は、できるだけ短くする必要があります。コード配列内で、100-bp以内にTTAA部位が存在しない場合は、同義ヌクレオチド置換を行って導入する必要がある。</li>
	<li>ホモロジーアーム(HA)を設計し、HAに目的の点変異を組み込みます。HA の最適な長さは、約 500 〜 1200 bp である必要があります。 注:Cas9nの再切断の可能性を回避するために、PAM配列を変異させるために同義のヌクレオチド置換を導入することをお勧めします。</li>
	<li>確立されたプロトコル10に従って最終的なターゲティングベクトルを構築する。 注:ここで使用されるターゲティングベクターでは、PGKプロモーター駆動のpuro-deltaTK選択カセットがトランスポゾン反転リピートによって隣接されています。</li>
</ol>3. ヒト多能性幹細胞の遺伝子編集
<ol><li>ヒト多能性幹細胞(hPSC)を加湿インキュベーター内で37°C、組換えラミニン521コーティング表面(5 μg/mL)の5%CO2 をmTeSR1培地13に維持します。細胞は、1:3の分割比の後、72時間後に70〜85%のコンフルエントに達するはずです。 注:存在する場合は、毎日の培地交換の前に、自然に分化した細胞を穏やかに吸引して取り除きます。</li>
	<li>トランスフェクション当日、24 ウェルプレートのウェルに 300 μL のラミニン 521 溶液 (5 μg/mL) を 37 °C で 2 時間以上コーティングします。</li>
	<li>コーティング溶液を穏やかに除去し、10 μM ROCK阻害剤を添加した300 μLの新鮮なmTeSR1培地を各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに戻して細胞を受け取ります。 注意: ラミニンコーティング溶液を除去するときは、プレートを乾燥させないでください。</li>
	<li>ストックhPSCをインキュベーターから移動し、使用済み培地を除去してから、1 mLの滅菌1x DPBSを使用して細胞を1回洗浄します。</li>
	<li>穏やかな細胞解離試薬1 mLを6ウェルプレートの各ウェルに加え、37°Cで6〜8分間インキュベートして細胞を解離させます。 注意: プレートを軽くたたき、細胞が簡単に剥がれるかどうかを確認して、消化が十分に長いかどうかを判断します。</li>
	<li>P1000チップを使用してゆっくりと上下にピペットで動かし、すべてのhPSCを持ち上げます。</li>
	<li>10 μM ROCK阻害剤(Y-27632)を添加した2 mLの新鮮なmTeSR1培地を細胞懸濁液に加えて解離を終了します。</li>
	<li>よく混合し、単一細胞懸濁液を50 mLチューブに移し、室温で200 x g で3分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を除去し、10 μM ROCK阻害剤を添加した2 mLの新鮮なmTeSR1培地に細胞をよく再懸濁します。</li>
	<li>血球計算盤を使用して生細胞をカウントします。トリパンブルーを使用して、死んだ細胞を染色して除外します。</li>
	<li>8 x 10 5から1 x 106生細胞を各ヌクレオフェクション反応のために1.5 mLチューブに移し、200 x gで3分間遠心分離します。その後、上清を注意深く吸引します。</li>
	<li>3 μgのペアCas9n-sgRNA発現プラスミドと5 μgのターゲティングベクタープラスミドを、ヒト幹細胞核効果キットの100 μLの混合ヌクレオフェクション溶液/サプリメントに混合します。キットのGFPコントロールプラスミドを使用し、GFPコントロールプラスミドミックスも調製します。 注:核代謝前のエンドトキシン汚染を減らすために、すべてのプラスミドのマキシプレップを行うことが重要です。プラスミドの濃度は約1 μg/μLである必要があります。</li>
	<li>DNAミックス(容量~111 μL)を使用して、調製した細胞を再懸濁し、気泡を避けてエレクトロポレーションキュベット(ヌクレオフェクションキットに付属)に移します。</li>
	<li>ヒト多能性幹細胞に最適化された条件を選択することにより、核オフフェクションデバイスを使用して細胞をエレクトロポレーションします。 注:ヒト多能性幹細胞用の核効果キットを初めて使用する場合は、エレクトロポレーションプログラムをテストし、最も効率的なものを選択する必要があります。</li>
	<li>10 μM ROCK阻害剤を添加した37°CのmTeSR1培地に、新鮮で温かい500 μLをエレクトロポレーション細胞に直ちに加えます。ステップ3.2および3.3で調製した24ウェルプレートの2ウェルにミックスを移します。</li>
	<li>プレートを37°C/5%CO2 インキュベーターにすばやく戻し、細胞を回復させます。</li>
	<li>12〜16時間後、細胞維持培地を交換します。細胞が細胞間接触を確立した場合は、ROCK阻害剤を回収し、そうでない場合は、阻害剤を培地に補充し続ける。</li>
	<li>24〜48時間の間に、コントロール細胞におけるGFP発現を調べることにより、核オフ化効率を確認する。GFP陽性細胞は少なくとも30%でなければなりません。</li>
	<li>ニュークレオフェクションの48時間後、mTeSR1培地に1 μg/mLのピューロマイシンを添加して細胞の選択を開始します。</li>
	<li>ヌクレオフェクションの72時間後、mTeSR1培地に0.5 μg/mLのピューロマイシンを補充します。細胞コンフルエントが30%より低い場合は、10 μM ROCK阻害剤も培地に補給します。</li>
	<li>ヌクレオフェクション後4〜6日で、ピューロマイシン耐性細胞を0.8細胞/ウェルの濃度で10〜15 x 96ウェルプレートに継代します。 注:培地に10 μM ROCK阻害剤と0.5 μg/mLピューロマイシンを補給することが不可欠です。</li>
	<li>これらの細胞を37°C/10%CO2で10〜12 日間維持して、単一細胞由来のコロニーを形成します。播種後7日で培地を補充する。 注:CO2 レベルの上昇は、私たちの経験から単一のhPSCがコロニーを形成するのに役立ちます。</li>
	<li>単一コロニーを含むウェルにマークを付け、培地を0.5 μg/mLのピューロマイシンを含むがROCK阻害剤を含まない新鮮なmTeSR1培地に置き換えます。 注:この時点から、細胞は37°C / 5%CO2の下で成長します。</li>
	<li>2日後、未分化コロニーを含むウェルの培地を交換した。培地に10 μM ROCK阻害剤と0.5 μg/mLピューロマイシンを補充します。 注:一部のウェルでは、細胞が分化している可能性があり、廃棄する必要があります。</li>
	<li>P2ピペットチップを使用して、コロニーをやさしくこすり落とします。1つのコロニーに由来する細胞懸濁液を別々の96ウェルプレート上の2つの新しいウェルに移し、1つはジェノタイピングに、もう1つは維持に使用します。 注:コロニーを注意深く維持し、自然分化レベルを最小限に抑えることが重要です。</li>
	<li>ほとんどのウェルのコンフルエントが50%以上に達したら、ジェノタイピング用の細胞を含むプレートを取り出します。使用済みの培地を捨ててから、DPBSで細胞を一度洗浄します。</li>
	<li>Bradley溶解バッファーを使用してウェル内の細胞を溶解し、関連するプロトコルに従ってプレート内の各ウェルからゲノムDNAを分離します(https://mcmanuslab.ucsf.edu/protocol/dna-isolation-es-cells-96-well-plate)。</li>
	<li>3プライマージャンクションPCR法を用いて、左右両方の相同性アームを独立して遺伝子型決定する10。 注:PCR法を示すスキームを 図2に示します。</li>
	<li>サンガーシーケンシングのために4〜5コロニーから両方の相同性アームのジャンクションPCR産物を送り、配列を取得します。 注:2つの確立されたコロニーの配列決定結果を 図3Aに示します。</li>
	<li>正しい遺伝子型のコロニーを保持し、残りを破棄します。</li>
	<li>連続的なピューロマイシン選択の下で正しいコロニーを拡大し、可能な限り早い継代でそれらを凍結する。</li>
</ol>4. 標的ヒト多能性幹細胞からのトランスポゾン除去
<ol><li>正しい遺伝子型のコロニーを 1 つ 0.5 μg/mL ピューロマイシン選択下に維持します。</li>
	<li>上記のように5μgの高活性トランスポザーゼ(pCMV-hyPBase)を有するNucleofect 8 x 105 〜1x 10 6 細胞(セクション3、ステップ3.4〜3.18)。GFP制御の核反応を並行して行います。 注:ピューロマイシンは、これらの細胞を核放出した直後にmTeSR1培地から除去する必要があります。</li>
	<li>公開された手順に従ってpuro-deltaTK選択カセットを取り外した細胞を増殖させ、スクリーニングします10. 注意: 元の手順に注意深く従うことが重要です。FIAU、または1-(2-デオキシ-2-フルオロ-β-D-アラビノフラノシル)-5-ヨードラシル)は、単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ(HSV-tk)ベースのネガティブセレクションのチミジン類似体として使用されました。</li>
	<li>修飾領域を配列決定し、トランスポゾンの除去を確認する。 注:3つの確立されたコロニーの配列決定結果を 図3Bに示します。</li>
	<li>コロニーを正しい遺伝子型で保持し、さらなる使用のために拡張します。</li>
	<li>選択したコロニーの多能性マーカーの特性評価を実行してから、さらなる分析に使用します。 注:2つの確立されたコロニーの特性評価を 図4に示します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rashidi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+human+liver+tissue+from+pluripotent+stem+cells+displays+stable+phenotype+in+vitro+and+supports+compromised+liver+function+in+vivo.">3D human liver tissue from pluripotent stem cells displays stable phenotype in vitro and supports compromised liver function in vivo.</a> Archives of Toxicology. 92 (10), 3117-3129 (2018).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iPSCs+using+zinc-finger+nucleases.">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases.</a> Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).</li><li>Porteus, M. H., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+nucleases+stimulate+gene+targeting+in+human+cells.">Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells.</a> Science. 300 (5620), 763 (2003).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-822 (2012).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity.">Double nicking by RNA-guided CRISPR cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-824 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Yusa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+correction+of+&#945;1-antitrypsin+deficiency+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Targeted gene correction of &#945;1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).</li><li>Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seamless+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells+using+custom+endonuclease-based+gene+targeting+and+the+piggyBac+transposon.">Seamless genome editing in human pluripotent stem cells using custom endonuclease-based gene targeting and the piggyBac transposon.</a> Nature Protocols. 8 (10), 2061-2078 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiomics+Analyses+of+HNF4&#945;+Protein+Domain+Function+during+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Differentiation.">Multiomics Analyses of HNF4&#945; Protein Domain Function during Human Pluripotent Stem Cell Differentiation.</a> iScience. 16, 206-217 (2019).</li><li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+and+Scalable+Generation+of+Hepatocyte-like+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (121), 1-8 (2017).</li><li>Eggenschwiler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+bi-allelic+modification+of+a+transcriptionally+silent+locus+in+patient-derived+iPSC+by+Cas9+nickase.">Improved bi-allelic modification of a transcriptionally silent locus in patient-derived iPSC by Cas9 nickase.</a> Scientific Reports. 6, 1-14 (2016).</li></ol>

D.C.Hは、Stemnovate Limitedの共同創設者、株主、取締役です。

本明細書に記載されるプロトコルは、hPSCの内因性遺伝子座に所定の点突然変異を導入するために使用することができる。 piggyBacベースのターゲティングベクターとペアのCRISPR/Cas9n発現プラスミドの組み合わせは、信頼性が高く効率的であることが証明されました11。HNF4α遺伝子編集後、解析された43クローンのうち12クローンが、ジャンクションPCRスクリーニングによって決定されたとおりに正しく標的化されました。具体的には、バイアレルターゲティング効率は約21%(9/43)、モノアレルターゲティング効率は約7%(3/43)でした。
ターゲティング実験の後、スクリーニングの最初のラウンド中に標的遺伝子座を piggyBac トランスポザーゼにアクセスできるようにするために、ピューロマイシンの選択を維持することが重要です。これにより、PGKプロモーター駆動のピューロデルタTK選択カセットのサイレンシングが最小限に抑えられ、スクリーニング10の第2ラウンドのバックグラウンドが減少します。最近の報告では、hPSCにおいてCAGプロモーターがPGKプロモーターよりもサイレンシングに対して耐性が高いことが示されました14。したがって、選択カセットのプロモーターを変更することで、将来的にこのシステムが改善される可能性があります。また、hyPBaseトランスフェクト細胞とGFPトランスフェクト細胞からの耐性コロニーの数を比較することも重要です。トランスポゾンの除去に成功すると、GFPトランスフェクト細胞よりもhyPBaseからの生存コロニーが多くなるはずです。トランスポゾン切除のPCR分析に加えて、切除の忠実度を確認するために、修飾領域の直接シーケンシングが必要です。
YusaのpiggyBacトランスポゾンベースのターゲティングベクター戦略9,10に基づいて、上記の手順は、hPSCの核代謝および単一細胞クローニング効率の改善に焦点を当てた。細胞播種密度は、不均一なコロニー形成の可能性を低減するように最適化されました。また、遺伝子型スクリーニングのためのコロニー産生を強化するために、10%CO2下で10〜12日間の培養を採用しました。私たちの経験では、各96ウェルプレートから約20のコロニーを得ることができました。この手順は他の方法よりも時間がかかる場合がありますが、信頼性が高く、非常に効率的です。
必要に応じて、点突然変異の導入または修正、レポーター細胞株の作成、および遺伝子発現のノックアウトを行うターゲティングベクターを設計することができます。結論として、CRISPR/Cas9(n)システムとターゲティングベクターの組み合わせは、異なるタイプの遺伝子組み換えhPSCを送達するための効率的な方法です。

ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、研究または診療所のための体細胞の無制限の供給源を表しています1。hPS細胞における遺伝子ターゲティングは、細胞仕様中の遺伝子機能を研究し、疾患のメカニズムを理解するための強力な方法を提供します。効率的なゲノム編集法は存在しますが、hPS細胞の遺伝子を改変することは技術的に困難なままです。hPSCにおける相同組換えによる標準的な遺伝子ターゲティングは、低頻度で起こるか、一部の遺伝子では検出できないことさえあり2、したがって、これらの細胞ではDNA二本鎖切断(DSB)刺激遺伝子ターゲティング(遺伝子編集と呼ばれる)が必要である2,3。さらに、hPSCのトランスフェクションとそれに続くシングルセルクローニングは、Rho関連プロテインキナーゼ(ROCK)阻害剤を使用することで単一細胞関連アポトーシスを低減できるにもかかわらず、あまり効率的ではありません4。最後に、目的の遺伝子における潜在的なオンターゲットおよびオフターゲット変異も問題となる可能性があります。したがって、hPSCに調整された遺伝的変化を行うには、信頼できるプロトコルが不可欠です。
RNAガイドCRISPR(クラスター化された規則的に間隔を空けた短い回文反復)およびCRISPR関連タンパク質9(Cas9)テクノロジーは、現在、遺伝子編集において確立されたツールです。転写されたCRISPR RNA(crRNA)とトランス活性化RNA(tracrRNA)は、Cas9タンパク質と複合体を形成して遺伝子特異的切断を可能にするシングルガイドRNA(sgRNA)を形成します5。CRISPR/Cas9システムは、sgRNAの20 bpガイド配列を変更することでプログラム可能であり、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)要件を満たすほぼすべての遺伝子座を編集することができます。ただし、野生型Cas9は、そのガイド配列とDNAターゲットとの間のいくつかの不一致を許容することができ、望ましくないオフターゲット効果を引き起こす可能性があります。その特異性を向上させるために、ニッカーゼ変異体(Cas9n)が開発されました。D10AまたはN863A変異を含むCas9nは、1つの機能的なヌクレアーゼドメインしか持たず、その結果、1本の鎖上のDNAしか切断できません。適切な間隔と配向のCas9nのペアは、DNA DSBを効果的に誘導することができ、オフターゲット効果は劇的に減少します6。効率的なCas9n修飾を確実にするために、2つのCas9n-sgRNAを理想的には-4〜20 bpのオフセットで配置し、常に5'オーバーハング6を作成する必要があることが示されています。
Cas9(n)-sgRNA誘導性DSBは、hPSCのゲノム編集に利用できます7,8。非相同末端結合修復を介して遺伝子ノックアウトを作成したり、ドナーDNAテンプレートが存在する場合は相同性指向修復(HDR)を介して遺伝子改変を導入したりすることができます。ここで説明するプロトコルは、HDR用のpiggyBacトランスポゾンベースのドナープラスミド(またはターゲティングベクター)を使用し、薬剤耐性マーカーがトランスポゾン反転リピートによって隣接している。このアプローチの利点には、Yusaらによって最初に実証されたように、効率的なスクリーニングとシームレスな遺伝子編集が含まれます9,10。薬物選択カセットは、統合されたベクターで細胞を濃縮することを可能にし、その後、ジャンクションPCRによってスクリーニングされ、HDRによって誘導されたものを同定する。さらに、薬物選択カセットは、Cas9(n)切断のターゲット配列を置き換えるように配置できるため、HDR後にそれ以上のDNA切断は発生せず、Cas9(n)再切断に起因する「オンターゲット」変異を排除します。さらに、piggyBacトランスポザーゼによって触媒される正確な切除を利用することにより、選択マーカーは瘢痕を残さずにゲノムから切除されます。piggyBac挿入のための元の内因性TTAA配列のみが、薬物選択マーカー9の除去後に残る。置換を導入することによってTTAAサイトを作成する必要がある場合でも、規制要素を乱す可能性は他の方法と比較して減少します10。
ここでは、hPSCにおけるシームレスなゲノム編集を実装するための詳細な手順について説明します。 PiggyBacベースのドナープラスミドとCRISPR-Cas9ニッカーゼ変異体を2段階の遺伝子選択で組み合わせ、肝細胞核因子4α(HNF4α)遺伝子11に2つの所定の点変異を導入しました。このアプローチは信頼性が高く効率的であり、ヒト多能性幹細胞の内胚葉および肝細胞の仕様においてHNF4αが果たす重要な役割の詳細な分析を可能にしました11。

<table><tbody><tr><td>Anti-Human SSEA4 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-8843-42</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human TRA-1-60 PE</td><td>eBioscience</td><td>11-0159-42</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>DPBS with calcium and magnesium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>FIAU</td><td>Moravek</td><td>M251</td><td></td></tr><tr><td>Gentle cell dissociation reagent</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07174</td><td></td></tr><tr><td>H9 human embryonic stem cells</td><td>WiCell</td><td>WA09</td><td></td></tr><tr><td>Human NANOG antibody</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>AF1997</td><td></td></tr><tr><td>Human OCT4 antibody</td><td>Abcam</td><td>AB19857</td><td></td></tr><tr><td>Human stem cell Nucleofector kit 1</td><td>Lonza</td><td>VPH-5012</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG3 isotype control PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4742-41</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 2b device</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-hyPBase</td><td>Wellcome Trust Sanger Institute</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pMCS-AAT_PBPGKpuroTK</td><td>Wellcome Trust Sanger Institute</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pSpCas9n(BB)-2A-Puro (PX462)</td><td>Addgene</td><td>PX462</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep spin maxiprep kit</td><td>Qiagen</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep spin miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant laminin 521</td><td>BioLamina</td><td>LN521</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue solution, 0.4%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632(Dihydrochloride)</td><td>Millipore</td><td>SCM075</td><td></td></tr></tbody></table>

introducing point mutations into human pluripotent stem cells using seamless genome editing

RNAガイド下クラスター化規則的間隔短回文反復(CRISPR)-Cas9などのカスタム設計のエンドヌクレアーゼは、哺乳類細胞での効率的なゲノム編集を可能にします。ここでは、ヒト多能性幹細胞における肝細胞核因子4α(HNF4α)遺伝子座を例としてシームレスにゲノム編集するための詳細な手順を記載する。 piggyBacベースのドナープラスミドとCRISPR-Cas9ニッカーゼ変異体を2段階の遺伝子選択で組み合わせることで、HNF4α遺伝子座の正確かつ効率的なターゲティングを実証します。

ターゲティングベクトルベースのノックイン戦略 肝細胞核因子4アルファ(HNF4α)遺伝子は、エクソン8に2点変異を導入するための標的ゲノム編集のために選択されました。11 bpオフセットを有するCas9n-sgRNAのペアを、修飾する部位の近くに設計した。 piggyBacベースのターゲティングベクターは、所望の点突然変異を導入するための相同性指向修復テンプレートとして機能した。同義ヌクレオチド置換または所望の点変異を組み込んだ967 bp 5'-HAおよび1142 bp 3'-HAを増幅し、最終ターゲティングベクターにクローニングした。 piggyBac 挿入部位は、2つの所望の点突然変異から16bpおよび22bp離れていた。ピューロデルタTK選択カセットを含むコロニーを、第1ラウンドでピューロマイシンで選択した。2回目のトランスポザーゼ切除によって選択カセットが除去されると、標的部位は、遺伝子に組み込まれた所望の点突然変異のみでシームレスに改変されました(図1)。
ヒト多能性幹細胞における遺伝子編集 正しく標的とされた細胞をスクリーニングするために、ジェノタイピングに3つのプライマーベースのPCR法を使用しました(図2)。PCR結果を確認するためにサンガーシーケンシングを行った(図3A)。選択カセットの除去後、改変領域を再度配列決定し、所望の点突然変異の正しい導入を確認した(図3B)。
編集されたヒト多能性幹細胞のコロニー樹立と特性評価 正しい遺伝子型を有するコロニーを選択し、必要に応じて拡大した。確立されたコロニーは、さらなる分析に使用する前に特徴付ける必要があります。編集された細胞は、親細胞と同じ形態を有する(図4A)。それらはまた、転写因子NANOGおよびOCT4(図4 B)、ならびに細胞表面マーカーSSEA4およびTRA-1-60(図4C)を含む代表的なヒト多能性幹細胞マーカーを発現する。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig1.jpg"> 図1:ターゲティングベクターベースのノックイン戦略11. 一対のCas9n-sgRNA発現プラスミドを用いて、HNF4α遺伝子のエクソン8におけるDNA二本鎖切断を誘導した。選択カセットを有するターゲティングベクターを用いて、16bpおよび22bp離れた位置に位置する所定の点変異を導入した。この選択カセットは、構成的に活性なプロモーター(PGK)によって駆動されるポジティブ-ネガティブ選択マーカー(puro-deltaTK)からなる piggyBac トランスポゾン内に含まれていました。相同性指向修復経路を介して、標的細胞は選択カセットを組み込んだ。トランスポザーゼによって媒介されるトランスポゾン切除は、点突然変異のみが存在するシームレスな修飾をもたらす。赤十字は、目的の点突然変異の位置を示します。HA = 相同性アーム;PB = ピギーバック;PM =点突然変異。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61152/61152fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig2.jpg"> 図2:3つのプライマーベースのPCR法。 遺伝子標的細胞をスクリーニングするために、PCRベースのジェノタイピングが使用されました。3つのプライマー、LA-F1、-R1および-R2を用いて、左相同性アーム領域を増幅した。独立して、RA-F1、-F2および-R1を用いて、右相同性アーム領域を増幅した。ゲル電気泳動結果に基づいて、非標的細胞、ならびにヘテロ接合細胞およびホモ接合細胞を、互いに区別した。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61152/61152fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig3.jpg"> 図3:遺伝子改変細胞の配列決定結果11. 2つのクローンからのPCR産物を配列決定し、標的遺伝子座(A)における選択カセットの正しい挿入を確認した。5'および3' のpiggyBac 逆ターミナルリピート(ITR)は、TTAAダイレクトリピートに隣接していました。3つのクローンをトランスポゾン切除後に配列決定した(B)。11 bpオフセットを有するCas9n-sgRNAのペアを使用して、DNA二本鎖切断を導入しました。2つの所定の点突然変異(AからGおよびAからC)を遺伝子に導入した。1つの同義変異は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を変異させるために導入され、もう1つは piggyBac 切除に必要なTTAA部位を作成するために導入されました。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61152/61152fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61152/61152fig4.jpg"> 図4:編集されたヒト多能性幹細胞の特性評価。 2つの編集された細胞株と親細胞(A)の形態は、スケールバー=100μmである。多能性幹細胞マーカーNANOGおよびOCT4の発現を免疫染色により調べ(B、スケールバー=50μm)、フローサイトメトリーによるSSEA4およびTRA-1-60に加えて(C)2つの改変細胞株および親細胞とした。陰性対照としてIgGを用いた。DAPIは核を染色するために使用されました。百分率は、3つの独立した実験の平均として計算した。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61152/61152fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

ここで、 piggyBacベースのドナープラスミドとCas9ニッカーゼ変異体を用いたヒト多能性幹細胞におけるシームレスな遺伝子編集のための詳細な方法について述べる。ヒト胚性幹細胞(hESC)の肝細胞核因子4α(HNF4α)遺伝子座のエクソン8に2点変異を導入した。

シームレスなゲノム編集によるヒト多能性幹細胞への点突然変異の導入

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

introducing-point-mutations-into-human-pluripotent-stem-cells-using

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

4.0K ビュー.  University of Edinburgh. ここで、 piggyBacベースのドナープラスミドとCas9ニッカーゼ変異体を用いたヒト多能性幹細胞におけるシームレスな遺伝子編集のための詳細な方法について述べる。ヒト胚性幹細胞(hESC)の肝細胞核因子4α(HNF4α)遺伝子座のエクソン8に2点変異を導入した。

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Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

トランスフェクション、選択、およびAAVS1セーフハーバーへのGFP遺伝子とTALENを標的とする人間の人工多能性幹細胞のコロニーピッキング

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

発生生物学

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding human development and dissecting disease mechanisms in a dish. To capitalize on this potential application requires efficient genome-editing tools to generate hPSC mutants in disease-associated genes, as well as in vitro hPSC differentiation protocols to produce disease-relevant cell types that closely recapitulate their in vivo counterparts. An efficient genome-editing platform for hPSCs named iCRISPR has been developed through the TALEN-mediated targeting of a Cas9 expression cassette in the AAVS1 locus. Here, the protocols for the generation of inducible Cas9 hPSC lines using cells cultured in a chemically defined medium and a feeder-free condition are described. Detailed procedures for using the iCRISPR system for gene knockout or precise genetic alterations in hPSCs, either through non-homologous end joining (NHEJ) or via precise nucleotide alterations using a homology-directed repair (HDR) template, respectively, are included. These technical procedures include descriptions of the design, production, and transfection of CRISPR guide RNAs (gRNAs); the measurement of the CRISPR mutation rate by T7E1 or RFLP assays; and the establishment and validation of clonal mutant lines. Finally, we chronicle procedures for hPSC differentiation into glucose-responsive pancreatic &#946;-like cells by mimicking in vivo pancreatic embryonic development. Combining iCRISPR technology with directed hPSC differentiation enables the systematic examination of gene function to further our understanding of pancreatic development and diabetes disease mechanisms.

Protocols to generate hPSC mutant lines using the iCRISPR platform and to differentiate hPSCs into glucose-responsive &#946;-like cells are described. Combining genome editing technology with hPSC-directed differentiation provides a powerful platform for the systematic analysis of the role of lineage determinants in human development and disease progression.

ヒト膵臓の開発にリネージュの決定要因を問い合わせるためのゲノム編集とhPSCsの指向性分化

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

遺伝学

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

点突然変異修復 CRISPR/Cas9 とひと細胞での SsODN によって触媒の機能として敷地内変異原性を調べるための標準方法論

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human development and investigate the pathophysiology of disease. By employing site-specific nucleases (SSNs) for genome editing, the rapid derivation of new hPSC lines harboring specific genetic alterations in an otherwise isogenic setting becomes possible. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 are the most commonly used SSNs. All of these nucleases function by introducing a double stranded DNA break at a specified site, thereby promoting precise gene editing at a genomic locus. SSN-meditated genome editing exploits two of the cell&#39;s endogenous DNA repair mechanisms, non-homologous end joining (NHEJ) and homology directed repair (HDR), to either introduce insertion/deletion mutations or alter the genome using a homologous repair template at the site of the double stranded break. Electroporation of hPSCs is an efficient means of transfecting SSNs and repair templates that incorporate transgenes such as fluorescent reporters and antibiotic resistance cassettes. After electroporation, it is possible to isolate only those hPSCs that incorporated the repair construct by selecting for antibiotic resistance. Mechanically separating hPSC colonies and confirming proper integration at the target site through genotyping allows for the isolation of correctly targeted and genetically homogeneous cell lines. The validity of this protocol is demonstrated here by using all three SSN platforms to incorporate EGFP and a puromycin resistance construct into the AAVS1 safe harbor locus in human pluripotent&#160;stem cells.

Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.

ゲノム編集したヒト多能性幹細胞株の樹立：分離へのターゲティングから

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

強化されたゲノム細胞や生物の多様な Cas9 リボ核蛋白質と編集

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the differentiation of hiPSCs derived from a patient with the triplication of the alpha-synuclein gene (SNCA) locus into Parkinson&#8217;s disease (PD)-relevant dopaminergic neuronal populations. Accumulating evidence has shown that high levels of SNCA are causative for the development of PD. Recognizing the unmet need to establish novel therapeutic approaches for PD, especially those targeting the regulation of SNCA expression, we recently developed a CRISPR/dCas9-DNA-methylation-based system to epigenetically modulate SNCA transcription by enriching methylation levels at the SNCA intron 1 regulatory region. To deliver the system, consisting of a dead (deactivated) version of Cas9 (dCas9) fused with the catalytic domain of the DNA methyltransferase enzyme 3A (DNMT3A), a lentiviral vector is used. This system is applied to cells with the triplication of the SNCA locus and reduces the SNCA-mRNA and protein levels by about 30% through the targeted DNA methylation of SNCA intron 1. The fine-tuned downregulation of the SNCA levels rescues disease-related cellular phenotypes. In the current protocol, we aim to describe a step-by-step procedure for differentiating hiPSCs into neural progenitor cells (NPCs) and the establishment and validation of pyrosequencing assays for the evaluation of the methylation profile in the SNCA intron 1. To outline in more detail the lentivirus-CRISPR/dCas9 system used in these experiments, this protocol describes how to produce, purify, and concentrate lentiviral vectors and to highlight their suitability for epigenome- and genome-editing applications using hiPSCs and NPCs. The protocol is easily adaptable and can be used to produce high titer lentiviruses for in vitro and in vivo applications.

Targeted DNA epigenome editing represents a powerful therapeutic approach. This protocol describes the production, purification, and concentration of all-in-one lentiviral vectors harboring the CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene for epigenome-editing applications in human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neurons.

レンチウイルスベクター人間にエピゲノム編集ツールの効率的な配信用誘導多能性幹細胞由来の疾患モデル

The use of hiPSC-derived cells represents a valuable approach to study human neurodegenerative diseases. Here, we describe an optimized protocol for the ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted for research in regenerative medicine and are currently in clinical trials for eye diseases, diabetes, heart diseases, and other disorders. The potential to differentiate into specialized cell types coupled with the recent advances in genome editing technologies including the CRISPR/Cas system have provided additional opportunities for tailoring the genome of iPSC for varied applications including disease modeling, gene therapy, and biasing pathways of differentiation, to name a few. Among the available editing technologies, the CRISPR/Cas9 from Streptococcus pyogenes has emerged as a tool of choice for site-specific editing of the eukaryotic genome. The CRISPRs are easily accessible, inexpensive, and highly efficient in engineering targeted edits. The system requires a Cas9 nuclease and a guide sequence (20-mer) specific to the genomic target abutting a 3-nucleotide &#34;NGG&#34; protospacer-adjacent-motif (PAM) for targeting Cas9 to the desired genomic locus, alongside a universal Cas9 binding tracer RNA (together called single guide RNA or sgRNA). Here we present a step-by-step protocol for efficient generation of feeder-independent and footprint-free iPSC and describe methodologies for genome editing of iPSC using the Cas9 ribonucleoprotein (RNP) complexes. The genome editing protocol is effective and can be easily multiplexed by pre-complexing sgRNAs for more than one target with the Cas9 protein and simultaneously delivering into the cells. Finally, we describe a simplified approach for identification and characterization of iPSCs with desired edits. Taken together, the outlined strategies are expected to streamline generation and editing of iPSC for manifold applications.

This protocol describes in detail the generation of footprint-free induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human pancreatic cells in feeder-free conditions, followed by editing using CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins and characterization of the modified single-cell clones.

効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダー フリーの編集

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

生物工学

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is still time consuming. Comparative studies that use recombinant lines with transgenes integrated into safe harbor loci could benefit from approaches that use site-specific targeted recombinases, like Cre or FLPe, which are more rapid and less prone to off-target effects. Such methods have been described, although they do not significantly outperform gene targeting in most aspects. Using Zinc-finger nucleases, we previously created a master cell line in the AAVS1 locus of hPSCs&#160;that contains a GFP-Hygromycin-tk expressing cassette, flanked by heterotypic FRT sequences. Here, we describe the procedures to perform FLPe recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) using this line. The master cell line is transfected with a RMCE donor vector, which contains a promoterless Puromycin resistance, and with FLPe recombinase. Application of both a positive (Puromycin) and negative (FIAU) selection program leads to the selection of RMCE without random integrations. RMCE generates fully characterized pluripotent polyclonal transgenic lines in 15 d&#160;with 100% efficiency. Despite the recently described limitations of the AAVS1 locus, the ease of the system paves the way for hPSC transgenesis in isogenic settings, is necessary for comparative studies, and enables semi-high-throughput genetic screens for gain/loss of function analysis that would otherwise be highly time consuming.

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Here we report a rapid and efficient gene editing method based on RMCE in the AAVS1 locus of human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) that improves upon previously described systems. Using this technique, isogenic lines can be rapidly and reliably generated for proper comparative studies, facilitating transgenesis-mediated research with hPSCs.

中リコンビナーゼ媒介カセット交換による組換えヒト多能性幹細胞の迅速かつ効率的な生成<em&gt; AAVS1</em&gt;軌跡

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

医学

CRISPR-Cas9 Mediated Gene Deletion in Human Pluripotent Stem Cells Cultured Under Feeder-Free Conditions

The CRISPR-Cas9 system for genome editing has revolutionized gene function studies in mammalian cells, including stem cells. However, the practical application of this technique, particularly in pluripotent stem cells, presents certain challenges, such as being time- and labor-intensive and having low editing efficiency. Here, we describe the generation of a CRISPR-mediated gene knockout in a human embryonic stem cell (hESC) line stably expressing sgRNAs for the L2HGDH gene, using a highly efficient and stable lentiviral-mediated gene delivery system. The sgRNAs targeting exon 1 of the L2HGDH gene were chemically synthesized and cloned into the lentiCRISPR v2-puro vector, which combines the constitutive expression of sgRNAs with Cas9 in a highly efficient single-vector system to achieve higher lentiviral titers for hESC infection and stable selection using puromycin. Puromycin-selected cells were further expanded, and single-cell clones were obtained using the limited dilution method. The single clones were expanded, and several homozygous knockout clones for the L2HGDH gene were obtained, as confirmed by a 100% reduction in L2HGDH expression using Western blot analysis. Furthermore, using MSBSP-PCR, the CRISPR mutation site was mapped upstream of the PAM recognition sequence of Cas9 in the selected homozygous clones. Sanger sequencing was performed to analyze the exact insertions/deletions, and functional characterization of the clones was conducted. This method produced a significantly higher percentage of homozygous deletions compared to previously reported non-viral gene delivery methods. Although this report focuses on the L2HGDH gene, this robust and cost-effective approach can be used to create homozygous knockouts for other genes in pluripotent stem cells for gene function studies.

<meta charset="utf8"></head><body>フィーダーフリー条件下で培養したヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子欠失

The presented method describes the generation of a CRISPR-mediated gene knockout in the human embryonic stem cell (hESC) line H9, which stably expresses sgRNAs targeting the L2HGDH gene using a highly efficient lentiviral-mediated gene delivery system.

フィーダーフリー条件下で培養したヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子欠失

The CRISPR-Cas9 system for genome editing has revolutionized gene function studies in mammalian cells, including stem cells. However, the practical ...

シームレスなゲノム編集によるヒト多能性幹細胞への点突然変異の導入

要約

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トランスフェクション、選択、およびAAVS1セーフハーバーへのGFP遺伝子とTALENを標的とする人間の人工多能性幹細胞のコロニーピッキング

ヒト膵臓の開発にリネージュの決定要因を問い合わせるためのゲノム編集とhPSCsの指向性分化

点突然変異修復 CRISPR/Cas9 とひと細胞での SsODN によって触媒の機能として敷地内変異原性を調べるための標準方法論

ゲノム編集したヒト多能性幹細胞株の樹立：分離へのターゲティングから

強化されたゲノム細胞や生物の多様な Cas9 リボ核蛋白質と編集

レンチウイルスベクター人間にエピゲノム編集ツールの効率的な配信用誘導多能性幹細胞由来の疾患モデル

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダーフリーの編集

中リコンビナーゼ媒介カセット交換による組換えヒト多能性幹細胞の迅速かつ効率的な生成

フィーダーフリー条件下で培養したヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子欠失

シームレスなゲノム編集によるヒト多能性幹細胞への点突然変異の導入

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トランスフェクション、選択、およびAAVS1セーフハーバーへのGFP遺伝子とTALENを標的とする人間の人工多能性幹細胞のコロニーピッキング

ヒト膵臓の開発にリネージュの決定要因を問い合わせるためのゲノム編集とhPSCsの指向性分化

点突然変異修復 CRISPR/Cas9 とひと細胞での SsODN によって触媒の機能として敷地内変異原性を調べるための標準方法論

ゲノム編集したヒト多能性幹細胞株の樹立：分離へのターゲティングから

強化されたゲノム細胞や生物の多様な Cas9 リボ核蛋白質と編集

レンチウイルスベクター人間にエピゲノム編集ツールの効率的な配信用誘導多能性幹細胞由来の疾患モデル

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダー フリーの編集

中リコンビナーゼ媒介カセット交換による組換えヒト多能性幹細胞の迅速かつ効率的な生成

フィーダーフリー条件下で培養したヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子欠失

効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダーフリーの編集