この方法により、EYFPタグ付きCENP-Aタンパク質のユビキタス性を同定することが可能になります。また、異なるテストおよび他のタンパク質を有するヒトCENP-Aタンパク質に適用することができる。この主な利点は、重要な生物学的意義を有するEYFP CENP-A K124Rのユビキタスサイトを同定するために使用することができるということです。
これは、機能性タンパク質の広い範囲の翻訳後修飾を調査するために拡張することができます。まず、抗GFP抗体と結合したプロテインAビーズを調製する。25マイクロリットルのタンパク質Aビーズを、バッファーA1を少なくとも3回洗浄してエタノールを除去する。
その後、バッファー A1 を使用して 50% ビーズ溶液を作ります。2マイクロリットルの抗GFP抗体をビーズに加えます。次に、バッファ A1 をネットビードボリュームの 20 倍に追加します。4~18時間、摂氏4度でエンドツーエンド回転を行います。
回転の最適な持続時間は、免疫沈降の効率に基づいて経験的に決定されなければならない。回転後、100回gでビーズを遠心分離し、バインドされていない上清を取り除きます。バッファーA1を加えてビーズの50%溶液を作り、免疫沈降反応ごとにこの溶液の25マイクロリットルを使用します。
免疫沈降を行うために、超音波処理および凍結/解凍を介して緩衝液A1中の細胞をライスする。タンパク質濃度を測定し、異なるIPサンプル間のタンパク質量を正規化します。次に、SDS ページで実行する各チューブからサンプルの 5% を削除します。
残りのライゼートを抗GFP抗体に結合した25マイクロリットルのプロテインAビーズと混合し、4〜18時間摂氏4度でエンドツーエンドの回転を行います。バッファーAに細胞をライシングし、前述のように免疫沈降を行った後、EYFP CENP-Aのユビキタス性を確認し、ユビキタス化されたEYFP CENP-Aの位置を正確に決定するために、全免疫沈降剤の10%を保持します。質量分析分析には、他の 90% を使用します。
市販の4-12%Bis-Trisタンパク質ゲルで質量分析サンプルを実行します。次に、クマシーブルー染色を行い、質量分析のために50〜70キロダルトンゲル領域を切除します。各ゲルスライスを小さくスライスし、0.5ミリリットルの低タンパク質結合チューブに入れる。
25ミリモルの重炭酸アンモニウムで50%アセトニトリルの100マイクロリットルでゲル片を洗います。10〜15分間ボルテックスします。その後、それらをスピンダウンし、上清を捨てます。
最後の洗浄後、ベンチトップ真空濃縮器でゲル片を30分間乾燥させます。マイクロリットルシーケンシンググレードのトリプシンあたり10ナノグラムの10マイクロリットルを加え、ゲル片を5分間水分補給させます。その後、25ミリモルル重炭酸アンモニウムを追加し、ゲル片を覆い、一晩で摂氏37度でそれらを消化するのに十分です。
翌日、消化した上清をクリーンな0.65ミリリットルシリコンチューブに移し、50%アセトニトリルと5%のギ酸溶液を加えます。10分間、サンプルを渦に入れます。その後、それをスピンダウンし、抽出チューブに上清を転送します。
サンプルを2マイクロリットルに再び濃縮します。その後、3%アセトニトリルと2%ギ酸溶液の8マイクロリットルを加えます。15分間ボルテックスし、30分間16,000回gでスピンダウンします。
液体クロマトグラフィーシステムと質量分析装置を併用して、LC-MS/MSでMSデータ取得を行います。逆相液体クロマトグラフィーカラムにサンプル8マイクロリットルを注入し、原稿の指示に従って60分で2〜80%の溶媒Bの勾配でペプチドを分離します。データ依存取得モードを使用して質量分析データを収集します。
デスクトップ上の質量分析データを分析する商用ソフトウェアを開きます。新しい検索を開始するには、上部メニューの LC ボタンをクリックします。次に、[追加] ボタンをクリックして、元の MS 生データ ファイルをアップロードします。
データベース検索方法としてパラゴン法でヒトタンパク質IDを選択し、元のMS生データファイルをUniProt homo sapiensデータベースに対して検索します。消化酵素としてトリプシンを選択し、原稿の指示に従ってパラメータの残りの部分を設定します。結果のファイル名を入力し、メニューの右側にある[名前を付けて保存]ボタンをクリックします。
次に、検索結果を保存するフォルダを選択し、[保存] ボタンをクリックします。プロセスボタンをクリックして検索を開始します。検索が終了すると、入力した検索名を持つデータが、選択したフォルダに自動的に保存されます。
特定のペプチドのMS/MSスペクトルを取得するには、ソフトウェアFで検索結果を開き、トップメニューのタンパク質リストのタンパク質をクリックし、中央のメニューでペプチドをクリックします。このペプチドのMS/MSはメニューの下部に表示されます。MS/MS スペクトルをエクスポートして保存するには、スペクトルをコピーして適切なファイル形式に貼り付けます。
内因性CENP-Aの喪失を救うEYFP CENP-A野生型またはK124R変異体の遺伝子構築物は、レトロウイルス集積が行われたときに安定的に発現した。内因性CENP-Aの発現は、クレリコンビナーゼの誘導の7日後には検出されなかった。EYFP CENP-A野生型およびK124Rタンパク質発現の両方が、初期の内因性CENP-Aタンパク質と同様のレベルであることが判明した。
EYFP CENP-A野生型およびK124R変異体はいずれも、内因性CENP-Aの残りの発現の破壊後7日でセントロメア局在化を示した。EYFP CENP-A野生型およびK124R変異体は、フラグ付きタグ付きまたはタグなしCENP-A野生型およびK124R突然変異体の場合とは異なり、HJURPとのユビキタス化および相互作用を示した。細胞生存率は、残存する内因性CENP-Aアリールの破壊の14日後にコロニー成長アッセイを行うことにより評価した。
EYFP CENP-A野生型およびK124R変異体の両方が、残存する内因性CENP-Aアレーレの破壊の14日後に同様の数の救出されたコロニーを示した。IP質量分析法は、CENP-AマイナスF細胞のEYFP CENP-A K124Rのリジン306でのユビキタス性を明らかにした。これらの結果は、大きなタンパク質の融合が、元のK124R単一変異型表現型を阻害するCENP-AのK124R以外のリジンでのユビキタンス化を誘導することを示唆した。
このプロトコルを試す場合、市販の4%12%Bis-Trisタンパク質ゲルを使用して質量分析サンプルを実行します。ゲル部分に適切なトリプシンを加え、すべての酵素が吸収されるまで水分補給します。低分子量タグ付けまたはプロービング技術は、実際にはユビキタスを視覚化し、生物レベル全体で空間的時間的タンパク質のユビキタスシグナル伝達を調査するために必要です。
