このプロトコルは、異なる下流分析に使用することができ、異なる代謝産物のターゲットの範囲のためにカスタマイズすることができる精製ジテルペノイドを製造するのに適しています。この方法の主な利点は、特殊な代謝産物のミリグラム量を生成する簡単で安価な方法です.共発現に用いる遺伝子や酵素を交換することで、この方法を改変して、モノテルペノイドやセシテルペノイド、フラボノイドなどの代謝産物クラスを含む他のテルペノイドを生成することができます。
ジテルペノイド代謝産生および形質転換のために、化学的に有能な大腸菌細胞を氷上で温めることから始める。培養液が解凍されたら、1構築あたり25マイクロリットルのコンピテントセルを冷蔵1.5ミリリットルマイクロチューブに加え、共発現に使用される各構成体のマイクロリットル溶液当たり100ナノグラムの1マイクロリットルを加える。マイクロチューブラックを横切ってチューブを削ることによって、10分ごとに穏やかな混合で30分間氷の上に混合物をインキュベートします。
インキュベーションの終わりに、細胞混合物を摂氏42度で1分間熱ショックし、細胞を氷の上に少なくとも2分間戻します。次に、37°CのSOC培地を200マイクロリットルのチューブに加えます。そして、1時間の培養を摂氏37度、毎分200回転でインキュベートします。
インキュベーションの最後に、約10個のオートクレーブガラスビーズと100マイクロリットルの細胞を37°C温めたリソジニーブロス寒天プレートに適切な抗生物質を加えます。そして、均一に細胞を分配するために所定の位置に蓋をしてプレートを水平に振ります。その後、ガラスビーズを静かに廃棄物容器にタップし、一晩で37°Cでプレートをインキュベートし、表面側を下にコーティングします。
翌日、インキュベーターからプレートを取り出します。適切な抗生物質を使用して調製したリソゲニーブロス培地5ミリリットルを、計画された1リットル培養ごとにプラスチック通気性キャップを持つ15ミリリットルの無菌ガラスチューブ1つに加え、ピペットチップを使用して寒天プレートから個々の形質転換された大腸菌コロニーを選びます。準備された15ミリリットルのチューブのそれぞれに1つの選択されたコロニーを追加し、付随する通気性プラスチックキャップで各チューブをキャップします。
その後、キャップされた大腸菌の小さな文化を37°Cの振動インキュベーターに12〜24時間置きます。翌日、適切な抗生物質を用いて小さな培養物1リットル当たり1リットルのフラスコで900ミリリットルの素晴らしいスープに100ミリリットルの100ミリリットルを加える。そして、フラスコを摂氏37度、毎分140回転で約30分間置きます。
素晴らしいスープが暖かい場合は、各接種培養の5ミリリットルの体積全体を培養ごとに1リットルの培養フラスコに加えます。そして、約3時間毎分140回転で揺れインキュベーターにフラスコを置きます。600ナノメートルの光学濃度が0.6に達したら、インキュベーターの温度を16°Cに下げます。
インキュベーターが冷却されたら、1モルIPTGの1ミリリットル、1リットルリボフラビン当たり4グラムの1ミリリットル、各培養物に1リットル当たり150グラムの新鮮なアミノレブリニン酸を1ミリリットル加える。ジテルペノイドの生産のために、十分な前駆体形成を確実にするために、各培養物に1モルのピルビン酸の25ミリリットルを加える。次に、16°Cで培養し、1分間に140回転で72時間培養し、適切な培養物に毎日25ミリリットルのピルビン酸ナトリウムを加える。
代謝物の分離と精製のために、発煙フードのリングスタンドにセパレーター漏斗を固定します。そして、漏斗の下に廃棄物容器を置きます。セパネルに酢酸エチルとヘキサンの50/50溶液の500ミリリットルを注ぎます。
そして、漏斗に興味のある形質転換された大腸菌共発現培養物の500ミリリットルを加える。ファンネルにガラスストッパーを置き、漏斗を5〜10回振って抽出溶媒と培養を混合し、漏斗が逆さまになっている間に頻繁にスピゴットを開き、漏斗を脱気するために煙のフードに向けます。ちょうど示したように揺れと脱気の第二ラウンドの後、約1分間リングスタンドに漏斗を直立に置きます。
最上溶媒層が水性培養層から分離した場合、ストッパーを取り除き、大腸菌層を廃ビーカーに排出し、漏斗内に溶媒層を保持する。次いで、第1の抽出に使用した同じ500ミリリットルの溶媒を用いて培養液の残りの500ミリリットルで抽出を繰り返し、抽出した代謝物を含む溶媒をクリーンフラスコに排水する前に行う。ここでは、代表的な抽出酵素産物の代表的なガスクロマトグラフィー質量分析クロマトグラムが示されている。
一般的に観察されるマイナーな副産物には、クロラムフェニコールおよびインドール誘導体オキシンドールおよびインドールピバラアルデヒドが含まれる。シリカカラムクロマトグラフィーによるジテルペノイド精製後、ジテルペノイドスクラロールを用いた標準曲線に基づいて定量化した3種類のドラプラキシン化合物が得られる。シリカクロマトグラフィーは、高純度の目的化合物を達成するのに理想的です。
ジテルペンオレフィンと酸素化誘導体の簡単な調製が可能であり、シリカマトリックス上に保持されている主要な汚染オキシンドールを容易に除去します。また、テルペノイド経路遺伝子の共発現は、N.ベンタミアナでジテルペノイドを産生するために使用することができ、結果としてドラブラジエンおよび15、16エポキシドーラブレンの産生をもたらす。抽出中に使用される溶媒は、目的の代謝産物の物理的な化学的特性に合わせて最適化されるべきであり、2つの異なる層を維持するために水と混合可能であってはなりません。
この手順に従って、精製された代謝産物は、構造解析および抗生物質酸を含む下流分析に使用することができる。この技術は、ここに示されたものを含む新しいジテルペノイドの発見を可能にし、これらの代謝産物をその化学構造および新しい二種について分析することを可能にした。セパネルで有機溶剤を使用する場合は、注意してください。
ラボの安全基準に従って、必ず生物学的廃棄物を処分してください。
