我々のプロトコルは人工好中球細胞株モデルを使用する必要なしに生体内の腫瘍関連の一次好中球の血管新生潜在能力を評価するための新しいツールを提供する。ニコチンアミドホスホリボシルトランスセパーゼの直接阻害は、腫瘍関連好中球における腫瘍関連好中球における腫瘍関連性動物へのその後の導入移入により、全身性毒性副作用を伴わない好中球の操作を可能にする。異なるがんモデルにおける好中球ベースの免疫療法の可能性を研究するために、腫瘍を含む宿主に移管した後に操作された抗血管新生腫瘍関連好中球の治療可能性を実証する。
同種腫瘍マウスモデルを設定するには、10 8〜12週齢の女性インターフェロンアルファとβ受容体サブユニット1ノックアウトマウスの皮膚を電気剃りで剃り、70%エタノールで皮膚を消毒し、 その後、0.4 by 19ミリメートルの針を装備した1ミリリットルの注射器でPBSのミリリットル当たり6つのB16F10黒色腫細胞に3倍10をロードし、各剃った各剃り口に後部側面に100マイクロリットルの懸濁液を皮下注射して注入する動物。好中球養子転写の場合、B16F10メラノーマ細胞をPBS中のミリリットル当たり6倍の10〜6番目の細胞に希釈し、NAMPT阻害剤FK866で処理した好中球をPBS濃度の1ミリリットル当たり5番目の細胞に6倍に希釈する。次に、非処置または阻害剤処理された好中球を黒色腫細胞と1:10の好中球対腫瘍比で混合し、皮下100マイクロリットルの細胞を1群当たり最大5匹のマウスに注入する。
注射後、注射された雌マウスを1つのケージに入れ、キャリパーを使用して毎日14日間腫瘍の長さ、幅、深さを測定します。注射後14日目に、注入された各動物の皮膚を70%エタノールで消毒し、はさみと鉗子を使用して、氷の上に完全な媒体を含む50ミリリットルの円錐管に腫瘍を収穫する。組織学的分析のために腫瘍を切除するには、腫瘍を最適な切断温度化合物に沈め、液体窒素中のサンプルを氷結させてマイナス80°Cで貯蔵する。
断面の日に、5マイクロメートルのセクションを得るためにクライオトームを使用する前に、マイナス20°Cにサンプルを解凍します。非特異的結合で固定した後、20°Cで1時間対象となる一次抗体を有する腫瘍組織切片を染色し、続いてPBSで3回のスッシュを行う。最後の洗浄後、DAPIのような核染色染色体に適した蛍光結合二次抗体を光から保護した摂氏20度で1時間染色します。
インキュベーションの終わりに、無水の取り付け媒体でサンプルを取り付ける前に光から保護された20°Cでスライドを20分間乾燥させ、次にカバースリップで各スライドを覆い、取り付け媒体が37°Cで1時間乾燥してから、蛍光顕微鏡で組織をイメージングします。腫瘍関連好中球分離の場合、収穫時に滅菌された6ウェルプレートの個々の井戸に井戸あたり5つの腫瘍を配置し、滅菌はさみを使用して腫瘍を2〜3ミリメートルにミンチする。次に、1ミリリットルのディスパーゼコラゲナーゼd DNASe 1溶液で1ミリリットルのジスパーゼd DNAse 1溶液を湿度5%の二酸化炭素で摂氏37度で45分間消化し、15分ごとに10ミリリットルのシリンジとサンプルを混合する。
インキュベーションの最後に、100マイクロメートルのストレーナーを通して15ミリリットルのチューブにフィルターを入れ、未消化の繊維を取り除き、PBSを15ミリリットルの最終体積に加えます。遠心分離によって解光細胞を収集し、チューブあたり1ミリリットルのライシスバッファーで赤血球をライスします。混合後、各チューブの内容物を15ミリリットルのチューブに組み合わせ、2分後に完全な4°Cの培地で11ミリリットルで反応を停止します。
遠心分離後、PBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁し、氷上で15分間、Fcブロック抗体の3マイクロリットルで任意の非特異的結合をブロックします。インキュベーションの終了時に、抗CD11bおよびLy6G抗体および他の目的の抗体、およびDAPIを用いて、光から保護された氷上で30分間インキュベーションを行う。インキュベーションの終わりに、 細胞をPBSの14ミリリットルで洗浄し、氷上の新鮮な完全な媒体濃度のミリリットル当たり10倍の7番目の細胞にペレットを1回10回再懸濁し、標準的な選別プロトコルに従ってCD11b陽性、Ly6G、高DAPI陰性好中球を蛍光活性化細胞選別機で選別し、その流れの端で単離された好中球の純度をチェックする。
インビトロ腫瘍関連好中球阻害の場合、種子1.5倍10〜5番目の好中球を96ウェルU-底板の2つの井戸のそれぞれに分類し、FK866を完全な培地中の100ナノモルの最終濃度に加え、完全な培地の体積を他方のウェルに均等にする。培養インキュベーターで2時間経過した後、細胞をPBSで2回洗浄し、その後の注射に適した濃度でPBS中のペレットを再懸濁した。NAMPT阻害剤は、治療された好中球は、未処理の細胞と比較して大動脈枝形成を刺激する能力を有意に低下させる。
さらに、阻害剤処理抗血管新好中球の皮下注射は、未処理のインターフェロンαおよびβ受容体サブユニット1ノックアウト好中球を注射したマウスと比較して腫瘍増殖に有意な障害を誘発する。抽出された腫瘍の組織学的検査は、未治療のノックアウト好中球を注射したものと比較して、阻害剤治療された腫瘍関連好中球で治療されたマウスから単離された腫瘍における血管新生の有意な抑制をさらに確認する。FK866処理された腫瘍関連好中球の特性を評価するために、定量PCRおよびウェスタンブロットは、好中球分極に関与する細胞内経路の活性化を研究するために行うことができる。
好中球は短命であるため、すべてのステップをできるだけ早く実行し、全手順中に好中球を冷たく保つ必要があります。この技術は、生体内の腫瘍関連好中球の血管形成および腫瘍形成特性の調節に関与する細胞内メカニズムおよび因子の研究に道を開く。
