ヒト小島の遺伝子発現を調節することは困難であり、また、機能するヒト小島の減少は、遺伝子発現の調節後に大きな課題をもたらす。レンチウイルスを介してSHR8導入とヒト適当な小島の形成を組み合わせることにより。このプロトコルは、長期培養中に小細胞機能を維持しながら、標的遺伝子の効率的なダウンレギュレーションを可能にする。
まず、出荷ボトルをそっと旋回して島をサスペンションに入れます。50ミリリットル円錐形遠心分離管に島を含む輸送媒体を移します。小島がチューブの底に落ち着くように、チューブを生物学的安全キャビネットに15分間座らせます。
島のペレットを邪魔することなく、キャピラリーピペットを使用して、出荷媒体を優しく取り除きます。1ミリリットル当たり400個の島液換算の濃度に1%ヒト血清アルブミンを有するCMRL培地中の島ペレットを再懸濁する。小島を非組織培養処理皿に移し、一晩5%の二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で培養する。
一晩培養した後、人間の小島を15ミリリットル円錐形遠心管に移し、250倍gで遠心分離機を5分間振るバケットローターで行う。そして、島ペレットを乱すことなく毛細管ピペットで培地を吸引する。ペレットをチューブに10ミリリットルのPBSを加えて洗い、250倍gで5分間静かに遠心分離機を混ぜます。
遠心分離後、島ペレットを乱さずにPBSを吸引する。ペレットを、あらかじめ温めたタンパク質分解酵素およびコラージュ分解酵素混合物の0.5ミリリットルに再懸濁します。ピペットは、ピペットを5回使用して、小島を混合するピペットを使用する。
摂氏37度で5分間インキュベートします。インキュベーションの後、ピペットを上下に軽く混ぜます。単一細胞の曇りや、フレークまたは未消化の小島の数を確認します。
35ミリメートルのシャーレに40ミクロンのストレーナーを入れ、10%の熱不活化牛血清でCMRL培地1ミリリットルを加え、1ミリリットルのシリンジプランジャーで落ち込んでストレーナーを濡らします。ストレーナーの上にすべての細胞懸濁液を移します。そして、新鮮な15ミリリットルのチューブに通過を収集します。
新鮮なCMRL培地の0.5ミリリットルで小子消化に使用されるチューブを洗浄し、残った細胞を収集し、ストレーナーを通して洗浄を渡します。15ミリリットルのチューブに通過を組み合わせます。1 回繰り返します。
ストレーナーに残っている未消化の小島を解震するには、ストレーナーに1ミリリットルのシリンジプランジャーを押します。もう一度通過を収集し、ストレーナーと皿から残りのすべての消化された小島を削除するために、新鮮なプレーンCMRL 1066培地でストレーナーを洗います。15ミリリットルのチューブにパスを追加します。
細胞懸濁液の総体積を記録し、10マイクロリットルの細胞アリコートを取り、ヘモサイトメーター上の細胞数を数える。細胞懸濁液を200回gで5分間遠心した後、ペレットを乱さずに培地を取り除く。96ウェル超低添付プレートを用いて擬似小島を生成するために、まず、単一細胞懸濁液のミリリットル当たり10〜5番目の細胞に必要な総体積を算出する。
次いで、30マイクロリットルの細胞懸濁液が3000個の細胞を有するように、10%熱不活化牛胎児血清を用いてCMRL培地中の小島ペレットを再懸濁する。次に、単一細胞懸濁液の必要量を15ミリリットルの新鮮なチューブに移す。目的の遺伝子または対照を標的とするSH-RNAを含むレンチウイルスの細胞当たり250の伝達単位で。
ウイルスと細胞懸濁液を混合するために、P1000ピペットでピペットを5回穏やかにする。その後、8チャネルピペットを使用する場合は、混合細胞を50ミリリットルの滅菌試薬リザーバーに移します。8チャンネルピペットまたはP200ピペットを使用して、レンチウイルスと混合した細胞懸濁液のウェルあたり30マイクロリットルを各ウェルに分配します。
次に、96ウェルプレートを室温で270倍gのスイングバケットプレート遠心分離機に7分間遠心する。加湿した5%の二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で培養。インキュベーション後、インキュベーターから96ウェルプレートを取り出し、生物学的安全キャビネットに入れなさい。
ピペット100マイクロリットル100マイクロリットルの10%高FBSCMRLを井戸に入れ、小島の乾燥を防止し、1週間培養を続ける。貯留層から疑似小島およびピペットに10%の不活化胎児ウシ血清を有するCMRL培地のウェル当たりピペット100マイクロリットルは、ウェルで2〜3回穏やかに上下して小島を持ち上げる。次いで、疑似小水を含むウェル内の培地を吸引し、10センチメートルのシャーレに排出する。
すべての疑似小島を完全に取り除くかどうかを確認するために、光学顕微鏡でプレートを確認し、下流の実験に進みます。24ウェルマイクロウェル培養プレートを使用して擬似小島を製造するには、まず、抗付着リンス溶液のウェルあたり500マイクロリットルを加えます。振るバケットプレート遠心分離機で5分間1300回gで遠心分離機。
次に、マイクロウェルから気泡を取り除くために、顕微鏡でプレートを観察します。生物学的安全キャビネットでは、ウェルから抗付着リンス溶液を吸引する。2ミリリットルの温かいプレーンCMRL 1066培地を1回ずつよくすすいでください。
次いで、プレーンCMRL1066培地を吸引し、10%熱不活化ウシウシ血清を用いた温かいCMRLのウェルあたり0.5ミリリットルを使用予定の各ウェルに加える。各ウェルに必要なセルの総数を決定します。滅菌1.5ミリリットルチューブで10%熱不活化胎児ウシ血清でCMRL培地の0.8ミリリットルで単一細胞を再懸濁します。
レンチウイルスによってトランスデューティされる擬似アイレットの1つの井戸を作成するには、1細胞当たり125のトランスダクションユニットを1細胞懸濁液に加え、ウイルスの量を0.2ミリリットル以下に抑えます。細胞とウイルスの混合物を摂氏37度で1時間穏やかに混合してインキュベートし、細胞の凝縮前にウイルスとの接触を可能にする。1時間後、10%の熱不活化ウシウシ血清でCMRL培地を添加することにより、1ミリリットルに小口細胞およびウイルス混合物の総体積を調整する。
細胞が1時間後に塊を形成する場合、2〜3回穏やかで迅速なピペット処理によって単一の細胞懸濁液に分散する。細胞懸濁液を24ウェルマイクロウェル培養プレートの1つのウェルに移します。ピペット処理の直後に、室温で100倍gの遠心分離機を3分間、すべてのマイクロウェルに細胞を捕捉する。
顕微鏡で観察し、細胞がすべてのマイクロウェルに均等に分布していることを確認します。小地の単細胞懸濁液をウェルに混合してよく加えた直後にマイクロウェルプレートを遠心分離することが重要です。96ウェル超低添付着プレートで作成された3000個のヒト小島細胞からの疑似島の形態の連続的な変化は、1週間で滑らかな丸い境界を持つ固体凝集体に変わった細胞の単層または緩い塊を示した。
対照的に、マイクロウェル培養プレートでは、わずか500個の島細胞からの細胞および疑似小島の形成は、通常4日以内に見える。擬似小島の均一なサイズはテストグループ内の変動を減らし、測定ごとにわずか5個の疑似小島を使用して静的インキュベートを可能にします。インスリン応答のためのペリー融合アッセイは、培養7日後のグルコースに応答してヒト擬似小島が堅牢な第1相インスリン分泌を維持することを示した。
ヒト脂肪トリグリセリドリパーゼまたはペリリピン5遺伝子を標的とするレンチウイルスを単一細胞懸濁液に導入することにより、イレット細胞の効率的かつ均質な転移が保証され、遺伝子の極めて効率的なダウンレギュレーションが実現されます。ヒトの小地を単一細胞に分散するのに要する時間は、サイズ、分布、ドナー特性などの多くの要因によって影響を受けることを覚えておくことが重要です。だから、消化中に人間の島の消失に細心の注意を払うことが重要です。
プロトコル全体を通して、細胞の損失を避けるために、単一セルの懸濁液を穏やかに処理することが重要です。作成されているヒト擬似小島は、例えば、ウェスタンブロット、組織学的研究、酸素消費率の測定などの遺伝子変調の効果を決定するために、多くのアプリケーションに使用することができます。このプロトコルは、一般的なラボウェアと簡単な技術を使用して、島の健康とヒト島の機能の調節における標的遺伝子の低さを評価することができます。
人間の島の使用は、地元の審査委員会からの事前承認を必要とする場合があります。調査を開始する前に、現地の審査委員会に相談してください。レンチウイルスは、バイオセーフティレベル2に分類される。
レンチウイルスの使用開始前にバイオセーフティ委員会に連絡してください。
