ライブラリースクリーニングと呼ばれる当社のプールsgRNAは、ゲノム全体の非コード要素の生物学的機能を同定し、評価するための強力な遺伝的アプローチです。この技術により、関連する結合部位、色彩境界、または他の調節要素が標的遺伝子発現に及ぼす影響を調べることができます。我々のアプローチは、CTCF、長い非コードRNAおよびエンハンサーの役割を同定するために使用することができ、初期胚発生におけるHOX遺伝子調節におけるならびに異常なHOX遺伝子シグネチャを有する特定の白血病である。
CTCF結合部位を標的とするsgRNAの設計からこの手順を開始する。テキストプロトコルに記載されているように細胞調製におけるsgRNAライブラリーのクローニング。レンチウイルスをパッケージ化するために、コトランスフェクトHEK293 T細胞は、精製されたライブラリーベクター20マイクログラム、パッケージ化されたプラスミドの15マイクログラム、およびエンベローププラスミドの10マイクログラムを含み、ウイルスを収穫する前に48時間培養した。
48時間後、ウイルス上清を収集し、0.45ミクロンの低タンパク質結合PVDF膜を介してそれをフィルタリングします。次に、レンチウイルス上清を濃縮器を用いて50倍に濃縮する。濃縮ウイルスをアリコートし、マイナス80度の冷凍庫に保存します。
12ウェルプレートの別々のウェルで作業し、MOLM13細胞と濃縮レンチウイルスの様々な用量を6つの合計グループに混合します。これらの混合物を摂氏33度で2時間1000倍にして直ちに遠心する。12のウェルプレートを摂氏37度でインキュベーターに戻し、5%の二酸化炭素を4時間移します。
細胞パレットを乱さずに上清を優しく吸引し、新鮮な補充RPMI 1640培地でトランスデューセド細胞を再中断する。その後、再懸濁した細胞をT25フラスコに移し、ピューロマイシンなしで48時間摂氏37度でインキュベートする。48時間後にこれらの細胞を2つのフラスコに分割した後、5日間1ミリリットルのピューロマイシンで1マイクロリットルで処理した実験群と、5日間のピューロマイシン処理を行わない対照群を用いた。
プロマイシン処理を行った生細胞数を、ピューロマイシン処理のない細胞数で割って、トランスダクションに対する最適化されたMOI値を測定します。プールされたライブラリーを使用して細胞をトランスデュースするには、培地中のsgRNAプールレンチウイルスの0.3 MOIで6ウェルプレートに150万MOLM13細胞を感染させる。レンチウイルス感染のない細胞をコントロールとして使用してください。
すぐに6つのウェルプレートを1000倍gで33°Cで2時間遠心分離し、細胞をスプステッとして感染させる。その後、プレートを5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベーターに4時間戻します。細胞パレットを乱さずに優しく上清を吸引し、新鮮な培地でトランスデューセを再中断する。
その後、細胞をT25フラスコに移し、ピューロマイシンなしで48時間摂氏37度でインキュベートする。48時間後、5日間、1ミリリットルのピューロマイシン当たり1マイクログラムで細胞を処理します。2日後に新鮮な培地と交換し、最適な細胞密度を維持します。
希釈法を制限して、単一クローンを96ウェルプレートにシードします。これらの単一クローンを摂氏37度と5%の二酸化炭素でインキュベートする。3-4週間培養します。
0.4%トリパンブルー溶液染色でSGRNA統合MOLM13細胞を数え、その後、96ウェルPCRプレートにウェルあたり10,000個の生きた細胞を移します。プレートを1000回gで5分間遠心し、ピペットで上清を十分に取り除いて捨てます。セルパレットを乱さないようにします。
テキストに記載されているように細胞を洗浄した後、各ウェルに細胞ライシスマスターミックスの50マイクロリットルを追加します。ピペットを上下に5回、セルパレットを再中断します。ミックスを室温で10分間インキュベートします。
その後、混合物を摂氏37度に5分間、さらに5分間摂氏75度に移します。次に、RT qPCR反応ミックスを含むPCRウェルに細胞ライセートの1マイクロリットルを加えます。このミックスには、前方および逆プライマー、逆転写酵素およびワンステップ反応ミックスのマーカー遺伝子が含まれる。
逆転写反応を摂氏50度で10分間実行し、続いて重合活性化を行い、95°Cで1分間DNA変性を行います。テキストプロトコルで詳述されているようにPCR反応の40サイクルでRT PCRを実行します。テキストプロトコルに記載されているように、サンガーシーケンシングを通じてHOXA9の発現クローンの減少を確認し、MOLM13ゲノムDNAを用いてPCRを行います。
PCR精製キットで PCR 製品を抽出し、精製します。精製PCR産物をT4ライゲーションバッファー、TベクターDNA、PCR DNAおよびT4リガーゼを用いてTベクターにリゲートします。ライゲーションミックスを一晩摂氏16度のインキュベーターに入れます。
ライゲーションミックスをDH5アルファのコンピテントセルに移し、LBアンピシリン抗生物質寒天板にプレートを入れ替えます。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。LBプレートから単一のクローンを選び、ジェノタイピングとサンガーシーケンシングで検証します。
200ナノグラムのリファレンスを持つヘテロデュプレックス混合物群を、0.2ミリリットルPCRチューブに200ナノグラムのPCRアンプリコンをテストします。400ナノグラムの参照PCRアンプリコンのみをコントロールとして含むホモデュプレックス混合基を含める。別に800ミリリットルの水で満たされた1リットルのビーカーで摂氏95度でヘテロデュプレックスとホモデュプレックス混合物を5分間インキュベートします。
次いで、混合物を徐々に室温まで冷却してアニールし、ヘテロデュプレックスまたはホモデュプレックスを形成する。さて、アニールヘテロデュプレックスとホモデュプレックス混合物の400ナノグラムをインデル変異検出ヌクレアーゼの1マイクロリットル、60分間摂氏42度で2マイクロリットルのヌクレアーゼ反応バッファーを別々に消化する。消化されたサンプルをアガロースゲル電気泳動で分析します。
ヘテロデュプレックス混合物DNAは小さな断片に切断されるべきであり、ホモデュプレックスDNAは切断されるべきではない。MOLM13陽性クローンを標的とするsgRNAは、コントロール細胞との比較を用いたHOXA9遺伝子の発現レベルに基づいて、RT qPCR法で確認された。スクリーニングされた528の生き残ったクローンのうち、10クローンはHOXA9レベルで50%以上の減少を示した。
HOXA9に統合されたsgRNAは、クローンを変更せずにHOXA9を増加させたが、さらにサンガー配列によるsgRNAのPCR増幅および同定によって確認された。HOXA9レベルの減少を示す10クローンのうち6個は、サンガーシーケンシングによって決定されるように、CBS79サイトを標的とするsgRNAを含んでいた。統合sgRNA陽性クローンのインデル突然変異は、PCRベースのジェノタイピングおよびヌクレアーゼ消化によって決定された。
HOXA7とHOXA9遺伝子の間に位置するCTCF部位のヘテロ接合性欠失を、PCRベースの遺伝子型生成によって同定した。HOXA9減少クローン5、6、28および121は、CBS79境界位置に欠失を示した。同様の結果は、ヌクレアーゼ消化アッセイによって分析されたCBS79部位のインデル突然変異について観察された。
この手順を実行する場合、ヌクレアーゼ消化アッセイを通じてsgRNA誘発インデル突然変異を検出するために、同量のヘテロ二重鎖とホモデュプレックスを等量にすることが重要です。我々のアプローチは、選択したマーカーの利用を可能にし、標的遺伝子に対する次世代シーケンシングを行い、白血病発生に対する遺伝子の影響を発見する。全体的に我々のアプローチは、正常な生物学的プロセス中の機能的正しい、および指摘された遺伝的不規則元素の減少と死後のゲノムプロジェクトエラーにおける白血病を防ぐ。
