プロテアーゼは、学術研究および産業研究における生体分子支援の最も調査されたグループの1つです。いくつかの生理学的および病理学的プロセスにおける彼らの強力な役割は、彼らに同様に創薬の分野で顕著なターゲットになります。その集中的な研究に関しては、時間とコストを節約する高スループットのスクリーニング適合性蛍光プロテアーゼアッセイプラットフォームの開発に対する大きな継続的な需要があります。
ここでは、mTurquoise2とmApple融合融合プロテアーゼ基質の両方を用いた分離ベースのハイスループットスクリーニング適合蛍光アッセイプラットフォームの応用プロトコルを紹介する。また、SDS-PAGEを変性した後の基質のインゲル化とアッセイサンプルの切断断片の解別方法を実演したい。すべての実験は、HIV-1ウイルスプロテアーゼの例で行われる。
発現プラスミドは、ヘキサヒスタジンアフィニティータグとマルトース結合融合タンパク質のコード配列を運び、続いてタバコエッチウイルスプロテアーゼの制御切断部位、クローニングカセット、およびC末端蛍光タンパク質を運ぶ。PacIおよびNheI制限エンドヌクレアーゼによって発現プラスミドを線形化する。PacIとNheI凝集端によって目的とする基質配列とフランクをコードする前方および逆オリゴヌクレオチドプライマーを最適化したエシェリヒア・コリコドンのアニーリングを行う。
結紮によって線形化発現プラスミドにアニールプライマーを挿入する。タンパク質発現の場合は、ライゲーション混合物によりBL21(DE3)コンピテント細胞を変換します。蛍光タンパク質は、結紮が成功した後にのみ、N末端融合タグと同じオープンリーディングフレームになります。
変換の数日後、目的の挿入切断部位をコードする発現プラスミドを含むコロニーは、ダークリーダーブルーのトランスイルミネーターを使用する有無にかかわらず、可視蛍光を示す。50ミリリットル遠心分離管に1ミリリットルアンピシリンあたり100マイクログラムを含む5ミリリットルLB培地に目的の切断部位配列をコードする発現プラスミドを運ぶBL21(DE3)細胞の10マイクロリットルのグリセロールストックを加える。絶えず揺れながら、サスペンションを37度で15時間インキュベートします。
5ミリリットルの細菌培養物を、ミリリットルアンピシリンあたり100マイクログラムを含む新鮮なLB培地に移す。600ナノメートルの波長で0.6〜0.8の吸光度に37度で細胞を成長させます。この時点で、IPTGを添加してタンパク質発現を誘導する。
以降、連続的に振りながら37度で3時間培養する。インキュベーション後、培養物25ミリリットルを清潔50ミリリットル遠心管に移し、遠心分離により細胞を収穫する。上清を捨て、少なくとも1時間はマイナス70度で細菌細胞ペレットを保管します。
正常に発現した蛍光タンパク質を含む細胞ペレットは、ダークリーダーブルーのトランスイルミエーターを使用した場合または使用しなくても蛍光を明確に示す。凍結した細胞ペレットを氷の上に置き、15分間解凍させます。ペレットに2ミリリットルのライシスバッファーを加え、細胞を一時停止します。
以下、プロテアーゼ阻害剤を添加し、リゾザイム及びDNaseにより懸濁液を解放し、細胞を懸濁し、懸濁液を氷上で15分間インキュベートする。1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に1ミリリットルのサスペンションを2回移し、10秒間の超音波処理と5秒の休憩のラウンドで3分間のサスペンションを超音波処理します。チューブを室温で20分間10,000gで遠心分離します。
目的の蛍光基質を含むクリアされた細菌細胞ライセートは、ダークリーダーブルーのトランイルミエーターを用いることなく、あるいは使用せずに目に見える蛍光を示す。開発されたプロテアーゼアッセイの手順は、アッセイサンプルの調製から始まります。まず、組換え基質は親和性磁性ビーズと共にインキュベートされ、かつ基板に付着した磁気ビーズは、MMBと略して形成される。
Sambを数回洗浄し、最終的にSAMBストック溶液は、アッセイサンプルが作成されるアリクォートによって調製される。反応はプロテアーゼ溶液の添加により初期化される。プロテアーゼによる切断時に、タンパク質分解断片が上清に放出される。
反応は、蛍光切断生成物と酵素を含む反応バッファーからの磁気ビーズの分離によって終了する。上清はマイクロタイタープレートのウェルに適用され、蛍光は蛍光法によって決定されます。校正曲線は、各アッセイバッファーで解決された精製蛍光基材を使用して生成されます。
C末端蛍光切断産物の濃度およびまたアッセイサンプル中の適用された基質の濃度は、較正曲線の傾きに基づいて決定される。新しいまたはリサイクルされたニッケル-NPA磁気アガロースビーズを含むチューブを磁性粒子濃縮器に入れる。ビーズは、壁やマイクロ遠心管の蓋に付着することがあります。
したがって、すべてのビーズが収集されるように、コンセントレータをあらゆる方向に逆さまにします。上清を取り除き、捨てます。ビーズに1.8ミリリットルのライシスバッファーを加え、コンセントレータから閉じたチューブを取り除きます。
ビーズが完全に均一になるまでチューブを振ったり、逆さまにしたりして、チューブ内のビーズを吊り下げます。チューブをコンセントレータに戻し、あらゆる方向に逆さまにして、すべてのビーズが収集されるようにします。チューブを開き、上清を捨てます。
目的の基質を含む除去細菌滅菌ライセートを追加し、濃縮器から閉じたチューブを除去します。ビーズが完全に均質になるまでチューブを上下に逆さまにし、ローテーターでゆっくりと30分間チューブを回転させます。SMBは、ダークリーダーブルーのトランスイルミエーターを使用する場合でも、あるいは使用せずに目に見える蛍光を示します。
SMBを1.8ミリリットル1%Tween 20、洗浄バッファー、および切断バッファーで3回洗浄します。洗浄されたSambsに切断バッファーを追加して、SAMB ストック溶液を作成します。2ミリリットルタンパク質低結合マイクロ遠心分離チューブを使用する場合、適用される切断バッファーの体積は最大 1.9 ミリリットルです。
バッファーを追加した後、チューブを逆さまに振ったり、逆さまにしないでください。チューブを閉じてコンセントレータから取り外します。アッセイサンプル用に2ミリリットルのタンパク質低結合マイクロ遠心分離チューブを用意します。
SAMBストック溶液が完全に均一になるまで一時停止し、SAMBストック溶液をサンプルバイアルに直ちに移すことで反応で分析する基質の量を測定します。転送されるSAMBストック溶液の体積は25~300マイクロリットルにすることが推奨されますが、個々の実験計画に従って設定する必要があります。サリクォートされた SAMB 懸濁液を含むサンプルチューブをコンセントレータに入れる。
慎重にSMBから上澄を削除し、それを破棄します。コンセントレータからチューブを取り外し、慎重に反応バッファーをMMBに追加します。添加した反応バッファーの体積は、個々の実験計画に従って計算されるが、2ミリリットルチューブを使用する場合は50~150マイクロリットルの反応混合物の最終体積を設定することが推奨される。
チューブの蓋を閉じます。これで、サンプルは初期化の準備が整いました。酵素溶液を反応サンプルに加えます。
チューブを軽く動かしてビーズを慎重にかき混ぜ、すでに揺れているサーモシェーカーにチューブをすぐに入れます。基板ブランクサンプルおよび基質制御サンプルの場合は、それぞれ切断緩衝液および溶出バッファーを添加する。インキュベーション終了の30秒前に、サーモシェーカーからサンプルを取り出し、速やかに回転させます。
チューブをコンセントレータに置き、チューブを15秒間放置します。DCB のコレクションは、コンセントレータをわずかに前後に移動することによって容易にできます。蓋を開け、上清をプレートまたは新しいチューブに慎重に移します。
ピペットの先端で濃縮ビーズに触れないでください。集めた基板制御サンプル及び高い切断を有する反応試料の集められた上清は、ダークリーダーブルーのトランイルミネーターを用いることなく、あるいは使用せずに、目に見える蛍光を示し得る。分離したサンプル上清の30マイクロリットルを黒い半面積マイクロプレートに2回移す。
適用された蛍光タンパク質に従って適切なフィルターを使用して蛍光計で蛍光を測定する。蛍光基材の精製のために、前述と同様の溶液を調製し、上清を廃棄する。400~600マイクロリットル溶出バッファーをSambsに加え、室温でゆっくりと回転させてチューブを5分間回転させます。
溶出物を新しいタンパク質低結合マイクロ遠心分離チューブに移します。ダークリーダーブルーのトランスイルミエーターを使用する有無にかかわらず、はっきりと目に見える蛍光を示す。精製後、バッファー交換、およびタンパク質含有量の測定は、溶出バッファーと切断バッファーを解決した基質溶液の両方から、希釈用の溶出または切断バッファーを使用して、少なくとも 8 段階で 2 倍の連続希釈を調製する。
各希釈点の30マイクロリットルを黒い半面積マイクロプレートに移します。測定サンプル上清の測定に適用したのと同じ設定を使用して、蛍光計で蛍光を測定します。データ処理の例として、HIV-1プロテアーゼの基質依存性運動学的測定を、天然のギャップタンパク質前駆体におけるマトリックスとキャプシドタンパク質との間の切断部位をコードする組換え基質のmTurquoise2融合型で行った。
精製された基質のモル濃度に対して補正された相対蛍光強度値をプロットし、切断または溶出バッファーのいずれかを解決し、線形回帰を実行します。切断バッファーベースの較正曲線の傾きを使用して、反応サンプル中の C 末端切断生成物のモル濃度を計算します。また、溶出バッファーベースの較正曲線の傾きを用いて、基質制御試料中の溶出基質のモル濃度に基づいて反応サンプル中の適用基板濃度を算出する。
初期速度値は、C末端切断断片の量から計算し、次いで適用された基質濃度に対してプロットした。また、運動パラメータはミカエル-メンテン非線形回帰分析によって決定された。ニッケルNTA磁気ビーズベースのアッセイを行った後、アッセイ上清はポリアクリルアミドゲル電気泳動法によっても分析することができます。
しかし、アッセイサンプルの分析の他に、精製された蛍光基質および/または溶液中消化後の切断断片を分析することも可能である。溶液中消化のために、1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに切断バッファーに溶解して消化される精製された蛍光基体をアリクォートし、サンプルに酵素溶液を加える。実験計画に従ってサンプルをインキュベートし、PAGE用のサンプル調製の手順によって反応を終了する。
非変性サンプル調製の場合、分析するサンプルを還元剤を含みない非否定サンプルローディングバッファーと混合します。変性サンプル調製の場合、分析するサンプルを変性サンプルローディングバッファと混合し、サンプルを95度で10分間熱処理に曝します。非変性および変性したサンプルをSDSポリアクリルアミドゲルのウェルに塗布し、電気泳動を行います。
ランニングモジュールからゲルカセットを取り出します。非変性サンプルは、肉眼でもダークリーダーブルーのトランジミネータでもゲル内にすでに見えます。トランスイルミネータ上の変性サンプルの蛍光成分を検出するために、SDSをゲルから洗い出してインゲル化を行う。
ゲルに100ミリリットルの蒸留水を加え、少なくとも30分間すすいでください。未染色ゲルをダークリーダーブルーのトランジミエータに配置して、蛍光タンパク質を可視化します。組換え蛍光融合タンパク質を、タンパク質分解アッセイの基質として用いるように設計した。
特定の切断部位でプロテアーゼによる切断時に、C末端蛍光切断断片が放出され、その蛍光が検出される。ニッケルNTA磁気ビーズベースのアッセイでの使用とPAGE分析による蛍光検出は、HIV-1プロテアーゼを用いて最適化されています。しかし、開発されたアッセイプラットフォームは、他のプロテアーゼにも適しています。
切断または溶出バッファーで解かれた精製基質の較正曲線は、天然HIV無響性タンパク質のマトリックスとキャプシドタンパク質との間の切断側をコードする組換え基質の mTurquoise2-mEYFP 融合形態の両方の例に示されている。ニッケルNTA磁気ビーズベースアッセイは、反応速度に対する基質濃度の影響を調べる有用なツールであり、VmaxやKmなどの酵素運動パラメータの決定も可能です。図Aは、mApple融合基板上で基板依存性の活性を解析した後に得られた最適な結果を示す。
これに対し、図Bは、SAMBストック溶液の均質化が不十分な場合に適切な基質濃度の設定に問題が生じ、反応サンプルの不適切な終了が比較的高い誤差をもたらす最適な結果を提示する。アッセイはまた、同様に時間コースおよび阻害研究を行うための適切なツールを提供します。図AはmEYFP融合基質上でのHIV-1プロテアーゼのタンパク質分解性切断の時間依存性を示し、図Bは切断反応に対するアンプレナビルの阻害効果を表す。
阻害試験により得られたデータから、活性酵素濃度と阻害定数の両方を決定することができる。アッセイはまた、タバコエッチウイルスプロテアーゼの例に図Aで表されるように、pHに対する酵素活性の依存性を研究するために最適化することができる。図Bは、pHによるアッセイの制限を示し、中性またはわずかにアルカリ性pHが測定と完全に適合していることを示し、酸性pHは磁気ビーズの表面からの基質の自発的な解離を促進する。
本図は、精製されたインタクト蛍光基質、蛍光C末端切断断片を、HIV-1プロテアーゼによる溶液内消化によって生成したものである。蛍光成分は、試料調製中に非変性条件を適用した場合、電気泳動直後に青色光トランスイルミネーションによりSDS含有ポリアクリルアミドゲルで検出することができる。異なる蛍光タンパク質は、その色に基づいて分化することができます。
磁気ビーズベースのアッセイの後、試料上清中の非変性蛍光タンパク質をUV照明によってゲル内でも検出することができます。対照的に、サンプル調製中に変性条件が適用される場合、変性タンパク質はSDS PAGEの直後にゲル内で検出することはできません。しかし、変性蛍光タンパク質は、ゲルからSDSを除去することによって部分的に再自然化され、検出可能になる。
したがって、SDS PAGEは、インゲルリナーテーション手順が続きます。蛍光タンパク質のレナージション能力は、蛍光だけでなく、その分子量に基づいて同定可能になります。ここでは、最近開発された磁気ビーズベースの蛍光プロテアーゼアッセイプラットフォームの使用プロトコルを実証しました。
我々は、HIV-1プロテアーゼに関する酵素動態研究の例にこのシステムの使用を実証した。プロテアーゼの切断部位配列を含む組換えアッセイ基質のmTurquoiseとmApple融合形態を用いた。蛍光分析以外にも、アッセイサンプルはSDS PAGEによっても分析された。
変性蛍光タンパク質は、基質とタンパク質分解フラグメントの蛍光および分子量の両方を同定するSDS PAGE後のゲル中で部分的に再自然化できることを実証しました。
