Name: in vitro canine neutrophil extracellular trap formation: dynamic and quantitative analysis by fluorescence microscopy
Uploaded: 2018-08-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
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対応する著者モリス動物財団 (D15CA-907) によって資金を供給されました。研究は、カリフォルニア大学、デービス、馬の健康センター、コンパニオン動物保健センターからの資金によって支えられました (2016-24-F)。著者は、数字とギー グエンについて彼女のビデオで彼女の援助ジーナ Ng を認めたいと思います。

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアとカリフォルニア大学デービス校利用委員会によって承認された (プロトコル番号: 18338)。
1. 採血
<ol><li>21 G 針を用いた注射器吸引頭部または頸静脈いずれかから 10 mL の血液を描画します。</li>
	<li>過剰な剪断応力を避けるためには、血液をヘパリン ナトリウム (75 USP) を含む尿管に転送する前に注射器から針を削除します。やさしく数回チューブを転倒させる抗凝固剤と血液の適切な混合を確実にします。氷の上にサンプルを置く前に血栓や赤血球凝集体の証拠を確認します。</li>
</ol>2. 好中球の隔離
<ol><li>冷たい Dubecco のリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) (pH 7.4、二価のカチオン類なし) の等量と高血圧症血液を希釈します。(0.9% 塩化ナトリウム溶液中に溶けてロイコノ ストック属属) から 3% デキストランの 25 mL を含む 50 mL ポリプロピレン円錐管に希釈血液を 8 mL を転送します。集計と赤血球の沈降を許可する 30 分間室温で直立管を配置します。</li>
	<li>5 mL 14 mL ポリプロピレン製丸底チューブで密度勾配メディアの上にレイヤー白血球・血漿 (図 1) の 5 mL の慎重に。2 ソリューション11を混在させないよう注意します。</li>
	<li>400 x g加速/減速を室温で 30 分間 0 (ブレーキなし) (A/D) セットでチューブを遠心します。</li>
	<li>血清ピペット 5 mL を使用してプラズマと末梢血単核球 (PBMC) の層 (図 1) をバイパスすることにより顆粒細胞層を収集します。汚染を最小限にするたびに新しいピペットを使用します。</li>
	<li>核 (PMN) 細胞層の 4 に 6 mL を 50 mL ポリプロピレン円錐管に配置します。赤血球集合体の少量は、多形核白血球層と共に吸気可能性があります、ので管の底で決済している赤血球凝集体を取り除きます 1 mL の血清ピペットを使用します。</li>
	<li>冷たい純水 20 mL と残りの赤血球を溶解させます。複数回 30 〜 60 のチューブを軽く反転冷たい 1.8% 塩化ナトリウム溶液の等しい量を追加する前に適切な溶解を確認します。</li>
	<li>4 ° C で 10 分間、0 A/D セット 112 x gで遠心分離機します。</li>
	<li>このペレットが赤表示されている場合は、赤血球溶解手順を繰り返します。血清ピペットを使い、慎重に上澄みを廃棄し、優しく DPBS (デキスト ロース 5 mM、0.9 mM MgCl2、1.9 mM CaCl2および 1% ウシ血清アルブミン、pH 7.3) を 100 μ l 添加でペレットを再懸濁します。すべての再懸濁細胞を組み合わせるし、氷の場所します。</li>
	<li>自動細胞分析装置を使用してセル数を数えるため、検定によって数を確認してください。必要に応じて、(1,000 rpm, 5 min) の収集を使用してスライド ガラスに Pmn を集中し、セルの合計数のうち好中球の数をカウントすることによって好中球の割合を決定します。</li>
	<li>Stroberらに従ってトリパン ブルー色素排除試験を実行することによって好中球の生存を確認します。12 100 %95 から、生存率をもたらすべきである分離を成功させると、好中球が 95% 以上にする必要があります。</li>
	<li>% 生存率と好中球 % 総セル数を掛けることによって好中球の濃度を決定します。分離を成功させるは、6 x 106/mL に 1.5 から好中球濃度を得られるはず。</li>
	<li>Ph 7.3 に調整 5 mM デキスト ロース、0.9 mM MgCl2、1.9 mM CaCl2、および 1% ウシ血清アルブミンを含む DPBS で 1 x 106/mL の最終的な集中に好中球を希釈します。</li>
</ol>3. ライブ好中球蛍光顕微鏡
<ol><li>多 L リジンの各ウェルに好中球 (1 x 106/mL) 400 μ L に場所 200 コーティング 12 ウェル培養プレートです。アドロイに 30 分の 37 ° C で井戸の底に付着する好中球を許可します。</li>
	<li>1 μ m の 2 つの核酸の染料の一つ、汚れをそのまま膜細胞の 1 つ、1 つは細胞透過性膜 (材料の表を参照してください)、室温で 10 分間で汚れ、核酸のラベルを付けます。</li>
	<li>100 μ g/mL リポ多糖 (LPS) (大腸菌O55 と好中球をアクティブにします。B5)、100 nM ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) 肯定的な制御または 37 ° C で 180 分のネガティブ コントロールとして DPBS の相当量として</li>
	<li>GFP を使用して画像を取得 (励起: 470/22 nm、発光: 525/50 nm) とテキサス赤チャンネル (励起: 585/29 nm、発光: 628/32 nm) 次の時点で 40 倍の倍率で蛍光顕微鏡: 30、90、120、180 分。</li>
</ol>4 純数量および蛍光抗体法を用いた純成分の検出
<ol><li>12 ウェル培養プレートのウェルに 18 mm 直径ポリ-D-リジン コーティング カバー スリップを慎重に配置します。井戸に適切にラベルを付けます。</li>
	<li>種子の 100 に 200 μ L は、カバーガラスの上に直接好中球 (1 × 106/mL) を分離し、37 ° C、30 分で細胞を培養によってカバー スリップを遵守する好中球を許可します。</li>
	<li>3.3 で説明したように、好中球をアクティブにします。200 µΜ と好中球を前処理によるネットの形成を阻害する Cl-アミジン (15 分、37 ° C) 李らによって前述の活性化の前に13実験で適切な車両制御 (DMSO) が含まれていることを確認してください。</li>
	<li>微細鉗子でカバー スリップを慎重に取り外します。浅い井戸を作成し 4% の 2 〜 3 滴を配置するテスト チューブ スタンドにパラフィン フィルム シートを層ごとよく10の PFA。井戸に適切にラベルを付けるし、優しく PFA で満たされた井戸の上に逆さまカバー スリップを横たわっていた。20 分間室温で固定します。</li>
	<li>次に 1 つの井戸から移動して 3 回 5 分 DPBS のセルを洗浄します。</li>
	<li>直後に、好中球の活性化と固定 immunolabelling を実行できない場合は、カバー スリップの顔アップ吸収紙の上に配置することによって乾燥空気になるカバー スリップを許可します。さらに詳しい分析まで最大 1 週間 4 ° C でラベルの 12 ウェル培養プレートの表側のカバー スリップを格納できます。3 回の次のステップに進む前に 4.4 で説明されているように同じ技術を使用して 1 分の DPBS セルを洗浄します。</li>
	<li>セルを permeabilize 優しくカバー スリップ逆さまに置く 4.4 で説明されている手法を使用して 1 分の NP 40 1% のドロップ。ロッカー上で 1 分間 DPBS で 3 回を洗います。</li>
	<li>ランダムに各サンプルの数を割り当てる、ダイヤモンド ポイント マーカーを使用して、それに応じて、coverslips にラベルを付けます。</li>
	<li>準備とラベル個々 ペトリ皿パラフィン フィルムと並び、(バッファー ブロッキング) フィルムに 5% ヤギ血清の 100 に 200 μ L を配置します。ブロック バッファーに、coverslips を逆さまに横たわっていた。ロッカー上に配置し、37 ° C で 1 時間インキュベート</li>
	<li>ロッカー上で 5 分間、3 回に DPBS 洗ってください。</li>
	<li>一次抗体の希釈 (1: 400 ウサギ ポリクローナル抗シトルリン化ヒストン H3 (citH3) 5% ヤギ血清中)。パラフィン フィルムと並んでラベル付きシャーレで細胞を孵化させなさい。希釈液の 50 に 100 μ L の各カバー スリップを逆さまに横たわっていた。ロッカー上に配置し、37 ° C で 1 時間インキュベート</li>
	<li>ロッカー上で 5 分間、3 回に DPBS 洗ってください。</li>
	<li>二次抗体の希釈は 5% ヤギ血清に蛍光体 (レバレッジ) に共役。パラフィン フィルムと並んでラベル付きシャーレで細胞を孵化させなさい。希釈液の 50 に 100 μ L の各カバー スリップを逆さまに横たわっていた。ロッカーに置き、暗闇の中で 37 ° C で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>暗闇の中でロッカー上で 5 分間 DPBS で 3 回を洗います。</li>
	<li>ミエロペルオキシダーゼ (MPO) の同時検出 Li et al.によって説明するよう変更された二重反応プロトコルの次の手順に従います13
</li>
	<li>パラフィン フィルムと並んでラベル付きシャーレで細胞を孵化させなさい。各カバー スリップ逆さまに置く 10% ウサギの 100 に 200 μ L 穏やかな揺動 (一晩、4 ° C、暗闇の中で) の下で血清。</li>
	<li>暗闇の中でロッカー上で 5 分間 DPBS で 3 回を洗います。</li>
	<li>50 μ g/mL 非ヤギ抗うさぎ Fab フラグメント暗闇の中のロッカーに室温で 2 時間のセルを孵化させなさい。</li>
	<li>暗闇の中でロッカー上で 5 分間 DPBS で 3 回を洗います。</li>
	<li>一次抗体 (1: 200 ウサギ ポリクローナル抗 MPO 抗体) 5% ヤギ血清を希釈します。パラフィン フィルムと並んでラベル付きシャーレで細胞を孵化させなさい。希釈液の 50 に 100 μ L の各カバー スリップを逆さまに横たわっていた。ロッカーに置き、暗闇の中で 37 ° C で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>5% ヤギ血清に蛍光標識二次抗体を希釈し、前述の 4.8 を孵化させなさい</li>
	<li>暗闇の中でロッカー上で 5 分間 DPBS で 3 回を洗います。</li>
	<li>干渉コントロールを作成するには、免疫ラベルの 2 番目の手順でいずれかの一次抗体の孵化を除きます。</li>
	<li>300 で DNA を染色 nM の 4', 6-Diamidion-2-Phenylindole、塩酸 (DAPI) 室温で暗闇の中で 5 分間。</li>
	<li>暗闇の中のロッカーに 1 分の DPBS で 3 回を洗います。</li>
	<li>スライド ガラスに antifade フィルターとフィルターのドロップ (~ 50 μ l) を適用します。そっと逆さま coverslip 細胞とをマウントする前に余分なバッファーを削除する吸収紙の上のカバーガラスの端をタップします。メディアをマウントする必要があります、coverslip とスライド ガラスの薄い層を形成します。空気の泡を削除するには、非常を軽く押して、coverslip 微細鉗子で。</li>
	<li>4 ° C で暗闇の中で一晩治すためサンプルを許可します。浸漬レンズと顕微鏡分析のためメディアをマウントを強化してください。暗闇の中で 4 ° C にサンプルを格納します。</li>
</ol>5. 好中球細胞外トラップ定量化
<ol><li>盲目のオペレーターの集録および実験条件に顕微鏡画像を解析します。</li>
	<li>それぞれのチャンネルの下の実験で各 coverslip の異なった地域からランダムに 10 の画像を取る蛍光顕微鏡を使用すると、40 倍の倍率で。露出時間、明るさおよび各チャンネルのコントラスト画像の取得で一貫して保持されますを確認します。</li>
	<li>利用可能なソフトウェア ImageJ (NIH) などを使用して画像を分析します。CfDNA、citH3、MPO (図 3 a, B) の共局在に基づくネットを識別します。ネットと各実験条件の 10 のランダムなフィールドにおける好中球の数を定量化します。リリース ネットの数字は比率として表現できます (ネット数: 好中球の合計数) 各実験条件のため。</li>
	<li>細胞内 citH3 式の治療効果を評価するには、細胞内 citH3 と好中球の数とそれぞれのチャンネルで (の下で 40 倍の倍率で 10 のランダムな分野で細胞内 citH3 なしの好中球の数を数える図 3、赤い矢印)。細胞内 citH3 式は、細胞 citH3 細胞内 citH3 なしの好中球の数と好中球数の比として表現できます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+and+immunity:+challenges+and+opportunities.">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beneficial+suicide:+why+neutrophils+die,+to+make+NETs.">Beneficial suicide: why neutrophils die, to make NETs.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).</li><li>Kaplan, M. 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L., Ng, G., Tablin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+canine+neutrophils+is+dependent+on+histone+H3+citrullination+by+peptidylarginine+deiminase.">Lipopolysaccharide-induced neutrophil extracellular trap formation in canine neutrophils is dependent on histone H3 citrullination by peptidylarginine deiminase.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 193, 29-37 (2017).</li><li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETosis+markers:+Quest+for+specific,+objective,+and+quantitative+markers.">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+is+essential+for+antibacterial+innate+immunity+mediated+by+neutrophil+extracellular+traps.">PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).</li><li>Leshner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAD4+mediated+histone+hypercitrullination+induces+heterochromatin+decondensation+and+chromatin+unfolding+to+form+neutrophil+extracellular+trap-like+structures.">PAD4 mediated histone hypercitrullination induces heterochromatin decondensation and chromatin unfolding to form neutrophil extracellular trap-like structures.</a> Frontiers in Immunology. 3, 307 (2012).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+and+inactivators+of+protein+arginine+deiminase+4:+functional+and+structural+characterization.">Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization.</a> Biochemistry. 45 (39), 11727-11736 (2006).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

セル側の透過物色素と細胞の非透過性染料を使用して生活の犬好中球の核形態と cfDNA リリースで変化を観察するためのプロトコルをご紹介します。このアッセイの主な利点は、できるネット形成のリアルタイム計測セル固定せずライブ好中球における高分解能顕微鏡によってしたがって、体外ネット形成を観察するためのシンプルで貴重なツールを提供します。以来、このアッセイは...

好中球が顆粒球短命の病原体の侵入に対する最初の防衛を担当です。伝染のサイトに募集、好中球は貪食、脱顆粒反応と活性酸素種 (ROS)1の生成による微生物を排除します。細菌やエンドトキシンの存在下で好中球リリース好中球細胞外トラップ (ネット)、細胞のクロマチンの構成は (MPO)2ヒストンとエラスターゼとペルオキシダーゼのような顆粒内蛋白で装飾されています。ネットでは、不可欠な抗菌特性を持っていますが、実験と臨床の証拠が増えている敗血症時にあまりに熱心なネット形成が複数臓器不全と死3,4、につながる可能性があります。5,6。
ネットは、犬同様の病態生理学的役割を再生可能性があります、ために、ネットの形成を減少または防ぐ治療上の介在は敗血症動物における新しい治療戦略として役立つかもしれない。このため、信頼性の高い手法を評価し、NETosis と犬の NET コンポーネントを数値化するために必要があります。NET コンポーネント (cfDNA) DNA ヌクレオソームなどは以前犬の好中球および臨床犬7,8,9からプラズマで評価されています。蛍光アッセイを使用して、ゴッグスと Letendre 発見健康犬8より cfDNA のハイレベルがある浄化槽犬。これらの技術は高度に客観的・定量的な NETosis のマーカーとして cfDNA とヌクレオソームの測定が非特異的 NETosing 好中球以外壊死細胞から得られるので。ここで好中球 NETosing ライブの挙動を調べる蛍光顕微鏡を利用した手法について述べる。また、ネットと MPO など犬の好中球10citH3 コンポーネントを主観的に定量化する二重反応を使用して修正されたプロトコルの詳細します。

<table><tbody><tr><td>Dextran from &lt;em&gt;Leuconostoc&lt;/em&gt; spp.</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td>Molecular weight 450,000 &amp;ndash; 650,000</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Life Sciences</td><td>17144002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate-Buffered Saline</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1285801</td><td>With divalent cations</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate-Buffered Saline</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190136</td><td>Without divalent cations</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; O55:B5</td><td>InvivoGen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11368</td><td>5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes</td></tr><tr><td>SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7578</td><td>1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes</td></tr><tr><td>Surface-Amps NP-40</td><td>Pierce</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine coated coverslips</td><td>neuVitro</td><td>H-12-pdl</td><td>12 mm diameter</td></tr><tr><td>Anti-citrullinated histone H3 antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab5103</td><td></td></tr><tr><td>Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-007-003</td><td>Specificity: IgG (H+L)</td></tr><tr><td>Anti- Myeloperoxidase antibody</td><td>Dako</td><td>A0398</td><td></td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>D1306</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro canine neutrophil extracellular trap formation: dynamic and quantitative analysis by fluorescence microscopy

病原体の侵入に対し、好中球は DNA のヒストンと抗菌タンパク質の細胞ネットワークである好中球細胞外トラップ (網) をリリースします。過剰なネット形成 (NETosis) 敗血症時に citH3 リリースは複数の臓器障害とマウスとヒトの死亡率に関連付けられて、その犬への影響が知られています。ここで、観察及び定量化 NETosis の全血から犬の好中球を分離する手法について述べる。デキストランの沈降によって生成された白血球リッチ プラズマが市販の密度勾配分離メディアで区切られ、顆粒球の収集細胞数および生存率試験。ライブの好中球におけるリアルタイムの NETosis を観察するには、側の透過物のセルとセルの非透過性蛍光核酸の汚れはリポ多糖 (LPS) またはホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) のいずれかを活性化好中球に追加されます。核の形態とネット形成の変化は、時間をかけて蛍光顕微鏡で観察します。体外NETosis co-3p324 細胞遊離 DNA (cfDNA)、ミエロペルオキシダーゼ (MPO)、シトルリン化ヒストン H3 (citH3) 変更された二重 immunolabelling プロトコルを使用してが特徴です。ネット形成と蛍光顕微鏡を使用して citH3 式を客観的に定量化するネットし、citH3 陽性細胞が利用可能なソフトウェアを使用して盲検の方法で定量化します。この手法は、特定検定犬の好中球の体外容量 NETosis を受けることに。

生きているセルイメージ投射のこのプロトコルを使用すると、調査官は核形態、プラズマ膜の完全性と生活の好中球における cfDNA の存在を観察できます。セルの非透過性核色素の汚れ破損した細胞膜と細胞内核酸を赤。別セル側の透過物の色素は、そのまま細胞膜と細胞の細胞内の核酸をラベル付けします。その治療に関係なく、すべてのままの好中球が緑表示し、...

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In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

全血からの犬好中球を分離し、蛍光顕微鏡を用いたライブ好中球におけるネットの形成を視覚化する方法について述べる。ネット形成とシトルリン化ヒストン H3 を定量化するプロトコルについて述べる、蛍光顕微鏡を用いた (citH3) 式。

体外蛍光顕微鏡による犬の好中球細胞外トラップ形成: ダイナミックな定量的分析

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

in-vitro-canine-neutrophil-extracellular-trap-formation-dynamic

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

8.7K ビュー.  University of California, Davis. 全血からの犬好中球を分離し、蛍光顕微鏡を用いたライブ好中球におけるネットの形成を視覚化する方法について述べる。ネット形成とシトルリン化ヒストン H3 を定量化するプロトコルについて述べる、蛍光顕微鏡を用いた (citH3) 式。

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Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

好中球細胞外トラップ：それらを生成して可視化する方法

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

免疫・感染学

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are networks of DNA, histones and neutrophil proteins. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay.

イヌ好中球細胞外トラップリリースの定量化のためのシンプルな蛍光アッセイ

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. NETs have been demonstrated to serve as an important host defense mechanism that traps and kills microorganisms. On the other hand, they have been implicated in diverse systemic autoimmune diseases. NETs are immunogenic and toxic structures that contain a pool of relevant autoantigens including anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) and systemic lupus erythematosus (SLE). Different forms of NETs can be induced depending on the stimulus. The amount of NETs can be quantified using different techniques including measuring DNA release in supernatants, measuring DNA-complexed with NET-molecules like myeloperoxidase (MPO) or neutrophil elastase (NE), measuring the presence of citrullinated histones by fluorescence microscopy, or flow cytometric detection of NET-components which all have different features regarding their specificity, sensitivity, objectivity, and quantity. Here is a protocol to quantify ex vivo NET formation in a highly-sensitive, high-throughput manner by using three-dimensional immunofluorescence confocal microscopy. This protocol can be applied to address various research questions about NET formation and degradation in health and disease.

This protocol describes a highly sensitive and high throughput neutrophil extracellular trap (NET) assay for the semi-automated quantification of ex vivo NET formation by immunofluorescence three-dimensional confocal microscopy. This protocol can be used to evaluate NET formation and degradation after different stimuli and can be used to study potential NET-targeted therapies.

高スループット アッセイを行い好中球細胞外トラップ形成の定量化

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by neutrophils in response to systemic inflammation or pathogens. Although NETs have previously been shown to augment clot formation and inhibit fibrinolysis in humans and dogs, the role of NETs in cats with cardiogenic arterial thromboembolism (CATE), a life-threatening complication secondary to hypertrophic cardiomyopathy, is unknown. A standardized method to identify and quantify NETs in cardiogenic arterial thrombi in cats will advance our understanding of their pathological role in CATE. Here, we describe a technique to identify NETs in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded thrombi within the aortic bifurcation, extracted during necropsy. Following deparaffinization with xylene, aortic sections underwent indirect heat-induced antigen retrieval. Sections were then blocked, permeabilized, and ex vivo NETs were identified by colocalization of cell-free DNA (cfDNA), citrullinated histone H3 (citH3), and neutrophil elastase (NE) using immunofluorescence microscopy. To optimize the immunodetection of NETs in thrombi, autofluorescence of tissue elements was limited by using an autofluorescence quenching process prior to microscopy. This technique could be a useful tool to study NETs and thrombosis in other species and offers new insights into the pathophysiology of this complex condition.

We describe a method to identify neutrophil extracellular traps (NETs) in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded feline cardiogenic arterial thrombi using heat-induced antigen retrieval and a double immunolabeling protocol.

蛍光免疫顕微鏡を用いたパラフィン組み込みネコリン動脈血栓における好中球外細胞トラップの同定

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). This study analyzes the morphological and compositional changes in NETs induced by microbial and chemical stimuli using standardized in vitro methodologies for NET induction and characterization with human cells. The procedures described here allow the analysis of NET morphology (lytic or non-lytic) and composition (DNA-protein structures and enzymatic activity), and the effect of soluble factors or cellular contact on such characteristics. Additionally, the techniques described here could be modified to evaluate the effect of exogenous soluble factors or cellular contact on NET composition.
The applied techniques include the purification of polymorphonuclear cells from human peripheral blood using a double density gradient (1.079-1.098 g/mL), guaranteeing optimal purity and viability (&#8805; 95%) as demonstrated by Wright's staining, trypan blue exclusion, and flow cytometry, including FSC versus SSC analysis and 7AAD staining. NET formation is induced with microbial (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Candida albicans) and chemical (phorbol myristate acetate, HOCl) stimuli, and the NETs are characterized by DNA-DAPI staining, immunostaining for the antimicrobial peptide cathelicidin (LL37), and quantification of enzymatic activity (neutrophil elastase, cathepsin G, and myeloperoxidase). The images are acquired through fluorescence microscopy and analyzed with ImageJ.

Presented here is a protocol for the induction and analysis of in vitro neutrophil extracellular traps (NETs). Quantification of DNA, cathelicidin (LL37), and enzyme activity yielded data that show the variability in the composition and morphology of NETs induced by microbial and chemical stimuli under similar controlled conditions.

微生物・化学刺激による好中球細胞外トラップの形態・組成解析

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

パラフィン埋め込み組織におけるヒトおよびマウス好中球外細胞トラップの免疫蛍光標識

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

医学

好中球細胞外トラップを可視化するための染色とイメージング

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in autoimmune diseases and sterile inflammation. They are web-like structures composed of double-stranded DNA filaments, histones, and antimicrobial proteins. Once released, NETs can trap and kill extracellular pathogens in blood and tissue. Furthermore, NETs participate in homeostatic regulation by stimulating platelet adhesion and coagulation. However, the dysregulated production of NETs has also been associated with various diseases, including sepsis or autoimmune disorders, which makes them a promising target for therapeutic intervention. Apart from electron microscopy, visualizing NETs using immunofluorescence imaging is currently one of the only known methods to demonstrate NET interactions in tissue. Therefore, various staining methods to visualize NETs have been utilized. In the literature, different staining protocols are described, and we identified four key components showing high variability between protocols: (1) the types of antibodies used, (2) the usage of autofluorescence-reducing agents, (3) antigen retrieval methods, and (4) permeabilization. Therefore, in vitro immunofluorescence staining protocols were systemically adapted and improved in this work to make them applicable for different species (mouse, human) and tissues (skin, intestine, lung, liver, heart, spinal disc). After fixation and paraffin-embedding, 3 &#181;m thick sections were mounted onto slides. These samples were stained with primary antibodies for myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit), and neutrophil elastase (NE) according to a modified staining protocol. The slides were stained with secondary antibodies and examined using a widefield fluorescence microscope. The results were analyzed according to an evaluation sheet, and differences were recorded semi-quantitatively.
Here, we present an optimized NET staining protocol suitable for different tissues. We used a novel primary antibody to stain for H3cit and reduced non-specific staining with an autofluorescence-reducing agent. Furthermore, we demonstrated that NET staining requires a constant high temperature and careful handling of samples.

著者スポットライト:ヒトおよびマウス組織における好中球細胞外トラップイメージング 

Neutrophil extracellular traps (NETs) are associated with various diseases, and immunofluorescence is often used for their visualization. However, there are various staining protocols, and, in many cases, only one type of tissue is examined. Here, we establish a generally applicable protocol for staining NETs in mouse and human tissue.

ヒトおよびマウス組織における好中球細胞外トラップの免疫蛍光イメージング

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...

デュアルダイライブセル解析によるNET形成の定量化

Real-Time High Throughput Technique to Quantify Neutrophil Extracellular Traps Formation in Human Neutrophils

Neutrophils are myeloid-lineage cells that form a crucial part of the innate immune system. The past decade has revealed additional key roles that neutrophils play in the pathogenesis of cancer, autoimmune diseases, and various acute and chronic inflammatory conditions by contributing to the initiation and perpetuation of immune dysregulation through multiple mechanisms, including the formation of neutrophil extracellular traps (NETs), which are structures crucial in antimicrobial defense. Limitations in techniques to quantify NET formation in an unbiased, reproducible, and efficient way have restricted our ability to further understand the role of neutrophils in health and diseases. We describe an automated, real-time, high-throughput method to quantify neutrophils undergoing NET formation using a live cell imaging platform coupled with a membrane permeability-dependent dual-dye approach using two different DNA dyes to image intracellular and extracellular DNA. This methodology is able to help assess neutrophil physiology and test molecules that can target NET formation.

著者スポットライト:Quantifying Neutrophil extracellular traps in disease and drug screening using dual-color live-cell imaging

We present an automated high-throughput method to quantify neutrophil extracellular traps (NETs) utilizing the live cell analysis system, coupled with a membrane permeability-dependent dual-dye approach.

体外蛍光顕微鏡による犬の好中球細胞外トラップ形成: ダイナミックな定量的分析

要約

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好中球細胞外トラップ：それらを生成して可視化する方法

イヌ好中球細胞外トラップリリースの定量化のためのシンプルな蛍光アッセイ

高スループットアッセイを行い好中球細胞外トラップ形成の定量化

蛍光免疫顕微鏡を用いたパラフィン組み込みネコリン動脈血栓における好中球外細胞トラップの同定

微生物・化学刺激による好中球細胞外トラップの形態・組成解析

パラフィン埋め込み組織におけるヒトおよびマウス好中球外細胞トラップの免疫蛍光標識

ヒトおよびマウス組織における好中球細胞外トラップの免疫蛍光イメージング

ヒトおよびマウス組織における好中球細胞外トラップの免疫蛍光イメージング

ヒトおよびマウス組織における好中球細胞外トラップの免疫蛍光イメージング

ヒト好中球における好中球細胞外トラップ形成を定量化するリアルタイムハイスループット技術(英語)

体外蛍光顕微鏡による犬の好中球細胞外トラップ形成: ダイナミックな定量的分析

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微生物・化学刺激による好中球細胞外トラップの形態・組成解析

パラフィン埋め込み組織におけるヒトおよびマウス好中球外細胞トラップの免疫蛍光標識

ヒトおよびマウス組織における好中球細胞外トラップの免疫蛍光イメージング

ヒトおよびマウス組織における好中球細胞外トラップの免疫蛍光イメージング

ヒトおよびマウス組織における好中球細胞外トラップの免疫蛍光イメージング

ヒト好中球における好中球細胞外トラップ形成を定量化するリアルタイムハイスループット技術(英語)

高スループットアッセイを行い好中球細胞外トラップ形成の定量化