Name: a volumetric method for quantification of cerebral vasospasm in a murine model of subarachnoid hemorrhage
Uploaded: 2018-07-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
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本研究の一部は、T. Pantel、マインツのヨハネス ・ グーテンベルク大学の医学部に提示の学位論文の一部です。研究は、Friedhelm 解放財団、財団 Neurochirurgische 上海虹橋 (a ・ n ・助成金) に支えられました。

動物実験は動物レスポンシブル ・ ケア委員会 (Landesuntersuchungsamt ラインラント = プファルツ) によって承認され、ドイツの動物保護の行為 (TierSchG) を実施します。すべての該当する国際、国家、そして制度ガイドライン ケアとの動物の使用のために続いていた。
本研究では、男性 C57BL6 マウス (年齢 10-12 週) が使用されました。簡単に言えば、くも膜下出血だったとイソフルレン麻酔下で脳血管内フィラメント穿孔によって誘導されます。左外頚動脈は外科的に準備されました。その後、フィラメントは外頚動脈に挿入され頭蓋内頸動脈 T、くも膜下出血を誘発する、穿孔内頸動脈を介して高度な。頭蓋内圧の上昇が血管内治療成功の指標として撮影された 穿孔。マウスにおける出血の血管内フィラメント穿孔モデルの詳細なプロトコルとなっています8,14他人によって公開されました。
1. 血流と血管内の鋳造
<ol><li>本研究では血流は SAH の誘導後 72 時間に行った。5 μ g/g 本体重量 (bw) ミダゾラム、30 ng/g bw フェンタニル 0.5 μ g/g bw medetomidin 腹腔内注入して麻酔を誘導します。十分な麻酔レベルに達すると、痛み刺激に対する反応の有無により確認された後にのみ続行します。</li>
	<li>胸郭を開く、穿刺 21 G カニューレと左心室、右心房を開き、15他の場所で記述として下行大動脈をクランプします。</li>
	<li>次の解決策を使用して transcardiac の灌流を実行: (i) ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 MgCl2と 1 G/L グルコースと (ii) 4% パラホルムアルデヒド溶液 ph 7.4 CaCl2を含みます。<ol>
<li>(I) 2 分間ソリューションと灌流を起動し、(ii) 4 分のためのソリューションを継続します。</li>
		<li>37 ° C、可変灌流率と圧力制御のポンプを使用してあったマウス16で血管攣縮を分析する最適な灌流圧 70 mmHg の定圧灌流温度でソリューションを吹き込みます。ソリューション (ii) (i) のソリューションからの切り替え時の圧力損失を避けてください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ソリューション (i) と (ii) による血液灌流後の放射線不透過性のキャスティング エージェントと室温で 20 分間灌流を継続 (材料表参照) 0.2 ml/min の一定のレートで。</li>
	<li>一晩 4 ° C で放射線不透過性鋳造材の硬化を可能にします。前述の17として頭蓋骨から脳を取り除く 4 %pfa ソリューションにサンプルを転送およびマイクロ CT スキャンまで 4 ° C でサンプルを保存します。</li>
</ol>2. マイクロ コンピューター断層撮影
<ol><li>プラスチック製のチューブの中心に鈍的解剖学的鉗子で脳を配置します。画像の取得中に、オブジェクトが動かないようにサンプルより若干大きい直径のチューブを選択します。ガーゼを使用して、チューブを閉じます。</li>
	<li>オブジェクトを水平軸を回転させて x 線小屋のコンピューター移動制御 (CNC) の測位システムのマイクロ ステップ モーターにプラスチック製のチューブを取り付けます。</li>
	<li>ビューのフィールド x 線ラジオグラフィーの下にサンプルを配置します。最大の倍率を達成するために x 線源にできるだけ近くにオブジェクトを配置し、可能な限り検出器までの距離を最大化します。</li>
	<li>次のスキャン パラメーターでステップの撮影画像取得プロトコルを使用: 1 に露光時間を設定各投影信号対雑音比 (SNR) を最適化し、管電圧 80 の kV (現在 38 μ A)、1,000 の予測結果 360 ° 回転。</li>
	<li>RAW データの再構築再構築ソフトウェアを使用して 1024 x 1024 x 1024 画素行列・ シェップ ローガン フィルターを適用するフィルター処理逆投影アルゴリズムを使って (材料の表を参照してください)。詳細な分析結果の DICOM データを 3次元可視化ソフトウェア インポートします。 (材料の表を参照してください)。</li>
</ol>3 頭蓋内血管の木および血管ボリュームの決定 3次元再構築
注:可視化ソフトウェアの機能に関する背景情報については、ヘルプ機能を使用して見つけることが。
<ol><li>Dicom データをインポート機能を使って可視化ソフトウェアにインポートできます。</li>
	<li>関数Volrenで船木を視覚化します。太い脳動脈がシャープな輪郭で描かれているので可視化のしきい値を選択します。実験シリーズに属するすべてのデータのセットに同じ可視化しきい値を使用することが重要です。</li>
	<li>事実上関数VolumeEditをカーソルで血管を囲むことによって基底脳動脈 (ウィリス動脈輪) を解剖します。その後、事実上分析する血管を解剖します。したがって、正確に主要な動脈からのすべての小さな枝を分離するために血管の木の 3 次元モデルを回転します。分析する血管を除くすべての血管を削除するのにはさらなる分析のために不可欠です。</li>
	<li>生成する可視化のしきい値に設定されているしきい値をAutoskeleton関数を適用するセンター-ライン - SpatialGraphをベースします。</li>
	<li>次に、関数を作成するSpatialGraphToLineSetを適用、行セット。手動でカーソルを 1 つの区分を選択し、「分割」をクリックすると、その単一の区分に設定行を分割します。この手順は、単一の区分のボリュームを計算するために重要です。</li>
	<li>空間グラフをもう一度作成するのにLineSetToSpatialGraph関数を使用します。</li>
	<li>長さ、ボリューム、および各小区分の直径を決定するのにSpatialGraphStatistics関数を使用します。色分けされた可視化のために関数を使用して血管径のコースを表すSpatialGraphView.「太さ」は、血管径と相関する着色セグメントを設定します。実験シリーズに属するすべてのデータセットの同じ色のマップを選択することが重要です。</li>
	<li>それ以上の分析に含まれるどの区分を決定する区分の長さを追加します。本研究では内頸動脈は、内頸動脈 T の近位の 1 mm と中大脳動脈頸動脈 t. の遠位の 2.5 mm から成る容器セグメントを評価しました。定義された血管の血管ボリュームを決定するために、ボリュームを加えます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Macdonald, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+neurological+deterioration+after+subarachnoid+haemorrhage.">Delayed neurological deterioration after subarachnoid haemorrhage.</a> Nature Reviews Neurology. 10 (1), 44-58 (2014).</li><li>Dorsch, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinical+review+of+cerebral+vasospasm+and+delayed+ischaemia+following+aneurysm+rupture.">A clinical review of cerebral vasospasm and delayed ischaemia following aneurysm rupture.</a> Acta Neurochirurgica Supplement. 110 (Pt 1), 5-6 (2011).</li><li>Vergouwen, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+delayed+cerebral+ischemia+after+aneurysmal+subarachnoid+hemorrhage+as+an+outcome+event+in+clinical+trials+and+observational+studies:+Proposal+of+a+multidisciplinary+research+group.">Definition of delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage as an outcome event in clinical trials and observational studies: Proposal of a multidisciplinary research group.</a> Stroke. 41 (10), 2391-2395 (2010).</li><li>Friedrich, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CO2+has+no+therapeutic+effect+on+early+microvasospasm+after+experimental+subarachnoid+hemorrhage.">CO2 has no therapeutic effect on early microvasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 34 (8), e1-e6 (2014).</li><li>Friedrich, B., Muller, F., Feiler, S., Scholler, K., Plesnila, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+subarachnoid+hemorrhage+causes+early+and+long-lasting+microarterial+constriction+and+microthrombosis:+An+in+vivo+microscopy+study.">Experimental subarachnoid hemorrhage causes early and long-lasting microarterial constriction and microthrombosis: An in vivo microscopy study.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 32 (3), 447-455 (2012).</li><li>Terpolilli, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+inhalation+reduces+brain+damage,+prevents+mortality,+and+improves+neurological+outcome+after+subarachnoid+hemorrhage+by+resolving+early+pial+microvasospasms.">Nitric oxide inhalation reduces brain damage, prevents mortality, and improves neurological outcome after subarachnoid hemorrhage by resolving early pial microvasospasms.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 36 (12), 2096-2107 (2016).</li><li>Neulen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+segmentation-based+volumetric+approach+to+localize+and+quantify+cerebral+vasospasm+based+on+tomographic+imaging+data.">A segmentation-based volumetric approach to localize and quantify cerebral vasospasm based on tomographic imaging data.</a> PLoS One. 12 (2), e0172010 (2017).</li><li>Schuller, K., Buhler, D., Plesnila, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+subarachnoid+hemorrhage.">A murine model of subarachnoid hemorrhage.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50845 (2013).</li><li>Altay, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+subarachnoid+hemorrhage+to+induce+vasospasm+in+mice.">A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 136-140 (2009).</li><li>Momin, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+delivery+of+nitric+oxide+inhibits+leukocyte+migration+and+prevents+vasospasm+in+haptoglobin+2-2+mice+after+subarachnoid+hemorrhage.">Controlled delivery of nitric oxide inhibits leukocyte migration and prevents vasospasm in haptoglobin 2-2 mice after subarachnoid hemorrhage.</a> Neurosurgery. 65 (5), 937-945 (2009).</li><li>Froehler, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasospasm+after+subarachnoid+hemorrhage+in+haptoglobin+2-2+mice+can+be+prevented+with+a+glutathione+peroxidase+mimetic.">Vasospasm after subarachnoid hemorrhage in haptoglobin 2-2 mice can be prevented with a glutathione peroxidase mimetic.</a> Journal of Clinical Neurocience. 17 (9), 1169-1172 (2010).</li><li>Lin, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+subarachnoid+hemorrhage-induced+cerebral+vasospasm.">A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm.</a> Journal of Neuroscience Methods. 123 (1), 89-97 (2003).</li><li>Marbacher, S., Fandino, J., Kitchen, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+intracranial+in+vivo+animal+models+of+delayed+cerebral+vasospasm.">Standard intracranial in vivo animal models of delayed cerebral vasospasm.</a> British Journal of Neurosurgery. 24 (4), 415-434 (2010).</li><li>Feiler, S., Friedrich, B., Scholler, K., Thal, S. C., Plesnila, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+induction+of+subarachnoid+hemorrhage+in+mice+by+intracranial+pressure+monitoring.">Standardized induction of subarachnoid hemorrhage in mice by intracranial pressure monitoring.</a> Journal of Neuroscience Methods. 190 (2), 164-170 (2010).</li><li>Ghanavati, S., Yu, L. X., Lerch, J. P., Sled, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfusion+procedure+for+imaging+of+the+mouse+cerebral+vasculature+by+X-ray+micro-CT.">A perfusion procedure for imaging of the mouse cerebral vasculature by X-ray micro-CT.</a> Journal of Neuroscience Methods. 221, 70-77 (2014).</li><li>Parra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+subarachnoid+hemorrhage+associated+cerebral+vasospasm:+methodological+analysis.">Mouse model of subarachnoid hemorrhage associated cerebral vasospasm: methodological analysis.</a> Neurological research. 24 (5), 510-516 (2002).</li><li>Boulay, A. C., Saubamea, B., Decleves, X., Cohen-Salmon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Mouse+Brain+Vessels.">Purification of Mouse Brain Vessels.</a> Journal of Visualized Experiments. 105 (e53208), (2015).</li><li>Marjamaa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+with+a+deletion+in+the+first+intron+of+the+Col1a1+gene+develop+dissection+and+rupture+of+aorta+in+the+absence+of+aneurysms:+High-resolution+magnetic+resonance+imaging,+at+4.7+T,+of+the+aorta+and+cerebral+arteries.">Mice with a deletion in the first intron of the Col1a1 gene develop dissection and rupture of aorta in the absence of aneurysms: High-resolution magnetic resonance imaging, at 4.7 T, of the aorta and cerebral arteries.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 55 (3), 592-597 (2006).</li><li>Schambach, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+high-resolution+in+vivo+volume-CTA+of+mice+cerebral+vessels.">Ultrafast high-resolution in vivo volume-CTA of mice cerebral vessels.</a> Stroke. 40 (4), 1444-1450 (2009).</li><li>Figueiredo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+digital+subtraction+angiography,+micro-computed+tomography+angiography+and+magnetic+resonance+angiography+in+the+assessment+of+the+cerebrovascular+system+in+live+mice.">Comparison of digital subtraction angiography, micro-computed tomography angiography and magnetic resonance angiography in the assessment of the cerebrovascular system in live mice.</a> Clinical Neuroradiology. 22 (1), 21-28 (2012).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

SAH マウスモデルは、SAH の基礎研究の重要なツールです。脳血管攣縮はくも膜9,11後 DCI につながるメカニズムを調査研究のエンドポイントとしてよく使用されます。しかし、マウスの脳血管攣縮の定量化や出血の他の小さい動物モデルは挑戦にあります。血管内血流と鋳造7,9,12後定義された解剖学的ポイントで血管径の決定前のヴィヴォ、まわりの定量に血管攣縮を定量化する一般的には、組織学的に定義された船の10、11 をセクションします。ただし、これらのメソッドは、いくつかの欠点を持つ: 脳血管攣縮は定義された解剖学的ポイントにのみ評価隣接する船のセグメントの血管攣縮は評価されない可能性があります。組織の成果物は、エラーの別の原因を紹介します。さらに、血管径が測定した正確な位置は調査官によって決まるので、評価がかなり主観的でことができます。
目標は、容器全体の脳血管セグメント断面イメージング データ7から量を計算することによって脳血管攣縮を定量化する方法を確立するためでした。ここに示す体積法の最も重要な利点は、セグメントを調べることができますそのすべての船です。これは血管径は測定点の定義の必要があります。全体の容器のセグメントの評価のそれ以上の利点はそれがおそらくより近位または遠位血管の攣縮が免れることが定義されたポイントで血管径の決定よりも脳血管攣縮を定量化するより客観的パラメーターを提示評価。カラー コードを使用して血管のデジタル表現では、脳血管攣縮の程度の直感的な推定をことができます。さらに、体積の評価は、代表の結果に示すように、血管の評価と比較して冠攣縮性の船の大きな違いにつながります。ここで紹介した方法で達成仮想の復興血管の解剖学が正確に反映されます。した血管の直径測定顕微鏡とデジタル再構成からと同様に、以前の研究7の観測結果を再現した、代表的なシリーズの評価が表示されます。ただし、その利点にもかかわらずさらに研究が必要でここで紹介した方法は脳血管攣縮の分析の従来の方法よりも優れているかどうか評価します。
ここで紹介した方法の制限は、それは鋳造された脳試料の顕微解析または組織学的解析 (マイクロ CT スキャン時間脳サンプルでは、データ処理の脳サンプルあたり 45 分あたり 90 分) と比較してより多くの時間を与えることです。さらに、マイクロ CT スキャナーの可用性は、そのアプリケーションを制限があります。ここで検討した動物の数はこの原稿で説明されたプロトコルの実現可能性を実証するのに十分だったただし、治療研究では、プロトコルを使用する必要があります、動物の数字を計算するだろうは容器・ ボリュームと直径の期待される効果に基づいています。これと SAH モデルマウスを用いた他の研究のもう一つの制限は、決定前のヴィヴォ、血管攣縮があるとです。これにより縦断研究不可能 SAH 誘導と異なる時点で脳血管攣縮の前に基準値を検討します。調査はそれを示したマウス生体内の磁気共鳴断層撮影法18、腹部血管造影19、またはデジタル減算を使用しての大規模な頭蓋内血管の解剖学を描写することはマウス出血モデルにおける生体内で脳血管攣縮を分析するための造影20、これらのメソッドは、我々 の知識にはまだ使用されていません。注記のうち、ここに示す脳血管攣縮の後続の体積評価と脳の血管系のデジタル復興は前のヴィヴォマイクロ CT データの利用制限ではありません。マウスにおける高分解能血管クロス断面脳イメージングする必要があります、将来的に利用可能になる、体内の血管攣縮の容積測定分析を行うに使えるかもしれない。

Aneurysmatic くも膜下出血 (SAH)、出血性脳卒中のサブタイプは、neurointensive ケア単位で一般的な病気です。出血イベント自体によって引き起こされる脳の損傷を含む、初期の脳損傷 (海老) のほか患者のアウトカムを決定するもう一つの重要な要因は臨床によって定義された遅延虚 (DCI) 劣化障害脳血流や脳梗塞の血管内治療や外科的処置1,2,3に関連付けられていません。DCI に貢献する重要なメカニズムが、一方で; 大規模な脳血管攣です。一方、皮質拡散くぼみに関連する虚血と microthrombosis、微小血管の血管攣縮と微小循環不全 (Madonald 20141文献) 役割を果たします。したがって、大規模な脳血管攣縮の診断は臨床実習が重要、多くの臨床的および実験的研究で重要なエンドポイントが表示されます。
SAH マウスモデルで脳血管攣縮の機能が直接ではないという事実にもかかわらず SAH の患者、マウスの人物に譲渡すること関連血管攣縮されている意義を最後の年に成長しています。出血、血管内フィラメント穿孔4,5,6,7、8、9大槽内血管の断裂または CSF10 に血の注入に起因するこれらのモデルで ,11,12。大動物モデル SAH の伝統的血管攣縮13を勉強するように設計されたと対照をなしてマウスモデル トランスジェニック マウスを多数の菌株があります偉大な利点があります。これはそれらを血管攣縮と DCI に結びつく分子メカニズムを研究するための優れたツールとなります。ただし、マウスにおける脳血管攣縮の決定は難しいです。これと対照をなして大動物モデルの血管攣縮は臨床のイメージング技術を使用して検査すること生体内でマウスにおける脳血管攣縮を分析するイメージングはまだ利用できないためにです。したがって、脳血管攣縮は、いずれかの組織学的セクション10,11を使用してまたは顕微鏡的に後脳血管7,9,12鋳造決定されます。しかし、これらの技術はその容器の直径を定義されている地点でのみ検討が欠点を持っています。
以前研究7に基づいて、この原稿は SAH マウスモデルにおける目的と脳血管攣縮の再現性の解析手法を示す.メソッドは血流と脳血管、 ex vivoマイクロ CT スキャン、船の木のデジタル復興の鋳造に基づいて、後続ボリューム全体の脳血管の評価。

<table><tbody><tr><td>Medetomidin&amp;nbsp;</td><td>Pfizer, Karlsruhe, Germany</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Ratiopharm, Ulm, Germany</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Fentanyl&amp;nbsp;</td><td>Curamed, Karlsruhe, Germany</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Venofix 21G</td><td>B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td>n.a.</td><td>21G cannula&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline containing MgCl2 and CaCl2, pH 7.4&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany</td><td>D8662&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde solution&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany</td><td>100496</td><td></td></tr><tr><td>Microfil MV-122&amp;nbsp;</td><td>Flowtech Inc., Carver, MA, USA</td><td>n.a.</td><td>Radiopaque</td></tr><tr><td>Micro-CT system Y.Fox</td><td>Yxlon, Garbsen, Germany</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>Reconstruction Studio software version 1.2.8.1</td><td>TeraRecon, Frankfurt am Main, Germany</td><td>n.a.</td><td>Reconstruction software</td></tr><tr><td>Amira software version 5.4.2&amp;nbsp;</td><td>FEI Visualization Sciences Group, Hillsboro, OR, USA</td><td>n.a.</td><td>Visualization software</td></tr><tr><td>PHD ultra syringe pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-3</td><td>Pressure controlled pump</td></tr><tr><td>anatomical forceps (blunt)</td><td>B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td>160323_v&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Infinity X-21</td><td>Deltapix, Maalov, Denmark</td><td>n.a.</td><td>high resolution camera</td></tr><tr><td>DeltaPix Insight software version 2.0.1</td><td>Deltapix, Maalov, Denmark</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>C57BL6 mice</td><td>Charles River, Cologne, Germany</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a volumetric method for quantification of cerebral vasospasm in a murine model of subarachnoid hemorrhage

クモ膜下出血 (SAH) 出血性脳卒中のサブタイプであります。出血の余波で発生する脳血管攣縮患者のアウトカムを決定する重要なファクターで、研究のエンドポイントとしてよくしました。しかし、SAH の小動物研究、脳血管攣縮の定量化は大きな課題です。ここでは、脳血管攣縮を定量化する客観的評価尺度として使用することができますすべての船セグメントのボリュームの定量化をことができますex vivo法を示した。最初のステップで放射線不透過性のキャスティング エージェントを使って血管内脳血管系の鋳造を行います。その後、マイクロ コンピューター断層撮影による断面画像データが取得されます。最後の手順では、中心線と血管セグメントのボリュームを計算するアルゴリズムが続く仮想血管の木の 3次元再構築をします。メソッドは、自分の仮想復元と解剖学的試料の直径ベースの比較で示されている脳血管障害木の高精度な仮想再構成で起因しました。単独で血管と比較して、血管ボリュームは、SAH と sham 群のシリーズで示されている冠攣縮性と非冠攣縮性の船の相違点を強調表示します。

3 次元の頭蓋内血管ツリーの仮想再建
三次元再構成の頭蓋内血管の木には、非常に正確な血管解剖 (図 1) が用意されています。精度を評価するために行った血管顕微鏡的決定と 2 の解剖学的定義されたポイントで 3 次元仮想復元から直径ベース比較 (1: 左中大脳動脈 (MCA) を 1 mm の遠位、頸動脈 T;2: 右 MCA 1 mm T 頸動脈遠位)。血管の顕微鏡測定は、高解像度カメラ (無限 X-21, Deltapix) DeltaPix 洞察力ソフトウェア バージョン 2.0.1 とマイクロメータ スケールに調整されて使用しています。この評価のため 10 脳サンプル (5 出血、5 偽) を行った。これらは 7 間 5 偽手術 (術後日 1 と 2、それぞれ死亡した SAH グループの 2 動物) うち、SAH が誘導された 12 のマウスのシリーズからだった。(顕微鏡測定対仮想再建、頭蓋内血管解剖の正確なバーチャル再生を示す顕微鏡と事実上、径間に有意差はありませんでした。平均 ± 標準誤差: 左 MCA 150 ± 9 μ m対左 MCA 150 ± 8 μ m;MCA 153 ± 8 μ m対154 ± 9 μ m を右、図 2を参照)。
SAH とマウスにおける脳血管攣縮の定量化
(I) 2 解剖学的定義されたポイント (左と右 MCA) で直径 1 mm 内頸動脈 (ICA) と (ii) 船舶が、左側に 2.5 mm MCA で構成される、定義済みの代表的な 3.5 mm の血管のボリュームがあった脳血管攣縮を定量化するには、SAH および sham 動物から脳のサンプルで決定 (n = 5)。容器容積はシャムと比較して出血でかなり低かった (36 ± 4 nL対71 ± 9 p < 0.05 nL)。血管が低かったシャムと比較して出血 (左 MCA: 140 ± 11 μ m対160 ± 10 μ m, p = 0.11; 右 MCA: 130 ± 13 μ m対158 ± 16 μ m, p < 0.05;図 3を参照)、アナリストの重大さのレベルに達しただけ右 MCA のです。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57997/57997fig1.jpg"> 図 1。頭蓋内血管ツリーの仮想再建。(A) 脳の代表的なサンプルを示しています。(B)は、対応する事実上再建血管のツリーを示しています。(C)は色分け左 MCA の直径の可視化です。<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57997/57997fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57997/57997fig2.jpg"> 図 2.血管系のデジタル復元精度。平均直径は、病理組織学的に決定されたものと比較して 3 D 再構成脳サンプルから測定されます。データは、平均の平均 ± 標準誤差として表示されます。<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57997/57997fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57997/57997fig3.jpg"> 図 3.くも膜下出血後の血管径と血管ボリューム。SAH の 3 D 再構築した血管から(A) MCA 比較径測定と偽がマウス。SAH で(B)船舶ボリュームと偽がマウス。データは、平均の平均 ± 標準誤差として表示されます。p < 0.05。<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57997/57997fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

この記事の目標は、マイクロ コンピューター断層撮影で脳血管攣縮を定量化する使用ことができますすべての船セグメントのボリュームの決定後、マウスの脳血管の木の 3 次元再構成を可能にする方法を提示するにはくも膜下出血のマウスモデル。

くも膜下出血のマウスモデルにおける脳血管攣縮の定量化法の体積

Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a subtype of hemorrhagic stroke. Cerebral vasospasm that occurs in the aftermath of the bleeding is an important factor ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.0K ビュー.  Medical Center of the Johannes Gutenberg - University. この記事の目標は、マイクロ コンピューター断層撮影で脳血管攣縮を定量化する使用ことができますすべての船セグメントのボリュームの決定後、マウスの脳血管の木の 3 次元再構成を可能にする方法を提示するにはくも膜下出血のマウスモデル。

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A Low Mortality Rat Model to Assess Delayed Cerebral Vasospasm After Experimental Subarachnoid Hemorrhage

Objective: To characterize and establish a reproducible model that demonstrates delayed cerebral vasospasm after aneurysmal subarachnoid hemorrhage (SAH) in rats, in order to identify the initiating events, pathophysiological changes and potential targets for treatment.
Methods: Twenty-eight male Sprague-Dawley rats (250 - 300 g) were arbitrarily assigned to one of two groups - SAH or saline control. Rat subarachnoid hemorrhage in the SAH group (n=15) was induced by double injection of autologous blood, 48 hr apart, into the cisterna magna. Similarly, normal saline (n=13) was injected into the cisterna magna of the saline control group. Rats were sacrificed on day five after the second blood injection and the brains were preserved for histological analysis. The degree of vasospasm was measured using sections of the basilar artery, by measuring the internal luminal cross sectional area using NIH Image-J software. The significance was tested using Tukey/Kramer's statistical analysis.
Results: After analysis of histological sections, basilar artery luminal cross sectional area were smaller in the SAH than in the saline group, consistent with cerebral vasospasm in the former group. In the SAH group, basilar artery internal area (.056 &mu;m &plusmn; 3) were significantly smaller from vasospasm five days after the second blood injection (seven days after the initial blood injection), compared to the saline control group with internal area (.069 &plusmn; 3; p=0.004). There were no mortalities from cerebral vasospasm.
Conclusion: The rat double SAH model induces a mild, survivable, basilar artery vasospasm that can be used to study the pathophysiological mechanisms of cerebral vasospasm in a small animal model. A low and acceptable mortality rate is a significant criterion to be satisfied for an ideal SAH animal model so that the mechanisms of vasospasm can be elucidated 7, 8. Further modifications of the model can be made to adjust for increased severity of vasospasm and neurological exams.

Aneurysmal subarachnoid hemorrhage (SAH) is bleeding that occurs into the subarachnoid space when an aneurysm ruptures. While the morbidity and mortality from this event has been on a decline due to improved treatment approaches, the risk of vasospasm after subarachnoid hemorrhage continues to be the same as it was several years ago. The importance of establishing a comprehensive and reproducible animal model to identify initiating events of cerebral vasospasm has been the focus of research since the first use of rats in an experimental vasospasm model in 1979 by Barry et al. Early work in rats demonstrated that a single injection of autologous blood into the cisterna magna led to acute (within minutes) but not delayed cerebral vasospasm 3, 6, 14. Here we characterize a low mortality SAH rat model that results in reproducible delayed vasospasm.

実験的くも膜下出血後の脳血管攣縮遅延を評価するための低死亡率のラットモデル

Objective: To characterize and establish a reproducible model that demonstrates delayed cerebral vasospasm after aneurysmal subarachnoid hemorrhage (SAH) ...

医学

A Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

In this video publication a standardized mouse model of subarachnoid hemorrhage (SAH) is presented. Bleeding is induced by endovascular Circle of Willis perforation (CWp) and proven by intracranial pressure (ICP) monitoring. Thereby a homogenous blood distribution in subarachnoid spaces surrounding the arterial circulation and cerebellar fissures is achieved. Animal physiology is maintained by intubation, mechanical ventilation, and continuous on-line monitoring of various physiological and cardiovascular parameters: body temperature, systemic blood pressure, heart rate, and hemoglobin saturation. Thereby the cerebral perfusion pressure can be tightly monitored resulting in a less variable volume of extravasated blood. This allows a better standardization of endovascular filament perforation in mice and makes the whole model highly reproducible. Thus it is readily available for pharmacological and pathophysiological studies in wild type and genetically altered mice.

A standardized mouse model of subarachnoid hemorrhage by intraluminal Circle of Willis perforation is described. Vessel perforation and subarachnoid bleeding are monitored by intracranial pressure monitoring. In addition various vital parameters are recorded and controlled to maintain physiologic conditions.

くも膜下出血のマウスモデル

In this video publication a standardized mouse model of subarachnoid  hemorrhage (SAH) is presented. Bleeding is induced by endovascular Circle of  Willis ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

マウスにおけるモデリングのストローク：遠位中大脳動脈の永久的な凝固

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week protocol for repetitive hypoxic preconditioning (RHP) induces long-term protection against central nervous system (CNS) injury in a mouse model of focal ischemic stroke. RHP consists of 9 stochastic exposures to hypoxia that vary in both duration (2 or 4 hr) and intensity (8% and 11% O2). RHP reduces infarct volumes, blood-brain barrier (BBB) disruption, and the post-stroke inflammatory response for weeks following the last exposure to hypoxia, suggesting a long-term induction of an endogenous CNS-protective phenotype. The methodology for the dual quantification of infarct volume and BBB disruption is effective in assessing neurovascular protection in mice with RHP or other putative neuroprotectants. Adult male Swiss Webster mice were preconditioned by RHP or duration-equivalent exposures to 21% O2 (i.e. room air). A 60 min transient middle cerebral artery occlusion (tMCAo) was induced 2 weeks following the last hypoxic exposure. Both the occlusion and reperfusion were confirmed by transcranial laser Doppler flowmetry. Twenty-two hr after reperfusion, Evans Blue (EB) was intravenously administered through a tail vein injection. 2 hr later, animals were sacrificed by isoflurane overdose and brain sections were stained with 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride (TTC). Infarcts volumes were then quantified. Next, EB was extracted from the tissue over 48 hr to determine BBB disruption after tMCAo. In summary, RHP is a simple protocol that can be replicated, with minimal cost, to induce long-term endogenous neurovascular protection from stroke injury in mice, with the translational potential for other CNS-based and systemic pro-inflammatory disease states.

This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.

マウスにおける反復低酸素プレコンディショニングと過渡中大脳動脈閉塞後に神経血管保護の定量

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...

Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke involves middle cerebral artery occlusion (MCAO). Infarct zone, brain edema and blood-brain barrier (BBB) breakdown are measured as parameters that reflect the extent of brain injury after MCAO. A significant limitation to this method is that these measurements are normally obtained in different rat brain samples, leading to ethical and financial burdens due to the large number of rats that need to be euthanized for an appropriate sample size. Here we present a method to accurately assess brain injury following MCAO by measuring infarct zone, brain edema and BBB permeability in the same set of rat brains. This novel technique provides a more efficient way to evaluate the pathophysiology of stroke.

This protocol describes a novel technique of measuring the three most important parameters of ischemic brain injury on the same set of rodent brain samples. Using only one brain sample is highly advantageous in terms of ethical and economic costs.

げっ歯類の脳サンプルの単一のセットで脳卒中後脳浮腫、梗塞ゾーンおよび血液脳関門破壊を測定する

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke ...

神経科学

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% of the total stroke-related mortality with an important morbidity in terms of neurological outcome. A delayed cerebral vasospasm (CVS) may occur most often in association with a delayed cerebral ischemia. Different animal models of SAH are now being used including endovascular perforation and direct injection of blood into the cisterna magna or even the prechiasmatic cistern, each exhibiting distinct advantages and disadvantages. In this article, a standardized mouse model of SAH by double direct injection of determined volumes of autologous whole blood into the cisterna magna is presented. Briefly, mice were weighed and then anesthetized by isoflurane inhalation. Then, the animal was placed in a reclining position on a heated blanket maintaining a rectal temperature of 37 &#176;C and positioned in a stereotactic frame with a cervical bend of about 30&#176;. Once in place, the tip of an elongated glass micropipette filled with the homologous arterial blood taken from carotid artery of another mouse of the same age and gender (C57Bl/6J) was positioned at a right angle in contact with the atlanto-occipital membrane by means of a micromanipulator. Then 60 &#181;L of blood was injected in the cisterna magna followed by a 30&#176; downward tilt of the animal for 2 minutes. The second infusion of 30 &#181;L of blood into the cisterna magna was performed 24 h after the first one. The individual follow-up of each animal is carried out daily (careful evaluation of weight and well-being). This procedure allows a predictable and highly reproducible distribution of blood, likely accompanied by intracranial pressure elevation that can be mimicked by an equivalent injection of an artificial cerebral spinal fluid (CSF), and represents an acute to mild-model of SAH inducing low mortality.

We described in this protocol a standardized subarachnoid hemorrhage (SAH) mouse model by a double injection of autologous whole-blood into the cisterna magna. The high degree of standardization of the double-injection procedure represents a middle-to-acute model of SAH with relative safety regarding mortality.

くも膜下出血のモデルとしての水槽マグナへの血液の二重直接注射

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...

Analysis of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage with High Frequency Transcranial Duplex Ultrasound

Cerebral vasospasm that occurs in the weeks after subarachnoid hemorrhage, a type of hemorrhagic stroke, contributes to delayed cerebral ischemia. A problem encountered in experimental studies using murine models of SAH is that methods for in vivo monitoring of cerebral vasospasm in mice are lacking. Here, we demonstrate the application of high frequency ultrasound to perform transcranial Duplex sonography examinations on mice. Using the method, the internal carotid arteries (ICA) could be identified. The blood flow velocities in the intracranial ICAs were accelerated significantly after induction of SAH, while blood flow velocities in the extracranial ICAs remained low, indicating cerebral vasospasm. In conclusion, the method demonstrated here allows functional, noninvasive in vivo monitoring of cerebral vasospasm in a murine SAH model.

The aim of this manuscript is to present a sonography-based method that allows in vivo imaging of blood flow in cerebral arteries in mice. We demonstrate its application to determine changes in blood flow velocities associated with vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage (SAH).

高周波経頭蓋二重超音波を用いたくも膜下出血のマウスモデルにおける脳血管れん縮の解析

Cerebral vasospasm that occurs in the weeks after subarachnoid hemorrhage, a type of hemorrhagic stroke, contributes to delayed cerebral ischemia. A ...

Pre-Chiasmatic, Single Injection of Autologous Blood to Induce Experimental Subarachnoid Hemorrhage in a Rat Model

Despite advances in treatment over the last decades, subarachnoid hemorrhage (SAH) continues to carry a high burden of morbidity and mortality, largely afflicting a fairly young population. Several animal models of SAH have been developed to investigate the pathophysiological mechanisms behind SAH and to test pharmacological interventions. The pre-chiasmatic, single injection model in the rat presented in this article is an experimental model of SAH with a predetermined blood volume. Briefly, the animal is anesthetized, intubated, and kept under mechanical ventilation. Temperature is regulated with a heating pad. A catheter is placed in the tail artery, enabling continuous blood pressure measurement as well as blood sampling. The atlantooccipital membrane is incised and a catheter for pressure recording is placed in the cisterna magna to enable intracerebral pressure measurement. This catheter can also be used for intrathecal therapeutic interventions. The rat is placed in a stereotaxic frame, a burr hole is drilled anteriorly to the bregma, and a catheter is inserted through the burr hole and placed just anterior to the optic chiasm. Autologous blood (0.3 mL) is withdrawn from the tail catheter and manually injected. This results in a rise of intracerebral pressure and a decrease of cerebral blood flow. The animal is kept sedated for 30 min and given subcutaneous saline and analgesics. The animal is extubated and returned to its cage. The pre-chiasmatic model has a high reproducibility rate and limited variation between animals due to the pre-determined blood volume. It mimics SAH in humans making it a relevant model for SAH research.

Subarachnoid hemorrhage continues to carry a high burden of mortality and morbidity in man. To facilitate further research into the condition and its pathophysiology, a pre-chiasmatic, single injection model is presented.

ラットモデルにおける実験的くも膜下出血を誘発するための自己血の交叉前単回注射

Despite advances in treatment over the last decades, subarachnoid hemorrhage (SAH) continues to carry a high burden of morbidity and mortality, largely ...

Endovascular Perforation Model for Subarachnoid Hemorrhage Combined with Magnetic Resonance Imaging (MRI)

The endovascular filament perforation model to mimic subarachnoid hemorrhage (SAH) is a commonly used model - however, the technique can cause a high mortality rate as well as an uncontrollable volume of SAH and other intracranial complications such as stroke or intracranial hemorrhage. In this protocol, a standardized SAH mouse model is presented, induced by endovascular filament perforation, combined with magnetic resonance imaging (MRI) 24 h after operation to ensure the correct bleeding site and exclude other relevant intracranial pathologies. Briefly, C57BL/6J mice are anesthetized with an intraperitoneal ketamine/xylazine (70 mg/16 mg/kg body weight) injection and placed in a supine position. After midline neck incision, the common carotid artery (CCA) and carotid bifurcation are exposed, and a 5-0 non-absorbable monofilament polypropylene suture is inserted in a retrograde fashion into the external carotid artery (ECA) and advanced into the common carotid artery. Then, the filament is invaginated into the internal carotid artery (ICA) and pushed forward to perforate the anterior cerebral artery (ACA). After recovery from surgery, mice undergo a 7.0 T MRI 24 h later. The volume of bleeding can be quantified and graded via postoperative MRI, enabling a robust experimental SAH group with the option to perform further subgroup analyses based on blood quantity.

Endovascular Perforation Model for Subarachnoid Hemorrhage Combined with Magnetic Resonance Imaging MRI

Here we present a standardized SAH mouse model, induced by endovascular filament perforation, combined with magnetic resonance imaging (MRI) 24 h after operation to ensure the correct bleeding site and exclude other relevant intracranial pathologies.

くも膜下出血の血管内穿孔モデルと磁気共鳴画像法(MRI)の組み合わせ

The endovascular filament perforation model to mimic subarachnoid hemorrhage (SAH) is a commonly used model - however, the technique can cause a high ...