この作品はセルバンテス デによって支えられたサラッド カルロス III (計画アジア デ私 + D + 私 2013-2016): CIBER (CB06/02/0053)、PI16-00860 CP15 00012 協調融資欧州開発地域基金 'ヨーロッパを達成する方法' を付与 (ERDF)。在マドリード (2016-T1/バイオ-1105) と私の地域の政府のAtracción ・ デ ・ タレントプログラムに支えられて + スペイン Ministerio デ Economía、インドゥストリア y Competitividad (BIO2017-85056-P) の D Excelencia です。ASM セルバンテス ・ デ ・からミゲル サーブレット交わりに支えられてサラッド カルロス 3 世 (MS15/00012) の欧州社会基金の協調融資「あなたの未来への投資」(ESF) と ERDF。

1. 抗生物質耐性遺伝子を符号化実験システムの構築
注: ここで大腸菌MG1655 プラスミッドまたは染色体符号化された抗生物質耐性遺伝子の受信者のひずみとして使用されていた。抗生物質耐性遺伝子は、染色体またはマルチコピー プラスミッドそれ以外同質遺伝子系統 (図 1) にエンコードされます。
<ol><li>
MG1655 の染色体の λ のバクテリオファージの統合サイト (attB)20の抗生物質耐性遺伝子の挿入。
	<ol>
<li>Pcr 法による染色体attBサイトの両側に 500 bp 長い領域を増幅します。YbhC F のオリゴヌクレオチドを使用して (5'-CCTGTACCGTACAGAGTAAT-3')、attB R (5'-GCCCGCCACCCTCCGGGCCGGTATAAAAAAGCAGGCTTCA-3') 左相同領域、attB F (5'-AGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTATACTAACTTGAGCGAAA-3') と YbhB/R (5'-TGGCGATAATATTTCACCGC-3') 右の 1 つ。プライマー Tem1-pBAD-F を使用してblaTEM 1抵抗性遺伝子の増幅 (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3') と Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3')。約 20 のプライマーを設計の相補性に融合するのに起こっているフラグメントを示すシーケンス (5' 末端) の bp。</li>
		<li>抗生物質耐性遺伝子 PCR 製品 (そのプロモーター領域を含む) に相同領域をヒューズ 30 分 50 ° C で等温アセンブリ21を使用して。</li>
		<li>Electroporate MG1655 細胞含むプラスミド pKOBEG の。 注: pKOBEG は、λ を含む感温ベクター赤い機械、相同性に基づく対立遺伝子を染色体と PCR 製品22間交流します。<ol>
<li>1.1.2 手順23から製品の 1 μ L を使用して、4 ° C で 2 mm キュヴェット electrocompetent 細胞の 40 μ L と 2.5 kV。赤い機械を 1 mL の流体培養基 LB + 0.2% アラビノース、λ の式を維持するために細胞を再懸濁します。</li>
			<li>および microfuge の管に総量を転送し、染色体に挿入した抵抗のマーカーの形質発現を許可する強烈な揺れ (軌道シェーカーで 200 rpm) と 30 ° C (pKOBEG の許容温度) で 2 h を孵化させなさい。</li>
			<li>(アンピシリンまたはblaTEM 1100 mg/l で carbenicillin) の抗生物質耐性遺伝子の選択に適切な抗生物質を含んでいる LB 寒天培地で細胞をプレートします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>1 つのシャーレに 100 μ L をプレートしボリュームの残りの部分をスピン、新鮮な流体培養基 LB の 100 μ L でそれを再懸濁します、もう一つのシャーレにプレートします。42 ° C で一晩インキュベートします。 注: この温度は pKOBEG を複製するための寛容です。これらの条件で成長することができる植民地 pKOBEG を失っている、 attBサイトに統合された抵抗性遺伝子を提示 (便宜上この株が呼び出されますMG1655::レザここから)。</li>
		<li>クロラムフェニ コールを板の興味のコロニーをレプリケートすることによって pKOBEG の損失のためのテスト (どの pKOBEG に対する抗生物質には抵抗性マーカーが含まれています)。 注: 30 º C の許容温クロラムフェニ コール プレートの成長の欠如はプラスミッドの不在を示すです。</li>
		<li>クローンを確認するために PCR 増幅外部プライマー YbhC Extern を使用して建設 (5'-TTTGTGACCAGAAGACCGCA-3') と YbhB Extern (5'-CTCATCAGTAACGATCTGCG-3')、ゲル電気泳動による増幅とシーケンスの正しいサイズを確認、挿入された遺伝子のシーケンスが正しいことを確認する精製した製品です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
マルチコピー プラスミドに抗生物質耐性遺伝子を挿入します。 注: 非常に高コピー数とプラスミドは、細菌のホストのフィットネスで大規模な削減を課す傾向がある、ためにをお勧めします p3655 など、レプリケーションの天然起源のマルチコピー プラスミドの使用 (pSU18T pBADgfp2、 ColE1 タイプの起源のレプリケーション24)。これらのプラスミッドは通常程度の適度なコピー数を提示細胞 1 個あたり 15 ~ 20 枚。<ol>
<li>PCR (プロモーター領域を含む) 選択の抗生物質耐性遺伝子を増幅する PCR の製品に対する、プラスミッドの PCR 増幅バックボーンに縛る。<ol>
<li>PCR 増幅抗生物質耐性遺伝子;blaTEM 1使用プライマー Tem1-pBAD-F (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3') と Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3')。</li>
			<li>製造元の指示に従って、T4 ポリヌクレオチド キナーゼを使用して精製した製品をリン酸化します。</li>
			<li>PCR 増幅を使用して高品質なポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチド pBAD F プラスミド バックボーン (5'-CGTTGATCGGCACGTAAGAG-3') pBAD r (5'-AAACGACGGCCAGTGCCAAG-3')。</li>
			<li>T4 リガーゼを使って両方の PCR のフラグメントを縛る製造元のガイドラインに従います。</li>
		</ol>
</li>
		<li>Electroporate、electrocompetent大腸菌dh 5 位 α 細胞の結紮製品と適切な抗生物質 (アンピシリンまたは 100 mg/L で carbenicillin の抗生物質耐性遺伝子の選択の 1 μ L の最大 40 μ L を前に説明しました。blaTEM 1) 用とプラスミドのバックボーン。 注: ここでアラビノースを LB で補うことは必要ではありません。</li>
		<li>読者の好みの市販の小型準備キットを使用してプラスミッドを抽出します。<ol>
<li>常温 12,000 × g で遠心分離で一晩かけて培養 5 mL を収穫します。再懸濁液の 250 μ L で細胞を再懸濁します、よく混ぜます。溶解液の 250 μ L を加え、よく混ぜます。中和の 350 μ L を加え、よく混ぜます。</li>
			<li>1 分間遠心するキットで提供される DNA 結合列に上清を転送し、流れを破棄します。500 μ L の洗浄液、1 分間遠心分離し、洗うたびに流れる通路を破棄 2 回を洗い流します。残留洗浄バッファーを削除する 1 の追加分の空の列を遠心します。</li>
			<li>クリーン チューブに列を配置し、浄化された DNA を溶出する膜に超純水の 50 μ L を追加します。1-2 分間遠心し、収集する流れは、精製プラスミドを含んでいます。サンガー シーケンスのシーケンスが正しいことと突然変異が進化の実験の前に抵抗性遺伝子の存在しないことを確認する挿入されたシーケンス外からプライマーを使用してプラスミッドの興味の遺伝子。</li>
		</ol>
</li>
		<li>シーケンスを確認すると、electroporate プラスミド大腸菌MG1655 ひずみ、前述のように。 注: これにより、ひずみMG1655/プレサ。
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 進化救助抗生の抵抗 (図 1) を実験的進化方法
<ol><li>LB の版の調査の下で系統を連勝: MG1655:: MG1655 の影響を受けやすい親株と MG1655/プレサレザ。 LB の版に抗生物質を追加する必要はありませんので注意:、プラスミド プレサは MG1655 で安定しているはずです。エシェリヒア属大腸菌の突然変異率は、建設が確認される各ステップでプラスミッド シーケンスを確認する必要はありませんように十分に低い。</li>
	<li>各ウェルに LB の 200 μ L で 96 ウェル プレートを準備し、独立した井戸 (ひずみあたり 1 プレート) の各ひずみ 48 隔離されたコロニーを接種します。一晩で、37 ° C、200 rpm 版を孵化させなさい。これらの創始者集団の冷凍ストックを維持します。 注: 96 ウェル プレートで文化の交差汚染の制御を防ぎ、96 ウェル プレートで無菌培地で接種の井戸の間をインターカ レートによってプレート、市松模様を使用します。全体の実験的進化の過程でこのプレートのデザインを使用します。</li>
	<li>抗生物質研究中の抗生物質の濃度を各ウェルに LB の 198 μ L で新しい 96 ウェル プレートで創設者の集団とプレートの各ウェルから接種した 2 μ L で進化レスキュー実験を開始します。進化の救助のアプローチのためには、各 3 系統の LB の抗生物質の 1/4 または 1/8 (マイク、決定以前25) 最小発育阻止濃度を起動し、毎日の抗生物質の濃度を 2 倍します。抵抗の突然変異26を取得するのに人口のチャンスを最大化するためにこのアプローチを使用します。37 ° C で 20 時間の 200 の rpm 版を孵化させなさい。 注: は、創設者の人口の一晩の外径を測定します。OD に系統間の差がある場合もあたりのセルの同じ番号を持つ実験を開始する初期の接種を修正します。</li>
	<li>毎日、一晩培養後各人口の外径を測定、前日よりも抗生物質の濃度が 2 倍の 96 ウェル プレートに新しい 2.3 で説明されているように、文化の転送を実行します。プレートは、37 ° C、200 rpm 20 h を孵化させなさい。 注: 1: 100 希釈倍率は、1 日あたり約 6-7 世代を生成します。</li>
	<li>並行して、抗生物質の不在の 2.3 と 2.4 で説明同じ条件でそれぞれのひずみ制御集団を反映します。 注: コントロール集団を助ける抗生物質や実験条件に適応する細菌を助ける一般的な突然変異の存在のために生じた突然変異を区別します。抗生物質の不在で生じた平行変異は実験条件に適応する細菌を支援する可能性が高いと抗生物質耐性に関連していません。</li>
	<li>600 の波長で吸光度を測定することによって存続の人口数を毎日追跡プレート リーダーを使用して文化の nm (OD)。 注: 光学濃度値は、0.1 の人口の絶滅を示すより低い。生存曲線の例については図 2を参照してください。</li>
	<li>(すべての 3-5 日) 定期的に人口のすべての冷凍ストックを維持します。</li>
	<li>ログランク テスト [パッケージ RStudio (バージョン 0.99.486) の「サバイバル」] を使用して、抗生物質12の濃度の増加の下で時間をかけて異なる系統の個体群の生存率に有意差を確認します。 注: この実験は、マルチコピー プラスミドが特定の抗生物質や遺伝子研究中の抗生物質耐性の進化を増強するかどうかは決定されます。</li>
</ol>3. 抗生物質抵抗 (図 1) の進化の解明
<ol><li>系統、治療集団とクローンの代表的な数から総 DNA の抽出を実行します。親系統が含まれます (MG1655、MG1655::レザと MG1655/プレサ) 実験中に蓄積変異を検出できるようにします。 注: DNA 抽出キットの例は、材料の表を参照してください。各キットには別のプロトコルメーカーの指示に従います。</li>
	<li>DNA の品質と濃度を定量化します。DNA の品質と濃度を決定するさまざまな方法があります。260 nm/230 nm の吸光度 260 nm/280 nm 比の測定品質を決定します。製造元の指示に従って DNA 濃度を測定する蛍光、DNA 結合色素を使用し、アガロース電気泳動することを確認しますは劣化 DNA または RNA 汚染します。</li>
	<li>抗生物質耐性の遺伝的基礎を調査する全体集団と個々 のサンプルの使用ディープ DNA シーケンスを複製します。 注: 人類遺伝学、オックスフォード、イギリスのウェルカム ・ トラスト ・ センターですべてのシーケンス処理を実施しました。詳細は、サン ミジャンらを参照してください。201612。</li>
	<li>Breseq 0.26.1 パイプライン27,28を使用すると、個体群の変異の頻度を推定する多態性モードを使用して突然変異を検出できます。実験中に蓄積している突然変異を検出する親のゲノムに異なる進化ゲノムを比較します。</li>
	<li>一般の実験条件 (に適応する細菌の突然変異を区別するための抗生物質の濃度を増加させるの進化は突然変異蓄積と人口のコントロール集団で並列比較それらは制御集団で発見) と抗生物質耐性 (抗生物質の圧力を受ける集団の排他的に見られるもの) に携わる。 注: 平行変異の数は通常低ので、治療の間の異なる平行変異を容易に評価できます。見つけることはかなりそうだ検討中の抗生物質耐性遺伝子の変異から離れて他の突然変異は染色体における抗生物質耐性、ポリン ・流出のシステムのための12のような突然変異に関連付けられています。</li>
	<li>このプロトコルのセクション 1 と同じアプローチを使用して親の緊張で抗生物質耐性遺伝子の変異を再構築します。1.1 と 1.2 (進化した遺伝子を PCR のテンプレートとして使用) 親の背景で新しい突然変異を導入するプロトコルの点に従ってください。突然変異の役割を確認するこれらの新建設の抗生の抵抗の表現型を分析します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Neill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TACKLING+DRUG-RESISTANT+INFECTIONS+GLOBALLY:+FINAL+REPORT+AND+RECOMMENDATIONS.">TACKLING DRUG-RESISTANT INFECTIONS GLOBALLY: FINAL REPORT AND RECOMMENDATIONS.</a> Review on Antimicrobal Resistance. , (2016).</li><li>Palmer, A. C., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding,+predicting+and+manipulating+the+genotypic+evolution+of+antibiotic+resistance.">Understanding, predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance.</a> Nat Rev Genet. 14 (4), 243-248 (2013).</li><li>MacLean, R. C., Hall, A. R., Perron, G. 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著者が明らかに何もありません。

分子生物学、実験進化マルチコピー プラスミド細菌の抗生物質耐性の進化の役割を調べるために考案ディープの DNA シーケンスを組み合わせた新しいプロトコルを提案します。このプロトコルは、さまざまな分野からの技術を結合がそれを開発するために必要なすべての方法は単純であり通常の微生物学実験室で実行することができます。プロトコルの最も重要な手順は、モデル システム系...

細菌の抗生の抵抗は重大な健康問題1です。基本的なレベルで病原細菌の抗生物質耐性の普及、自然淘汰の2,の3による進化の単純な例です。簡単に言えば、抗生物質の使用は、耐性菌の選択を生成します。進化生物学の重要な問題は、したがって、抗生物質への耐性を進化する細菌集団の能力に影響を与える要因を理解します。選択の実験は、細菌の進化生物学を調査するための非常に強力なツールとして浮上しているし、このフィールドは幅広い進化問題4,5,6に信じられないほどの洞察力を生産しています。実験的進化の 1 つの親株から開始された細菌集団が定義され、厳しく管理された条件の下で連続継代します。これらの文化の成長中に発生する突然変異のいくつかの増加細菌のフィットネス、これらは自然淘汰によって文化を介して 。実験では、人口のサンプルは非進化する冷凍化石レコードを作成する定期的に低温保持されます。細菌集団を進化を特徴付けるためのアプローチの広い数を使用できますが、2 つの最も一般的な方法は、フィットネスの試金、遠い祖先と全ゲノム配列が進化した細菌の競争力を測定ドライブの適応の遺伝の変更を識別するために使用されます。リチャード Lenski および同僚7,8で先駆的な仕事は、次の実験進化の標準的なアプローチはレプリケート人口の比較的小さい数に挑戦するされている (通常 < 10) 新しいへの適応に環境チャレンジ、新しい炭素源、温度、捕食性ファージなど。
抗生物質耐性菌によって引き起こされる感染症抵抗は患者の体内を致死量に抗生物質の濃度を高めることが可能だが十分に高いとき大きな問題になります。臨床医は細菌がこのしきい値抗生物質濃度臨床ブレークポイント上抗生物質の高用量への抵抗を進化することができる内容に興味があるため。これを実験的に研究する方法?細菌集団の数が少ないが、高用量の抗生物質の挑戦レンスキー スタイルのように実験、その後、最も可能性の高い結果は、抗生物質が絶滅の危機に個体群のすべてを駆動すること。同時に使用される抗生物質の投与量は、親株の最小発育阻止濃度 (MIC) を下回る場合、ない細菌の集団は、抵抗性の臨床的に関連するレベルを進化していく可能性が高い場合は特に抵抗には、大きな代償が伴います。これらの 2 つのシナリオ間の 1 つの妥協は、「進化レスキュー」実験9,10,11を使用します。このアプローチは文化の非常に大きい数で (通常 > 40) が時間をかけて増加、通常抗生物質の濃度を倍にして毎日12抗生物質の用量で挑戦します。この実験の特徴は、高められた抵抗を進化していない人口が絶滅に追い込まれることです。この方法でほとんどの個体群は絶滅し、駆動されるが、少数は、高レベルの耐性を進化させることによって保持されます。本稿では、この実験的なデザインを使用して抵抗性の進化にマルチコピー プラスミドの貢献を調査する方法を示す.
細菌は、2 つの主要ルート、染色体突然変異およびモバイル遺伝的要素、主プラスミド13の取得を通じた抗生物質に耐性を獲得します。プラスミドは、活用14,15による細菌の抵抗性遺伝子を転送することができるので抗生物質耐性の進化で重要な役割を再生します。プラスミドは彼らのサイズおよび生物学によると 2 つのグループに分けることができます:「小」、高コピー数細菌の細胞と「大」と低コピー数の16,17。抵抗と細菌15マルチ抵抗の普及の主要なドライバーである接合性プラスミドが含まれるために、抗生物質耐性の進化での大型プラスミドの役割を広く記載されています。小さなマルチコピー プラスミドも細菌17,18, 非常に一般的な彼らはしばしば抗生物質耐性遺伝子19のコードします。ただし、抗生物質耐性の進化で小さなマルチコピー プラスミドの役割より少ない程度に研究されています。
最近の作品ではマルチコピー プラスミドが高い遺伝子コピー セル12数による遺伝子突然変異率を増やすことによって彼らを運ぶ遺伝子の進化を加速させる可能性を提案します。大腸菌の菌株 MG1655 と β-ラクタマーゼ遺伝子blaTEM 1実験モデルを用いたマルチコピー プラスミド加速の第三世代に耐性 TEM 1 突然変異の出現率であることが示されました。セファロスポリン セフタジジム。マルチコピーのプラスミドがあります抗生物質耐性の進化で重要な役割を果たすことが示唆されました。
今回開発した手法の詳細な説明、マルチコピー プラスミド性抗生物質耐性の進化を調査します。このメソッドは 3 つの異なる手順: 調査マルチコピー プラスミッドまたはホストの細菌の染色体のどちらかの下で遺伝子の最初に挿入します。第二に、実験的進化 (進化救助) の選択的な圧力に適応するため別系統の可能性を評価するために使用します。そして第三に、DNA シークエンシングと親の遺伝子型で個別に疑いのある突然変異を再構成を用いたプラスミド性の進化の分子基盤を決定します。
最後に、ここで説明されているプロトコルは、抗生物質耐性の進化を調査するため設計されました、1 つ主張することがこのメソッドは一般に任意の複数部数の突然変異によって取得した技術革新の進化を分析し便利かもしれないプラスミド エンコード遺伝子。

<table><tbody><tr><td>Thermocycler</td><td>BioRad</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>BiorRad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Electroporation cuvettes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z706078</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Memmert</td><td>UF1060</td><td></td></tr><tr><td>Incubator (shaker)</td><td>Cole-Parmer Ltd</td><td>SI500</td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis power supply</td><td>BioRad</td><td>1645070</td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Electrophoresis chamber</td><td>BioRad</td><td>1704405</td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Pippettes</td><td>Biohit</td><td>725020, 725050, 725060, 725070</td><td></td></tr><tr><td>Multi-channel pippetes</td><td>Biohit</td><td>728220, 728230,&lt;br/&gt; 728240</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader Synergy HTX</td><td>BioTek</td><td>BTS1LF</td><td></td></tr><tr><td>Inoculating loops</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8388</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Falcon</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>BD Difco</td><td>DF0446-17-3</td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Fisher scientific</td><td>BP1425-500</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Polymerase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F533S</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>Resctriction enzymes</td><td>Fermentas FastDigest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Plasmid extraction kit</td></tr><tr><td>Wizard Genomic DNA Purification Kit</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>gDNA extraction kit</td></tr><tr><td>DNeasy Blood &amp;amp; Tissue Kits</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>gDNA extraction kit</td></tr><tr><td>Electroporation cuvettes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z706078</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9054</td><td></td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>ClearLine</td><td>390701</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates (-80&amp;ordm;C storage)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>249945</td><td></td></tr><tr><td>QuantiFluor dsDNA System</td><td>Promega</td><td>E2670</td><td>Quantification of DNA concentartion</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioRad</td><td>1613100</td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>50x TAE buffer</td><td>BioRad</td><td>1610743</td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EK0031</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0014</td><td></td></tr></tbody></table>

testing the role of multicopy plasmids in the evolution of antibiotic resistance

マルチコピー プラスミドは原核生物に非常に多いが、細菌の進化におけるそれらの役割のままかり。我々 は最近、マルチコピー プラスミッドによって指定されたセルあたり遺伝子コピー数の増加がプラスミド エンコード遺伝子の進化を加速させる可能性を示した。この作品は、マルチコピー プラスミドの遺伝子の進化を促進するための能力をテストする実験システムを提案する.分子生物学の単純なメソッドを使用して、抗生物質耐性遺伝子を大腸菌MG1655、染色体またはマルチコピー プラスミド上に挿入できるモデル システムを構築しました。抗生物質の濃度の増加の下で異なる系統を反映する実験的進化のアプローチを使用して、我々 は時間をかけて細菌集団の生存率を測定します。抗生物質分子と抵抗性遺伝子の選択は、遺伝子突然変異の買収を通じて抵抗を与えることができるだけので、です。この「進化レスキュー」アプローチは、マルチコピー プラスミドの抗生物質抵抗性の獲得を促進するための可能性をテストする簡単な方法を提供します。実験システムの次のステップでは、抗生物質耐性の分子基盤が特徴です。抗生物質耐性の獲得のための責任の突然変異を識別するために、我々 は全体の人口とクローンから得られた試料のディープの DNA シーケンス使用します。最後に、調査の下で遺伝子の変異の役割を確認する我々 は親の背景にそれらを再構築し、結果系統の抵抗の表現型をテストします。

筆者らは, β-ラクタマーゼ遺伝子blaTEM 1第 3 世代セファロスポリン セフタジジム12耐性に向けて進化を調べた。この遺伝子は、 blaTEM 1の変異がセフタジジム29などのセファロスポリンを分解する TEM 1 の活動の範囲を拡大することができます TEM 1 セフタジジムに抵抗を与えないがので選ばれました。Β-ラ?...

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抗生物質耐性の進化におけるマルチコピー プラスミドの役割のテスト |遺伝学 |ビデオ

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

抗生物質耐性の進化のマルチコピー プラスミドのロールのテスト

抗生物質耐性の進化でマルチコピー プラスミドの役割をテストするための実験方法をご紹介します。

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

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11.5K ビュー.  Universidad Complutense de Madrid. 抗生物質耐性の進化でマルチコピー プラスミドの役割をテストするための実験方法をご紹介します。

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Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.

This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.

クラス1インテグロンおよび遺伝子カセットのための食品のスクリーニング

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

環境学

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons of conjugation frequency under different conditions are required to understand how the conjugative element spreads in nature. However, conventional methods for comparing conjugation frequency are not appropriate for in-depth comparisons because of the high background caused by the occurrence of additional conjugation events on the selective plate. We successfully reduced the background by introducing a most probable number (MPN) method and a higher concentration of antibiotics to prevent further conjugation in selective liquid medium. In addition, we developed a protocol for estimating the probability of how often donor cells initiate conjugation by sorting single donor cells into recipient pools by fluorescence-activated cell sorting (FACS). Using two plasmids, pBP136 and pCAR1, the differences in conjugation frequency in Pseudomonas putida cells could be detected in liquid medium at different stirring rates. The frequencies of conjugation initiation were higher for pBP136 than for pCAR1. Using these results, we can better understand the conjugation features in these two plasmids.

With an aim to understand the behaviors of various bacterial conjugative DNA elements under different conditions, we describe a protocol for detecting differences in conjugation frequency, with high resolution, to estimate how efficiently the donor bacterium initiates conjugation.

細菌の活用頻度の高解像度の比較

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

遺伝学

Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial populations. This is especially the case under rapidly changing environments such as fluctuating antibiotics exposure. We recently showed that plasmids maintain antibiotic resistance genes in Escherichia coli without positive selection for the plasmid presence. Here we describe an experimental system that allows following both the plasmid genotype and phenotype in long-term evolution experiments. We use molecular techniques to design a model plasmid that is subsequently introduced to an experimental evolution batch system approach in an E. coli host. We follow the plasmid frequency over time by applying replica plating of the E. coli populations while quantifying the antibiotic resistance persistence. In addition, we monitor the conformation of plasmids in host cells by analyzing the extent of plasmid multimer formation by plasmid nicking and agarose gel electrophoresis. Such an approach allows us to visualize not only the genome size of evolving plasmids but also their topological conformation-a factor highly important for plasmid inheritance. Our system combines molecular strategies with traditional microbiology approaches and provides a set-up to follow plasmids in bacterial populations over a long time. The presented approach can be applied to study a wide range of mobile genetic elements in the future.

Our experimental approach provides a strategy to follow plasmid abundance and antibiotic resistance over time in bacterial populations.

実験的進化論におけるプラスミド媒介抗生物質耐性の定量化

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial ...

Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli

Conjugation represents one of the main mechanisms facilitating horizontal gene transfer in Gram-negative bacteria. This work describes methods for the study of the mobilization of naturally occurring conjugative plasmids, using two naturally-occurring plasmids as an example. These protocols rely on the differential presence of selectable markers in donor, recipient, and conjugative plasmid. Specifically, the methods described include 1) the identification of natural conjugative plasmids, 2) the quantification of conjugation rates in solid culture, and 3) the diagnostic detection of the antibiotic resistance genes and plasmid replicon types in transconjugant recipients by polymerase chain reaction (PCR). The protocols described here have been developed in the context of studying the evolutionary ecology of horizontal gene transfer, to screen for the presence of conjugative plasmids carrying antibiotic-resistance genes in bacteria found in the environment. The efficient transfer of conjugative plasmids observed in these experiments in culture highlights the biological relevance of conjugation as a mechanism promoting horizontal gene transfer in general and the spread of antibiotic resistance in particular.

Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli

Conjugation mediates horizontal gene transfer by mobilizing plasmid DNA across two different cells, facilitating the spread of beneficial genes. This work describes a widely-used method for the efficient detection of conjugative plasmid transfer, based on the use of differential markers in the conjugative plasmid, donor, and recipient to detect transconjugation.

大腸菌における天然接合プラスミドを介した遺伝子水平伝播の検出

Conjugation represents one of the main mechanisms facilitating horizontal gene transfer in Gram-negative bacteria. This work describes methods for the ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

発注済み、緑膿菌ひずみ PA14 トランスポゾン挿入変異体の非冗長ライブラリのレプリケーション

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

免疫・感染学

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this challenge, dereplication, which is the process of identifying known compounds, is performed on samples of interest. Methods for dereplication such as analytical separation followed by mass spectrometry are time-consuming and resource-intensive. To improve the dereplication process, we have developed the antibiotic resistance platform (ARP). The ARP is a library of approximately 100 antibiotic resistance genes that have been individually cloned into Escherichia coli. This strain collection has many applications, including a cost-effective and facile method for antibiotic dereplication. The process involves the fermentation of antibiotic-producing microbes on the surface of rectangular Petri dishes containing solid medium, thereby allowing for the secretion and diffusion of secondary metabolites through the medium. After a 6 day fermentation period, the microbial biomass is removed, and a thin agar-overlay is added to the Petri dish to create a smooth surface and enable the growth of the E. coli indicator strains. Our collection of ARP strains is then pinned onto the surface of the antibiotic-containing Petri dish. The plate is next incubated overnight to allow for E. coli growth on the surface of the overlay. Only strains containing resistance to a specific antibiotic (or class) grow on this surface enabling rapid identification of the produced compound. This method has been successfully used for the identification of producers of known antibiotics and as a means to identify those producing novel compounds.

We describe a platform that utilizes a library of isogenic antibiotic resistant Escherichia coli for the dereplication of antibiotics. The identity of an antibiotic produced by bacteria or fungi can be deduced by the growth of E. coli expressing its respective resistance gene. This platform is economically effective and time-efficient.

抗生物質耐性プラットフォームを用いた抗生物質脱複製

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

多剤排出システムの特性評価のための単一コピー遺伝子発現

Characterizing Multidrug Efflux Systems in Acinetobacter baumannii Using an Efflux&#45;Deficient Bacterial Strain and a Single&#45;Copy Gene Expression System

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend the mechanisms behind this resistance to design new and effective therapeutic options. Unfortunately, our ability to investigate these mechanisms in A. baumannii is hindered by the paucity of suitable genetic manipulation tools. Here, we describe methods for utilizing a chromosomal mini-Tn7-based system to achieve single-copy gene expression in an A. baumannii strain that lacks functional RND-type efflux mechanisms. Single-copy insertion and inducible efflux pump expression are quite advantageous, as the presence of RND efflux operons on high-copy number plasmids is often poorly tolerated by bacterial cells. Moreover, incorporating recombinant mini-Tn7 expression vectors into the chromosome of a surrogate A. baumannii host with increased efflux sensitivity helps circumvent interference from other efflux pumps. This system is valuable not only for investigating uncharacterized bacterial efflux pumps but also for assessing the effectiveness of potential inhibitors targeting these pumps.

著者スポットライト:排出欠損細菌株と単一コピー遺伝子発現システムを使用した抗生物質耐性研究の進歩

We describe a facile procedure for the single-copy chromosomal complementation of an efflux pump gene using a mini-Tn7-based expression system into an engineered efflux-deficient strain of Acinetobacter baumannii. This precise genetic tool allows for controlled gene expression, which is key for the characterization of efflux pumps in multidrug resistant pathogens.

排出不全細菌株と単一コピー遺伝子発現システムを用いた アシネトバクター・バウマニの 多剤排出システムの特性評価

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend ...

Bacterial Transformation

<h4>Background</h4>

In early 20th century, pneumonia was accountable for a large portion of infectious disease deaths1. In order to develop an effective vaccine against pneumonia, Frederick Griffith set out to study two different strains of the Streptococcus pneumoniae: a non-virulent strain with a rough appearance (R-strain) and a virulent strain with a smooth appearance (S-strain) due to an outer polysaccharide capsule2. This outer layer of the S-strain bacteria enabled them to withstand the host immune system, eventually leading to a life-threatening illness. When Griffith separately injected mice with heat-killed bacteria of either strain, the mice lived. However, when he injected mice with a combination of the heat-killed S-strain with live R-strain, the mice died2. When he analyzed the samples obtained from dead mice injected with the combination, he observed live S-strain bacteria to be present. In 1928, Griffith noted that a &#8220;transformation&#8221; process must have occurred to change the nonvirulent bacteria into the virulent strain. As the first known discovery of bacterial transformation, his discovery paved the way for the development of an essential tool in genetic engineering - transformation3.

Transformation is the genetic change in a cell due to the intake of DNA from the environment. In Griffith&#8217;s experiment, the DNA that encodes the protective polysaccharide coating of the S-strain bacteria did not break down from the heat shock and was introduced into the R-strain, allowing the latter to bypass the immune system of the mouse. While this process constantly occurs in the wild between organisms and even different species, scientists transform bacteria in laboratory settings for research purposes4.

<h4>Bacterial Transformation using Plasmids</h4>

Bacteria are the ideal organisms for transformation as they can easily take in exogenous genetic material into their genome and quickly amplify it3,5. They have one circular chromosome and multiple small circular pieces of double-stranded DNA called plasmids within the cytoplasm. These plasmids can replicate independently from the chromosomal DNA and generally provide certain functional benefits, such as resistance to antibiotics6,7. In their natural environment, bacteria undergo &#8220;bacterial transformation&#8221; by taking in plasmids from other bacteria in a process called conjugation8. Moreover, when they multiply, each of their progeny receives a copy of the new plasmid.

Plasmids that are used for experimental purposes are called plasmid vectors. In a laboratory setting, scientists can artificially create &#8220;recombinant plasmids&#8221; that are approximately 5,000-10,000 base pairs in length by inserting DNA fragments into a plasmid vector. These recombinant plasmids usually have certain components: an origin of replication (ORI), an antibiotic resistance gene, a multiple cloning site, a promoter, a selection marker, and the gene of interest. The origin of replication is where replication begins. The antibiotic resistance gene allows the bacteria that take in the plasmid to survive on plates in the presence of a certain antibiotic drug. Although plasmids are relatively small pieces of DNA, scientists need to treat the host cells to enable the plasmid penetration through the cell membrane. Hence, the efficiency of the transformation is directly related to porosity of the host membrane. One common approach is to heat-shock the bacteria that have been treated with a calcium chloride solution9. The bacteria that do not incorporate the plasmid will not transform, and therefore have no resistance to survive on the plate and be visible. The multiple cloning sites aid in DNA insertion by containing sites for restriction enzymes to cut the plasmid where the gene of interest can be inserted and ligated. The promoter drives transcription of the gene of interest. It is tagged by a marker, usually a fluorescent protein such as a green fluorescent protein (GFP), or can be an additional antibiotic resistance gene. The antibiotic resistance gene and the other selection markers help us determine whether the collected bacteria contain the plasmid of interest.

<h4>Applications</h4>

Effective transformation methods enabled scientists to isolate and profile genes and gene products and led to many advancements in life sciences and medicine, such as development of effective drugs, generation of genetically-modified crops, and advanced diagnostic tools10. In addition, with technological advancements, new methods of transformation have emerged. For instance, Gateway Cloning allows insertion of multiple DNA fragments into different vectors as well as transfer of DNA sequences between plasmids11. Furthermore, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 is a gene-editing technique that directly modifies nucleotides in the genome and does not require the use of plasmids12. After transformation, researchers often isolate and profile the gene of interest and its products. Subsequently, the whole process of genetic cloning has opened up a new field of genetic manipulation. Thanks to genetic cloning, researchers can manipulate bacteria to produce large amounts of specific human proteins, such as insulin to treat diabetes patients10. Cloning also has served a major importance in modern day agriculture. Genetically modified organisms (GMO) are a direct result of genetic cloning and bacterial transformation10. For instance, scientists are working to generate genetically modified crops with nitrogen-fixing genes incorporated into their genome to boost food production and reduce fertilizer use, thus, diminishing the economic and environmental impact of fertilizers13. In sum, bacterial transformation is the first step of modern-day biotechnology and the foundation of future research discoveries.

<h4>References</h4>

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</ol>

Bacterial Transformation using Plasmids - Concept

細菌の形質転換

Background

In early 20th century, pneumonia was accountable for a large portion of infectious disease deaths1. In order to develop an effective vaccine ...

抗生物質耐性の進化のマルチコピープラスミドのロールのテスト

要約

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クラス1インテグロンおよび遺伝子カセットのための食品のスクリーニング

細菌の活用頻度の高解像度の比較

実験的進化論におけるプラスミド媒介抗生物質耐性の定量化

大腸菌における天然接合プラスミドを介した遺伝子水平伝播の検出

発注済み、緑膿菌ひずみ PA14 トランスポゾン挿入変異体の非冗長ライブラリのレプリケーション

抗生物質耐性プラットフォームを用いた抗生物質脱複製

排出不全細菌株と単一コピー遺伝子発現システムを用いたアシネトバクター・バウマニの多剤排出システムの特性評価

排出不全細菌株と単一コピー遺伝子発現システムを用いたアシネトバクター・バウマニの多剤排出システムの特性評価

排出不全細菌株と単一コピー遺伝子発現システムを用いたアシネトバクター・バウマニの多剤排出システムの特性評価

細菌の形質転換

抗生物質耐性の進化のマルチコピー プラスミドのロールのテスト

要約

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クラス1インテグロンおよび遺伝子カセットのための食品のスクリーニング

細菌の活用頻度の高解像度の比較

実験的進化論におけるプラスミド媒介抗生物質耐性の定量化

大腸菌における天然接合プラスミドを介した遺伝子水平伝播の検出

発注済み、緑膿菌ひずみ PA14 トランスポゾン挿入変異体の非冗長ライブラリのレプリケーション

抗生物質耐性プラットフォームを用いた抗生物質脱複製

排出不全細菌株と単一コピー遺伝子発現システムを用いた アシネトバクター・バウマニの 多剤排出システムの特性評価

排出不全細菌株と単一コピー遺伝子発現システムを用いた アシネトバクター・バウマニの 多剤排出システムの特性評価

排出不全細菌株と単一コピー遺伝子発現システムを用いた アシネトバクター・バウマニの 多剤排出システムの特性評価

細菌の形質転換

抗生物質耐性の進化のマルチコピープラスミドのロールのテスト

排出不全細菌株と単一コピー遺伝子発現システムを用いたアシネトバクター・バウマニの多剤排出システムの特性評価

排出不全細菌株と単一コピー遺伝子発現システムを用いたアシネトバクター・バウマニの多剤排出システムの特性評価

排出不全細菌株と単一コピー遺伝子発現システムを用いたアシネトバクター・バウマニの多剤排出システムの特性評価