彼女の技術的なヘルプ Bettine ギブスを認識したいと思います。

このプロトコルのすべてのプロシージャの実行中は常に白衣、手袋と安全メガネを着用します。フェノール及びグアニジン イソチオ シアン酸試薬容器/チューブが認定フードで指定されたコンテナー内のフェノール廃棄物処分のみ開かれているを確認します。DNAse、RNAse フリーの生殖不能の管、ヒント、および試薬を使用します。
1. 細胞培養
<ol><li>HeLa 細胞ラインと 2 懸濁液マントル細胞リンパ腫細胞株、グランタ 519 と Jeko-1、10% を含む DMEM を成長 FBS と 37 ° C で 5% CO2と加湿のインキュベーターで 100 の U/mL ペニシリン/ストレプトマイシンセル 1:10 を希釈し、粒子カウンター14を使用してをカウントします。</li>
	<li>RNA の抽出、細胞/ウェル 6 ウェル プレート (ウェルあたり 2 mL メディア) の 500,000 をプレートします。24 時間培養した後、細胞から RNA を収集します。</li>
</ol>2. RNA の抽出
<ol><li>セルを収穫 注: 遠心分離のステップを除いて、無菌性を維持するティッシュ文化フードの記載されたすべての手順を実行します。<ol>
<li>浮遊細胞 (Jeko 1 およびグランタ 519): の場合<ol>
<li>15 mL チューブに (一緒に 2 mL の培地) セルを転送し、1,725 x g で 5 分間吸引メディアで遠心管の底で細胞ペレットを残します。</li>
			<li>リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) x 1 の 50 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。500 μ L の単相性フェノール及びグアニジン イソチオ シアン酸試薬を 1.5 mL 遠心チューブ内の各サンプルに追加します。よく混ぜ、5 分間室温 (RT) で遠心チューブを反転しながら 1 分毎のまま。</li>
		</ol>
</li>
		<li>付着性のセル (hela 細胞)。<ol>
<li>各ウェルからの細胞培養媒体を吸い出しなさい。破片を洗浄する各ウェルに 1 mL の PBS を追加します。</li>
			<li>PBS を削除し、相性フェノール及びグアニジン イソチオ シアン酸の試薬の 500 μ L を各ウェルに追加します。</li>
			<li>RT で穏やかな揺動で 5 分間インキュベートします。1.5 mL 遠心チューブに転送します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>セル換散<ol>
<li>フェノール及びグアニジン イソチオ シアン酸の細胞混合 1 時間-20 ° c の凍結します。 注:-20 ° c 夜間、または必要になるまでは、ミックスが残すことができます。</li>
		<li>フェノール及びグアニジン イソチオ シアン酸の細胞混合氷の上を解凍します。PCR フード遠心チューブに 100 μ L のクロロホルムを追加します。渦混合物まで 10-15 秒のサンプルは不透明なピンクです。15 分間 (4 ° C) で氷のサンプルをインキュベートします。</li>
		<li>20,800 x g と 4 ° C で 15 分間のサンプルを遠心分離します。上部の無色の水相を慎重に取り外します (〜 200 μ L) と新しい 1.5 mL 遠心チューブに移転。</li>
	</ol>
</li>
	<li>RNA の沈殿物<ol>
<li>各サンプルに等量のイソプロパノールを追加します。クロムの 1 μ L を追加 (材料表を参照) を各サンプルの RNA のためのキャリアとして機能して、以降の手順で RNA の視覚化に役立ちます。少なくとも 4 時間-80 ° C でサンプルをインキュベートします。-80 ° C で一晩インキュベート最高の結果を得るには、</li>
		<li>サンプルを冷却遠心機に転送します。20,800 x g で 35 分間遠心分離機/4 ° C;RNA は、管の底に青い斑点として表示されます。サンプルからイソプロパノールを慎重に取り外します。80% エタノール 500 μ L を追加し、簡潔に 3 のボルテックスでペレットを再懸濁します s。</li>
		<li>5 分間遠心する RT で 20,800 x g でサンプルは、すべてのエタノールをサンプルから削除します。みましょうサンプルは、約 10 分は、RNAse フリー水の 35 μ L のサンプルを再懸濁しますのために空気乾燥します。熱ブロック (65 ° C) RNA で完全にソリューションであることを確認する 5 分間に、すぐに氷のチューブを置きます。</li>
		<li>前述したように、代わりに 1 μ L151.5 μ L の RNA のサンプルを使用して除いて分光光度計を使用して総 RNA の濃度を決定します。必要に応じて、RNA の整合性を判断 1% の agarose のゲルの総 RNA の 1 μ g を実行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. DNase 処理
<ol><li>RNA の定量化後、ゲノム DNA を低下させる総 RNA の DNAse 処理を実行します。各サンプルは、RNAse フリーの DNAse キットを 20 μ L の全反応別の微量遠心チューブにミックスを作るから次の試薬を追加します。<ol>
<li>ミックス 2 μ L の 10 DNase 反応バッファー X 総 RNA の 4.4 μ g と。水 14 μ L の合計をもたらします。</li>
		<li>RNase フリーの DNAse の 2 μ L を追加します。37 ° c (逆転写キット) から RNase 阻害剤の 2 μ L の存在下で 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>DNAse 酵素を不活化する 70 の ° C で 10 分間の熱ブロックの停止ソリューションと熱の 2 μ L を追加します。 注: DNAse 処理はオプションです。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. cDNA 合成
50 μ l 反応ボリューム。
<ol><li>50 μ L 反応量: DNase の転送 22 μ L 新しいチューブ、または新しい管へ 22 μ L の総ボリュームに追加された水の総 RNA の転送 4 μ g に RNA を扱われます。10 μ M プライマー溶液から 2 μ L の T7 オリゴ dT25プライマーを追加します。T7 オリゴ dT25プライマー シーケンスは 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'。</li>
	<li>逆転写キットから RNase 阻害剤 (20 U/μ L) の 2 μ L、8 μ L の反応液の 5 倍、10 mM の dNTPs の 4 μ L と逆転写酵素 (200 U/μ L) の 2 μ L を追加します。 注: は、ネガティブ コントロールとして機能する逆転写酵素のない反応を設定します。</li>
	<li>1 h. 氷に直接転送の 42 ° C で孵化させなさい。5 分 75 ° C でチューブを加熱し、氷の上管を配置します。</li>
</ol>5. プライマー融合遺伝子転写産物の検索
<ol><li>
プライマー デザイン
	<ol>
<li>アンサンブルのゲノムのブラウザー (ENST00000360839.6/NM_017747) から cDNA シーケンスをダウンロードし、ターゲットのトラン スクリプト (ANKHD1) 上流停止コドンの ORF 内の領域を識別します。プライマー デザイン ソフトウェアのシーケンスのエントリ領域に終止コドンの上流シーケンスを含んでいる全体の地域 (最大 700 ヌクレオチド) のコピペ (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>)。</li>
		<li>ショー カスタム デザイン オプションを選択し、プライマーの数の 10 を選択 (返される結果) をシステムが生成するすべての他のパラメーターはデフォルトに設定しています。</li>
		<li>5 前方プライマーと重複しない 2 つの逆プライマーを選択します。プライマーを注文し、10 μ M の最終的な集中に RNAse/DNAse 自由水で再構成します。PCR のための一般的なプライマー デザインの詳細については、別途説明16。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
その後 3' レースで使用するための潜在的なプライマーを識別するために PCR 注: 反応で使用する最終的な前方プライマーを確認するには、PCR フード正規 PCR のため前方および逆のプライマーのさまざまな組み合わせを設定することによって設計されたプライマーをテストします。<ol>
<li>新鮮な 0.5 mL PCR チューブに cDNA (2 μ L) を転送します。前方のプライマーの 1 μ L と 1 μ L (10 mM プライマー液) から逆プライマーの追加します。ヌクレアーゼ フリー水の 8.5 μ L を追加することで最大 12.5 μ L を作る。12.5 μ L の PCR のゲル マスター ミックス × 2 を追加します。</li>
		<li>次 PCR 熱サイクリング条件を使用: 95 ° C、2 分に続いて 29 サイクル 95 ° C の 30 s、60 ° C、30 秒と 1 分の 72 ° C、7 分 68 ° C で最終的なサイクルを設定。</li>
		<li>PCR 後に、エチジウム ブロマイドで染色 1% アガロースゲルの製品を実行します。電気泳動の詳細、いくつかの変更17以前に解説しています。<ol>
<li>250 mL のフラスコでトリス酢酸 (TAE) バッファーの 100 mL の寒天 1 g を溶解します。電子レンジで沸騰させます。</li>
			<li>まま 1 分間冷却して発煙のフード エチジウム ブロマイド溶液 (10 mg/mL 在庫) 7.5 μ L を追加します。フラスコを旋回でよく混ぜるし、水平のゲル装置に注ぐ。常温固化するゲルを許可するように、少なくとも 30 分の発煙のフードを残します。</li>
			<li>1 x TAE バッファーでゲルをカバーし、一緒に 3-5 μ L の DNA 分子量の梯子の agarose のゲルに PCR の製品の 10 μ L をロードします。10 分、撮像素子を使用している製品を可視化するため 175 V で実行し、さらに製品の分離が必要な場合追加の 5-10 分のためのゲルを実行します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
入り込まれたプライマー 3' 競争のための選択
	<ol>
<li>明確な強力な単一 PCR バンドを持っているプライマーを選択する PCR agarose のゲルの結果を分析します。5'-ほとんどのプライマーを使用 (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC 3') 一緒に実行最初の PCR の T7 oligodT25プライマー。</li>
		<li>最初のプライマーの下流側にある入れ子になったプライマーを選択 (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3')、T7 プライマーとして使用 (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') PCR の反作用の 2 番目のセット。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 最適化 3' 3' UTR の 2 つの異なる酵素を使用してマップするレース
注: ある pcr 法に使用される DNA ポリメラーゼの多様性の増加をしています。したがって、我々 は 3' レース PCR の反作用のための異なる酵素を使用した場合でも適用することができます標準の条件を決定したいです。任意のトラン スクリプトの逆のプライマーは一定します。唯一の変更は、ターゲットのトラン スクリプトの特定される入れ子になった前方プライマーです。
<ol><li>
1:3 のプロトコル 'ピュロ コックス ・ フリオスス (Pfu)から変更された DNA ポリメラーゼを用いたレース
	<ol>
<li>最初の PCR<ol>
<li>PCR チューブに 1 μ L の cDNA を転送し、10 x Pfu反応バッファーの 5 μ L を追加します。(10 mM ソリューション) から最初の入れ子になった前方プライマーの 1 μ L、T7 oligodT25プライマーの 1 μ L および dNTPs の 1 μ L を追加します。</li>
			<li>水の 40 μ L を追加することによって最大 49 μ L の総ボリュームを作る。Pfu DNA ポリメラーゼの 1 μ L を加え、よく混ぜます。表 1に PCR のプロファイルを使用して PCR を実行します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>第 2 PCR<ol>
<li>新しい PCR チューブに最初の PCR の製品の 2 μ L を転送し、10 x Pfuウルトラ II 反応バッファーの 5 μ L でミックスします。第 2 ネストされた PCR プライマーの 1 μ L、T7 プライマーの 1 μ L および dNTPs (10 mM 液) 1 μ L を追加します。</li>
			<li>水の 39 μ L を追加することによって最大 49 μ L 全反応量を作る。Pfu DNA ポリメラーゼの 1 μ L を追加します。最初の PCR の設定 (表 1) として同じ PCR プロファイルを使用して PCR を実行します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2:3 のプロトコル 'パイロコッカス融合した DNA 結合ドメインから成るキメラ DNA ポリメラーゼを用いたレース-校正のポリメラーゼ PCR マスター ミックスのような
	<ol>
<li>最初の PCR<ol>
<li>PCR チューブに 1 μ L の cDNA を転送します。最初の入れ子になった前方プライマーの 1 μ L と T7 oligodT25プライマーの 1 μ L を追加します。水の 22 μ L を追加することで最大 25 μ L を作る。</li>
			<li>PCR マスター ミックス × 2 の 25 μ L を加え、よく混ぜます。表 2に記載されている PCR サイクリング条件を使用します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>第 2 PCR<ol>
<li>新しい PCR チューブに最初の PCR の製品の 2 μ L を転送します。T7 逆プライマーの 1 μ L と共に第 2 ネストされた PCR プライマーの 1 μ L を追加します。</li>
			<li>水の 22 μ L を追加することで最大 25 μ L を作る。25 μ L の PCR マスター ミックス × 2 を追加します。最初の PCR の設定 (表 2) として同じ PCR プロファイルを使用して PCR を実行します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 3「レースの 2 番目 PCR 製品を確認します。
<ol><li>2 番目の PCR の製品 (と同様のトラン スクリプトが豊富に記述された場合は pcr 法の最初のラウンドから製品) を 5-10 μ L と agarose のゲルの実行。ゲルを設定し、前述泳 (5.2.3.1 に 5.2.3.3 の手順) を実行します。イメージャーの結果を可視化します。</li>
</ol>8. 製品の精製とシーケンス
<ol><li>製造元のプロトコルに従ってゲルおよび PCR フラグメント DNA クリーンアップ システムを使用して 2 番目の PCR からゲルの PCR の製品を浄化します。</li>
	<li>サンガーを実行シーケンス (または、ゲル精製 PCR 製品サンプルと適切なシーケンス プライマー シーケンスの研究室に送信)。サンガーにシーケンス データを分析シーケンス。</li>
	<li>シーケンス分析ソフトウェアをダウンロード (材料の表を参照) し、トレース ファイルをソフトウェアにインポートします。呼び出し情報18を利用して個々 の純粋なベース QVs ベースを取得する (品質値)。高品質のトレース表示でクロマト グラムをダウンロードします。 省略可能: ゲル精製した製品は適切なクローン作成キットとサンガーの送信分離のクローンを使用してを複製することができますシーケンス。</li>
</ol>

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

遺伝子によ遺伝子単位での大規模な並列シーケンス技術の出現にもかかわらず 3' レースまだまま PAS とポリ a の尾に隣接したヌクレオチドを識別する最も簡単なと最も経済的な方法です。ここで説明した適応は 3' レースを使用して両方を増幅し、ORF、終止コドンと全体 3' UTR ANKHD1 mRNA のコピーの部分を含むシーケンスをマップするを展開します。3' 競争の主な利点は、いくつかのマイ?...

3' 末端の形成は、ポリ a テール1,2を作る ~ 250 untemplated アデニンの添加に続いて PAS のプレ mRNA の下流の胸の谷間を含む mRNA 成熟の重要なステップです。ポリ a 結合蛋白質 (PABP) ポリ a の尾に、これは、劣化から mRNA の転写を保護し、容易に翻訳1。
現在の推定では、ひと遺伝子の 70% を複数のパスを持ってしたがって代替起こる、結果は複数の 3' 端3を受けるとを示唆しています。したがって、任意の特定のコピーで使用される PAS を識別し同様、ポリ a の尾が 3' UTR の残りの部分に接続する位置を特定することが重要です。次世代シーケンシングの出現は UTRs とたくさんの遺伝子の 3' の同時同定になりました。シーケンス機能のこの増加は、3' 末端の代替起こるに関連するデータを分析するバイオインフォマティクス アルゴリズムの開発を求められています。De novo検出や PAS の検証、それゆえ大規模な配列データから個々 の遺伝子の 3' 末端のマッピング、3' レース選択4、5の方法のままです。通常 3' 競争の cDNA 製品に含まれるシーケンスには 3' UTR ポリ a の尾、胸の谷間サイト、PAS および PAS の上流のシーケンスが含まれている部分だけが含まれます。3' レースはデザインと遺伝子特定の前方および逆のプライマーの使用必要とする PCR とは異なり、2 つの遺伝子特定入れ子になった前方プライマーのみ必要があります。したがって、PCR 増幅4,6をされている遺伝子の大きな領域の塩基配列の詳細な知識が必要です。3' レースを使用するので同じ逆、ポリ a テールすべて polyadenylated RNA 転写産物のターゲット、前方プライマーのみする必要がある遺伝子を特定、したがって、だけ mRNA の非常に小さい領域の知識を必要とする入門書です。これにより、そのシーケンスがあります完全に特徴づけられる4,7の領域の増幅。これは、3' だけでなく遺伝子の 3' 終わりを決定するが、また判断して上流 3' UTR の重要な部分を形成する PAS の大きい地域を特徴づけるのための競争を許可しています。5' 変更された 3' 3' UTR のより大きい部分と並ぶ地域を含むレースとレースを組み合わせて、完全にシーケンスまたは 3' 端8に 5' 端から全体 mRNA のコピーのクローンを作成することが可能です。
この変更された 3' 競争の適用の例は、小説CCND1 MRCK融合遺伝子転写マントル細胞リンパ腫細胞株およびがん患者からの最近の id です。3' UTR CCND1とMRCKの両方の遺伝子配列から成り、miRNA 規制9に反抗しました。2 つ入れ子になったCCND1特定前方プライマーがすぐに隣接してCCND1の終止コドンの下流領域に補足。財源やバイオ情報を作る専門知識に多くの研究所がない場合があります特定 bioinformatic ツールと共に全体のトランスクリプトーム シーケンスを使用して、3' UTR10内遺伝子融合を検出できますが、この技術を使って。したがって、3' レースは 3' UTR を含む新規融合遺伝子のde novoの識別と確認のための代替。考えると、抜本的な報告された融合遺伝子の数の増加し同様に議事録を読んで、3' レース ツールとなっている強力な遺伝子シーケンス11,12を特徴付けること。また、最近の研究は、3' UTR の長さと同様、そのさまざまなシーケンス内で 3' UTR mRNA 転写安定性、ローカリゼーション、訳し、および関数13に影響することができますを示しています。関心の高まりの一部によるトランスクリプトームをマッピングの研究室で使用するため開発されている種類の DNA ポリメラーゼの数が増加しています。どのような種類の変更させることができます 3' DNA ポリメラーゼの使用可能なレパートリーを活用するための競争のプロトコルを決定することが重要です。
この作業を適応 3' マップ全体 3' UTR にレース レポート、PAS とを使用してANKHD1の転写産物の 3' 終わり胸の谷間サイト ネスト トラン スクリプトの 2 つの種類の DNA ポリメラーゼANKHD1セクション内のプライマー。

<table><tbody><tr><td>HeLa cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>Cervical cancer cell line.</td></tr><tr><td>Jeko-1 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>Mantle cell lymphoma cell line.</td></tr><tr><td>Granta-519 cells</td><td>DSMZ</td><td>ACC-342</td><td>Mantle cell lymphoma cell line.</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Fetal bovine serum for cell culture.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15140122</td><td>Antibiotic and antimycotic.</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9545</td><td>Coprecipitant.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>10569044</td><td>Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.</td></tr><tr><td>Nuclease Free-Water</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>AM9938</td><td>Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate-Buffered Solution</td><td>Corning</td><td>21-030</td><td>1X PBS.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma&amp;nbsp; Aldrich</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Reagent Alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>793175</td><td>Ethanol</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>15596026</td><td>Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.</td></tr><tr><td>2X Extender PCR-to-Gel Master Mix</td><td>Amresco</td><td>N867</td><td>2X PCR-to-Gel Master Mix&amp;nbsp; containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.</td></tr><tr><td>10mM dNTP</td><td>Amresco</td><td>N557</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Dnase treatment kit.</td></tr><tr><td>Gel Loading Dye Orange (6X)</td><td>New England BioLabs</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>F531S</td><td>2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600670</td><td>Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).</td></tr><tr><td>RevertAid RT Reverse Transcription Kit</td><td>Thermo Fischer</td><td>K1691</td><td>Used for&amp;nbsp; reverse transcription of mRNA into&amp;nbsp; cDNA synthesis. Kit includes&amp;nbsp; Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.</td></tr><tr><td>Pefect size 1Kb ladder</td><td>5 Prime</td><td>2500360</td><td>Molecular weight DNA ladder.</td></tr><tr><td>Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III</td><td>Alpha Innotech</td><td></td><td>Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.</td></tr><tr><td>Low Molecular Weight Ladder</td><td>New England BioLabs</td><td>N3233L</td><td>Molecular weight DNA ladder.</td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>MidSci</td><td>VM-3200</td><td></td></tr><tr><td>Mini Centrifuge</td><td>MidSci</td><td>C1008-R</td><td></td></tr><tr><td>Dry Bath</td><td>MidSci</td><td>DB-D1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000C</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>ND-2000C</td><td>Spectrophotometer.</td></tr><tr><td>Wide Mini-Sub&amp;nbsp;Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td><td>BioRad</td><td>1704469</td><td>Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel</td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>Power supply for gel electrophoresis.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Dot Scientific</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Gradient</td><td>Eppendorf</td><td>950000015</td><td>PCR thermocycler.</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot&amp;nbsp; TOP10 Chemically Competent E. coli cells</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>K280020</td><td></td></tr><tr><td>MyPCR Preparation Station Mystaire</td><td>MidSci</td><td>MY-PCR24</td><td>Hood dedicated to PCR work.</td></tr><tr><td>Hamilton SafeAire II fume hood</td><td>ThermoFisherScientific</td><td></td><td>Fume hood.</td></tr><tr><td>Beckman Coulter Z1&amp;nbsp;Particle&amp;nbsp;Counter</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td>Particle counter. For counting cells before plating&amp;nbsp; for RNA extraction.</td></tr><tr><td>Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0</td><td>Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)</td><td></td><td>Software to analyze Sanger sequencing data.</td></tr></tbody></table>

adapting 3' rapid amplification of cdna ends to map transcripts in cancer

真核生物 Mrna の成熟には、ポリ a 尾部の付加を含む 3' 端形成が含まれます。遺伝子の 3' 末端をマップするために選択する従来の方法は (3' レース) の cDNA の端の急速な拡大は 3' です。3' 競争のプロトコルには、入念な設計と興味のターゲット遺伝子の 3' 非翻訳領域 (3' UTR) 内でネストされたプライマーの選択が必要です。ただし、いくつかの変更で全体 3' UTR と ORF と 3' UTR の関係のより包括的な画像を提供するオープンリーディング フレーム (ORF) 内のシーケンスを含めるプロトコルを使用できます。これは従来 3' 競争によって提供される、胸の谷間と起こるサイトだけでなく、起こる信号 (PAS) の識別に加えてです。拡張された 3' レース珍しい 3' 3' UTR、内融合遺伝子を含む UTRs を検出できるし、AU 豊富なトラン スクリプトの安定性に影響を与える要素の不安定化と同様、潜在的なマイクロ Rna 結合部位を予測するシーケンス情報を使用できます。

入れ子になった前方プライマー検索:
Agarose のゲルから使用する同じ転送別逆プライマーはプライマー 2 個別 PCR のゲル製品 (レーン 1 と 2) を図 1に示します。レーン 3 個別 PCR の製品、異なる前方および逆プライマーを有しています。理想的なプライマーによる PCR 反応に使用する、1 種類?...

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Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

適応 3' CDNA の急速な拡大は、がんの成績証明書をマップする終了します。

(3' レース) の cDNA の端の 2 つ異なる 3' 急速な拡大はプロトコル説明ここで作るのオープンリーディング フレーム (ORF)、停止コドンと全体 3' UTR の RNA を使ってセグメントを含むシーケンスにマップする 2 つの異なる DNA ポリメラーゼの使用異なるがん細胞から得られます。

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

adapting-3-rapid-amplification-cdna-ends-to-map-transcripts

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

12.2K ビュー.  Butler University. (3' レース) の cDNA の端の 2 つ異なる 3' 急速な拡大はプロトコル説明ここで作るのオープンリーディング フレーム (ORF)、停止コドンと全体 3' UTR の RNA を使ってセグメントを含むシーケンスにマップする 2 つの異なる DNA ポリメラーゼの使用異なるがん細胞から得られます。

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Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. However, the application of this method is challenging due to its low sensitivity in analyzing the trace amount of ctDNA in the blood. Furthermore, the method may generate false positive and negative results from this sequencing and subsequent analysis. To improve the feasibility and reliability of ctDNA detection in the clinic, here we present a technique which enriches rare mutations for sequencing, Enrich Rare Mutation Sequencing (ER-Seq). ER-Seq can distinguish a single mutation out of 1 x 107 wild-type nucleotides, which makes it a promising tool to detect extremely low frequency genetic alterations and thus will be very useful in studying disease heterogenicity. By virtue of the unique sequencing adapter&#39;s ligation, this method enables an efficient recovery of ctDNA molecules, while at the same time correcting for errors bidirectionally (sense and antisense). Our selection of 1021 kb probes enriches the measurement of target regions that cover over 95% of the tumor-related driver mutations in 12 tumors. This cost-effective and universal method enables a uniquely successful accumulation of genetic data. After efficiently filtering out background error, ER-seq can precisely detect rare mutations. Using a case study, we present a detailed protocol demonstrating probe design, library construction, and target DNA capture methodologies, while also including the data analysis workflow. The process to carry out this method typically takes 1-2 days.

This manuscript describes a technique for detecting mutations of low frequency in ctDNA, ER-Seq. This method is differentiated by its unique use of two-directional error correction, a special background filter, and efficient molecular acquirement.

次世代シーケンシングによる葉緑体の稀な遺伝子変異の検出

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

がん研究

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal gastric mucosa. Recently, we detected CDH1a transcript variant in fresh-frozen tumor tissues obtained from patients with GC. The expression of this variant in tissue samples was investigated by the chip-based digital PCR (dPCR) approach presented here. dPCR offers the potential for an accurate, robust, and highly sensitive measurement of nucleic acids and is increasingly utilized for many applications in different fields. dPCR is capable of detecting rare targets; in addition, dPCR offers the possibility for absolute and precise quantification of nucleic acids without the need for calibrators and standard curves. In fact, the reaction partitioning enriches the target from the background, which improves amplification efficiency and tolerance to inhibitors. Such characteristics make dPCR an optimal tool for the detection of the CDH1a rare transcript.

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

The manuscript describes a chip-based digital PCR assay to detect a rare CDH1 transcript variant (CDH1a) in fresh-frozen normal and tumor tissues obtained from patients with gastric cancer.

チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトラン スクリプト変種の検出

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Transcriptome Analysis of Single Cells

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in culture.1,2,3 In the case of the brain, regions such as the hippocampus contain a complex arrangement of different cell types, each with distinct mRNA profiles. The ability to harvest single cells allows for a more in depth investigation into the molecular differences between and within cell populations. We describe a simple and rapid method for harvesting cells for further processing. Pipettes often used in electrophysiology are utilized to isolate (using aspiration) a cell of interest and conveniently deposit it into an Eppendorf tube for further processing with any number of molecular biology techniques. Our protocol can be modified for the harvest of dendrites from cell culture or even individual cells from acute slices.
We also describe the aRNA amplification method as a major downstream application of single cell isolations. This method was developed previously by our lab as an alternative to other gene expression analysis techniques such as reverse-transcription or real-time polymerase chain reaction (PCR).4,5,6,7,8 This technique provides for linear amplification of the polyadenylated RNA beginning with only femtograms of material and resulting in microgram amounts of antisense RNA. The linearly amplified material provides a more accurate estimation than PCR exponential amplification of the relative abundance of components of the transcriptome of the isolated cell. The basic procedure consists of two rounds of amplification. Briefly, a T7 RNA polymerase promoter site is incorporated into double stranded cDNA created from the mRNA transcripts. An overnight in vitro transcription (IVT) reaction is then performed in which T7 RNA polymerase produces many antisense transcripts from the double stranded cDNA. The second round repeats this process but with some technical differences since the starting material is antisense RNA. It is standard to repeat the second round, resulting in three rounds of amplification. Often, the third round in vitro transcription reaction is performed using biotinylated nucleoside triphosphates so that the antisense RNA produced can be hybridized and detected on a microarray.7,8

In this article we describe a simple method for the harvesting of single cells from rat primary neuronal cultures and subsequent transcriptome analysis using aRNA amplification. This approach is generalizable to any cell type.

単一細胞のトランスクリプトーム解析

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in ...

神経科学

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these proteins contain an intrinsically disordered domain (IDD) fused with the DNA-binding domain (DBD) of another protein and orchestrate widespread transcriptional changes to promote malignancy. These fusions are often the sole recurring genomic aberration in the cancers they cause, making them attractive therapeutic targets. However, targeting oncogenic transcription factors requires a better understanding of the mechanistic role that low-complexity, IDDs play in their function. The N-terminal domain of EWSR1 is an IDD involved in a variety of oncogenic fusion transcription factors, including EWS/FLI, EWS/ATF, and EWS/WT1. Here, we use RNA-sequencing to investigate the structural features of the EWS domain important for transcriptional function of EWS/FLI in Ewing sarcoma. First shRNA-mediated depletion of the endogenous fusion from Ewing sarcoma cells paired with ectopic expression of a variety of EWS-mutant constructs is performed. Then RNA-sequencing is used to analyze the transcriptomes of cells expressing these constructs to characterize the functional deficits associated with mutations in the EWS domain. By integrating the transcriptomic analyses with previously published information about EWS/FLI DNA binding motifs, and genomic localization, as well as functional assays for transforming ability, we were able to identify structural features of EWS/FLI important for oncogenesis and define a novel set of EWS/FLI target genes critical for Ewing sarcoma. This paper demonstrates the use of RNA-sequencing as a method to map the structure-function relationship of the intrinsically disordered domain of oncogenic transcription factors.

Intrinsically disordered domains are important for oncogenic fusion transcription factor function. To therapeutically target these proteins, a more detailed understanding of the regulatory mechanisms employed by these domains is required. Here, we use transcriptomics to map important structural features of the intrinsically disordered EWS domain in Ewing sarcoma.

トランスクリプトーム解析を用いた無秩序発がん性転写因子の構造機能関係のマッピング

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

ATAC-Seq Optimization for Cancer Epigenetics Research

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the hyperactive Tn5 transposase. Tn5 cuts and ligates adapters for high-throughput sequencing within accessible chromatin regions. In eukaryotic cells, genomic DNA is packaged into chromatin, a complex of DNA, histones, and other proteins, which acts as a physical barrier to the transcriptional machinery. In response to extrinsic signals, transcription factors recruit chromatin remodeling complexes to enable access to the transcriptional machinery for gene activation. Therefore, identifying open chromatin regions is useful when monitoring enhancer and gene promoter activities during biological events such as cancer progression. Since this protocol is easy to use and has a low cell input requirement, ATAC-seq has been widely adopted to define open chromatin regions in various cell types, including cancer cells. For successful data acquisition, several parameters need to be considered when preparing ATAC-seq libraries. Among them, the choice of cell lysis buffer, the titration of the Tn5 enzyme, and the starting volume of cells are crucial for ATAC-seq library preparation in cancer cells. Optimization is essential for generating high-quality data. Here, we provide a detailed description of the ATAC-seq optimization methods for epithelial cell types.

ATAC-seq is a DNA sequencing method that uses the hyperactive mutant transposase, Tn5, to map changes in chromatin accessibility mediated by transcription factors. ATAC-seq enables the discovery of the molecular mechanisms underlying phenotypic alterations in cancer cells. This protocol outlines optimization procedures for ATAC-seq in epithelial cell types, including cancer cells.

がんエピジェネティクス研究のためのATAC-Seq最適化

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

ヒトmRNA前駆体上にマッピングリボ核の迅速なハイスループット法（RNPS）

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

生物学

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using bioinformatics pipelines (&#34;dry bench&#34;). Both elements are essential to produce accurate and reliable results, which are particularly critical for clinical laboratories. Targeted NGS technologies have increasingly found favor in oncology applications to help advance precision medicine objectives, yet the methods often involve disconnected and variable wet and dry bench workflows and uncoordinated reagent sets. In this report, we describe a method for sequencing challenging cancer specimens with a 21-gene panel as an example of a comprehensive targeted NGS system. The system integrates functional DNA quantification and qualification, single-tube multiplexed PCR enrichment, and library purification and normalization using analytically-verified, single-source reagents with a standalone bioinformatics suite. As a result, accurate variant calls from low-quality and low-quantity formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) and fine-needle aspiration (FNA) tumor biopsies can be achieved. The method can routinely assess cancer-associated variants from an input of 400 amplifiable DNA copies, and is modular in design to accommodate new gene content. Two different types of analytically-defined controls provide quality assurance and help safeguard call accuracy with clinically-relevant samples. A flexible &#34;tag&#34; PCR step embeds platform-specific adaptors and index codes to allow sample barcoding and compatibility with common benchtop NGS instruments. Importantly, the protocol is streamlined and can produce 24 sequence-ready libraries in a single day. Finally, the approach links wet and dry bench processes by incorporating pre-analytical sample quality control results directly into the variant calling algorithms to improve mutation detection accuracy and differentiate false-negative and indeterminate calls. This targeted NGS method uses advances in both wetware and software to achieve high-depth, multiplexed sequencing and sensitive analysis of heterogeneous cancer samples for diagnostic applications.

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

ウェットとドライベンチ・プロセスの統合は、低品質と低量腫瘍生検の標的次世代シーケンシングを最適化

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

医学

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

遺伝子発現およびゲノム変化を特徴づけるために、RNAシーケンシングアッセイをターゲットに

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; untranslated regions (UTRs) are generated in differentiated cells whereas proliferating cells preferentially express transcripts with short 3&#39;UTRs. We describe the A-seq protocol, now at its second version, which was developed to map polyadenylation sites genome-wide and study the regulation of pre-mRNA 3&#39; end processing. Also this current protocol takes advantage of the polyadenylate (poly(A)) tails that are added during the biogenesis of most mammalian mRNAs to enrich for fully processed mRNAs. A DNA adaptor with deoxyuracil at its fourth position allows the precise processing of mRNA 3&#39; end fragments for sequencing. Not including the cell culture and the overnight ligations, the protocol requires about 8 h hands-on time. Along with it, an easy-to-use software package for the analysis of the derived sequencing data is provided. A-seq2 and the associated analysis software provide an efficient and reliable solution to the mapping of pre-mRNA 3&#39; ends in a wide range of conditions, from 106 or fewer cells.

This protocol describes a method for mapping pre-mRNA 3&#39; end processing sites.

3' 末端配列 A seq2 とライブラリの準備

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Rapid Amplification of cDNA Ends

Source: Pablo Sanchez Bosch2, Sean Corcoran2 and Katja Br&#252;ckner1,2,3 
1Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research 
2Department of Cell and Tissue Biology,&#160; 
3Cardiovascular Research Institute, University of California San Francisco, San Francisco, CA, USA&#160; &#160;&#160;
Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) is a technique that allows amplification of full-length cDNA from mRNA by extending to the 3&#8217; or 5&#8217; end, even without prior knowledge of the sequence (Frohman et al., 1988). In contrast to regular PCR, it uses only one specific PCR primer and a second non-specific primer that will indiscriminately bind to most mRNAs. Depending on whether the area to be amplified is on the 3&#8217; or 5&#8217; end of the mRNA, the second primer is chosen to bind the polyA tail (3&#8217; end) or a synthetic linker added to all transcripts (5&#8217; end). These primer combinations are known to yield &#8220;one-sided&#8221; or &#8220;anchored&#8221; PCR due to PCR amplification using the known sequence of one side- 3&#8217; or 5&#8217;(Ohara et al., 1989). The approach allows the capture of gene-specific rare mRNAs that otherwise would be hard to detect, e.g. because of their relatively low expression or unknown complete sequence (Frohman et al., 1988).
RACE is initiated with a reverse transcription step (RT) to synthetize single stranded complimentary DNA (cDNA) from mRNA. This is followed by two consecutive PCRs that amplify the cDNA fragments from a gene of interest. To perform RACE, the sequence of the gene of interest must be at least partially known, as it is needed to design the gene-specific primers (GSPs; Frohman, 1994; Liu and Gorovsky, 1993). As the second primer pair is a generic primer that will anneal to all transcripts present in the sample, the specificity of the PCR reactions is reduced. RACE is therefore ideally performed with two nested PCRs to lower the chances of amplifying non-specific transcripts (Figure 1). Depending on the direction of amplification relative to the GSP, the technique is categorized as 5&#8217; or 3&#8217; RACE (Figure 1).&#160;
3&#8217; RACE (Figure 1A) takes advantage of the poly(A) tail present in mRNAs as a generic binding site for the non-specific primer. This simplifies the technique, as one can synthetize cDNA by using oligo (dT) primers. GSPs are located in the 5&#8217; region of the transcripts. This RACE variant allows the detection of transcript variants and different 3&#8217; UTRs (Scotto Lavino et al., 2007a). In 5&#8217; RACE (Figure 1B), GSPs are located in the 3&#8217; region of the gene. To be able to use a non-specific primer that binds to all transcripts, an adapter that serves as generic primer binding site is attached to the 5&#8217; RNA ends. To attach the adapter to the mRNA, the 5&#8217; cap that protects mRNAs against exonucleases and promotes translation must be removed (Bird et al., 2016). Opposed to 3&#8217; RACE, 5&#8217; RACE helps finding differential 5&#8217; splice variants and alternative 5&#8217; UTRs (Scotto Lavino et al., 2007b).
Here we will perform 3&#8217; RACE to identify and isolate different transcript variants using the known 5&#8217; sequence (Figure 2A) encoded by the Drosophila dSmad2 (Smox) gene. dSmad2, a fly Smad protein, is an important transducer of Activin-&#946; signaling, a pathway of the TGF-&#946; superfamily. dSmad2 regulates multiple cellular processes, such as cell proliferation, apoptosis and differentiation (Upadhyay et al., 2017). As differentially spliced transcripts of dSmad2 may have different functions in the adult fly, a first step in exploring these potential functions is to assess all transcript variants of dSmad2 at this developmental stage.

Source: Pablo Sanchez Bosch2, Sean Corcoran2 and Katja Br&#252;ckner1,2,3
1Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research
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適応 3' CDNA の急速な拡大は、がんの成績証明書をマップする終了します。

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単一細胞のトランスクリプトーム解析

トランスクリプトーム解析を用いた無秩序発がん性転写因子の構造機能関係のマッピング

がんエピジェネティクス研究のためのATAC-Seq最適化

ヒトmRNA前駆体上にマッピングリボ核の迅速なハイスループット法（RNPS）

ウェットとドライベンチ・プロセスの統合は、低品質と低量腫瘍生検の標的次世代シーケンシングを最適化

遺伝子発現およびゲノム変化を特徴づけるために、RNAシーケンシングアッセイをターゲットに

3' 末端配列 A seq2 とライブラリの準備

Rapid Amplification of cDNA Ends

適応 3' CDNA の急速な拡大は、がんの成績証明書をマップする終了します。

要約

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次世代シーケンシングによる葉緑体の稀な遺伝子変異の検出

チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトラン スクリプト変種の検出

単一細胞のトランスクリプトーム解析

トランスクリプトーム解析を用いた無秩序発がん性転写因子の構造機能関係のマッピング

がんエピジェネティクス研究のためのATAC-Seq最適化

ヒトmRNA前駆体上にマッピングリボ核の迅速なハイスループット法（RNPS）

ウェットとドライベンチ・プロセスの統合は、低品質と低量腫瘍生検の標的次世代シーケンシングを最適化

遺伝子発現およびゲノム変化を特徴づけるために、RNAシーケンシングアッセイをターゲットに

3' 末端配列 A seq2 とライブラリの準備

Rapid Amplification of cDNA Ends

チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトランスクリプト変種の検出