Name: three-dimensional rendering and analysis of immunolabeled, clarified human placental villous vascular networks
Uploaded: 2018-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
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この作品は、発達障がい者や胎盤の Analytics の LLC は、新しいロッシェル、ニューヨークのニューヨーク州のオフィスによって支えられました。

このプロトコルは、発達障害人間研究倫理委員会の基本的な研究のためニューヨーク州研究所のガイドラインを続きます。
1. 絨毛木郭清
<ol><li>バフ リン酸生理食塩水 (PBS)14ホルマリンを除去し、解剖顕微鏡のステージにシャーレに置きに胎盤組織を固定ホルマリンをすすいでください。メスと微細鉗子を使用して胎盤組織を離れて、絨毛木 (白い糸のような分岐構造) を探します。絨毛ツリー (数 mm 長い) の部分を解剖し、組織をマイクロ チューブ含む 〜 1 mL PBS に転送します。</li>
</ol>2. 免疫蛍光染色
<ol><li>、ピペットと PBS を削除し、新鮮な PBS で置き換えます。時折旋回 10 分立ってみましょう。もう一度繰り返します。 注: この手順および以降のすべての手順は、一次抗体の孵化を除く室温で行われます。</li>
	<li>ピペットを使用して、削除し、PBS を置き換えます PBS 0.1% トリトン X100 + 2% ヤギ血清 (PBS-T-GS) 二次抗体の組織とブロック非特異的結合を permeabilize。30 分間インキュベートします。</li>
	<li>両方のマウス モノクローナル抗 CK7 とウサギ抗 CK7、2% ヤギ血清を含む PBS PBS T GS 交換します。<ol>
<li>4 ° C で一晩組織を孵化させなさい</li>
		<li>残りの抗体を削除するには、時折旋回 10 分 PBS GS で洗浄します。</li>
		<li>PBS GS を削除し、両方のヤギ抗マウス IgG 結合緑色発光を含む PBS GS に置き換える (520 nm) fluorophore ヤギ抗うさぎ IgG 結合赤外線発光 (652 nm) 蛍光。</li>
		<li>2.1 のステップを繰り返すことによって抗体を削除します。</li>
		<li>暗闇の中で常温カルビンディン抗体組織を保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 組織の明確化
<ol><li>10 分間隔で 3 回 PBS でサンプルを洗います。</li>
	<li>ピペットと PBS を除去し、50% エタノールに置き換えることによって組織を脱水 (メタノールとしても使用することがあります)。インキュベート新鮮な 50% エタノールに置き換えて 10 分、10 分が 3 孵化の合計はこれをもう一度繰り返すを孵化させなさい。70% の孵化を繰り返します。その後、100% エタノールに置き換えて、15 分間インキュベート (またはメタノールが使用されるかもしれない)。</li>
	<li>細いの鉗子で組織を転送、新鮮なマイクロ チューブを含む 〜 1 mL ソリューション 1 4 時間。</li>
	<li>新鮮なマイクロ チューブ含むソリューション - 2 の組織を転送先の細いピンセットで 〜 4 h。 注: 暗闇の中で保存されると、螢光抗体は、室温で安定して少なくとも 6 ヶ月間です。</li>
	<li>クリアが失われると、任意の水溶液、(例えばマウント中) を混在させないでください。</li>
</ol>4. 顕微鏡用取付
<ol><li>組織が柔らかく、変形しやすい標準的なガラスのスライドと観察間の組織をマウントしないでください。</li>
	<li>図 5Bを参照し、サイクス-ムーアの商工会議所で組織を次のようにマウント<ol>
<li>先の細いピンセットで、基本室内の 25 mm ラウンド coverslip を配置しています。</li>
		<li>先の細いピンセットで、coverslip のベースにゴム製のガスケットを配置します。</li>
		<li>ピペットと、カバーガラスのセンターのソリューション 2 のドロップ (~ 40 μ L) を配置します。</li>
		<li>先の細いピンセットで、coverslip の中央にドロップするソリューション 2 からワンピース ティッシュを転送します。</li>
		<li>ガスケットの上に 2 番目の coverslip の場所。</li>
		<li>会社まで coverslips とガスケットを圧縮ベースの上部にロッキング リングを通します。 注: を締めすぎないように注意してくださいまたは、coverslip が粉々 になります。</li>
		<li>ベースとガスケットを介してポートに 22 g 針を挿入します。</li>
		<li>3 mL 注射器を埋める 〜 ソリューション 2 の 1.5 mL。</li>
		<li>25 ゲージの針を注射器にマウントします。</li>
		<li>ガスケット、反対側のポートに注射針を挿入します。</li>
		<li>その他の 25 ゲージの針を通して室内の空気を抜き、確保するため、ソリューション 2 and 塗りつぶし商工会議所を優しく挿入します。</li>
		<li>針と注射器を取り外し、共焦点顕微鏡段階の大きなガラスのスライドの商工会議所。</li>
	</ol>
</li>
	<li>また、PDMS シリコーン シートからカスタムの井戸をカットします。<ol>
<li>はさみは、PDMS シートからの 25.4 × 25.4 mm2枚にカットします。</li>
		<li>メスでカット 〜 12.7 × 12.7 mm2ピースで。</li>
		<li>顕微鏡スライドの上にしっかりと作品を押します。</li>
		<li>ソリューション 2 でトップに井戸を埋めます。</li>
		<li>井戸の中心にマイクロ チューブから組織の一部を転送します。</li>
		<li>先の細いピンセットで、カバーガラスの下部がソリューション 2 接液部井戸の上に観察を配置します。</li>
		<li>共焦点顕微鏡段階の組織でサイクス ムーア商工会議所アセンブリをマウントします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 共焦点顕微鏡
<ol><li>10 × 対物フォーカスに商工会議所の組織をもたらします。</li>
	<li>組織の上下間の距離を測定する焦点面を顕微鏡ステージを上下に移動します。</li>
	<li>上から下への組織を介して画像のセットを含む共焦点画像ファイルを収集するために 2.5 μ m のステップでステージを移動します。</li>
</ol>6. 逆転クリア
<ol><li>100% エタノール量 x マイクロ チューブ含む > 20 組織を転送することによって逆にクリア。1 h の間隔は、70% エタノール、50% エタノールそして PBS で置き換えます。暗闇の中で 4 ° C で保存します。 注: 処理区分および組織学的標準的なパラフィンを埋め込む、組織や免疫組織化学的染色します。</li>
</ol>7. デコンボリューション
注: 次の手順では、ソフトウェア コマンド、タブ、ドロップ ダウン メニューの斜体で示します。
<ol><li>デコンボリューション ソフトウェアを起動してイメージ ファイルを開きます。</li>
	<li>'Summary' ウィンドウに表示されているパラメーターを入力します。<ol>
<li>'間隔は、ボクセルを入力 x、y、および z 次元 μ m。</li>
		<li>各カラー チャンネルのドロップ ダウン メニューから免疫染色用蛍光染料を選択します。</li>
		<li>'モダリティ'、レーザー走査型共焦点をドロップ ダウン メニューから選択します。</li>
		<li>「対物レンズのドロップ ダウン メニューから 10 倍を選択。</li>
		<li>'浸漬媒体'、空気をドロップ ダウン メニューから選択します。</li>
		<li>クリックして、'適用 'ボタン。</li>
	</ol>
</li>
	<li>'Deconvolution' タブをクリックします。</li>
	<li>クリックして '3 D デコンボリューション'ドロップ ダウン メニュー。</li>
	<li>'- 3 D デコンボリューション'ウィンドウでは、設定が保証するため: 1) 適応 PSF ブラインド、2) 理論的 PSF、3) 使用 (既定適応 PSF、10 のイテレーション、媒体ノイズ)、4) ベース名。</li>
	<li>クリックして、'緑色のチェック ボタン 'プログラムを起動します。</li>
	<li>終了すると、7.3-7.6 プログラムを再起動する手順を繰り返します。終了したら 3 番目と最後の時間を再起動します。</li>
	<li>'データ マネージャー'ウィンドウで、付けファイルをクリック"10-10 - 10-」。</li>
	<li>クリックして、'ファイル ' ] タブをクリックしをクリックして'Save As'。</li>
	<li>'S のA を保存'ウィンドウを選択 '8 ビット符号なし整数'から、'データ型 'ドロップ ダウン メニューとクリック セーブを。</li>
</ol>8. 画像処理
<ol><li>フィジーのソフトウェアを起動します。<ol>
<li>クリックして 'ファイル'をクリックして 'オープン' Deconvolved イメージ ファイルを選択し、クリックして、、'オープン 'ボタンを'オープン 'ウィンドウ。</li>
		<li>クリックして 'イメージ/色/分割チャネルおよび変換 3 色の画像ファイルの 1 つだけの色を含む 3 つの新しいファイルに。カルビンディン抗体には絨毛の毛管イメージ セットを含む赤いイメージ ファイルを保存します。緑および青のイメージ ファイルを削除します。</li>
		<li>赤いイメージ ファイルからのバック グラウンド蛍光を減算: 'バック グラウンド プロセス/削除'。</li>
		<li>ドロップ ダウン メニューでローリング ボール半径を 10 ピクセルに設定します。</li>
		<li>4 メニュー オプションをオフのまま、クリックして '[ok]'。</li>
		<li>クリックして ' プロセス スタック メニューの「イエス」 。</li>
		<li>開くことによって本来の組織蛍光 (蛍光) を削除、'画像/調整/明るさ-コントラスト 'メニューの最小値、最大値、明るさおよびコントラストの設定を調整します。キャピラリーの蛍光抗体のいずれかを削除しないように注意します。</li>
		<li>開くことによって無関係な蛍光を残りを最小限に抑える、'画像/調整/しきい値 'メニューとキャピラリーの蛍光を強調表示するようにスライダーを調整します。チェックの '暗い背景'ボックスし、をクリックして '適用'。'バイナリ ドロップダウンに変換'メニュー チェック、'黒の背景 'ボックスし、をクリックして'[ok] '。分析の下の黒と白 (バイナリ) イメージ ファイルを保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. 分析
<ol><li>オブジェクトのカウントと細線化。<ol>
<li>8.1.8 のステップで作成したバイナリ イメージ ファイルを選択します。</li>
		<li>クリックして '分析/3 D OC オプションとチェックのみ'ボリューム 'と'ストア結果...'ボックスをドロップ ダウン メニューで。「表示番号」ボックスにチェック マークが付いていないことを確認してください。クリックして、'[ok] ' ボタン。
</li>
		<li>Click '分析/3 D オブジェクト カウンター'。ドロップ ダウン メニューで設定 'サイズ フィルター: 分' 5000。保証する、'エッジ上のオブジェクトを除外する] ボックスがチェックされていません。確認、'オブジェクトs、統計の'概要'ボックスがチェックされます。クリックして、'[ok] ' ボタン。 注: これは、ファイルのサイズとコンピューターの構成によっては数分をかかることがあります。</li>
		<li>統計情報の表、オブジェクト ・ マップ ・ ファイルを保存します。</li>
		<li>オブジェクト ・ マップ ・ ファイルを選択します。クリックして 'プラグイン/スケルトン/Skeletonize 2 D ・ 3 D'バイナリ ファイルに毛細血管を収縮します。クリックして 'ファイル/保存として。選択 '... Tiff'ドロップ ダウン メニュー。[名前を付けて保存 [TIFF] ウィンドウで「麻薬の売人-」オブジェクト マップ ファイル名に追加し、クリックして、、'を保存 'ボタン
</li>
		<li>クリックして '分析/スケルトン/分析スケルトン 2 D 3-D'。ドロップ ダウン メニューで既定の設定をクリックして、'[ok] ' ボタン。ブランチ'情報'テーブルを保存、'結果テーブルと 2 つの出力ファイル (Skel オブジェクト ラベル - スケルトンとタグ付きスケルトン)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Thornburg, K. L., Kolahi, K., Pierce, M., Valent, A., Drake, R., Louey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+features+of+placental+programming.">Biological features of placental programming.</a> Placenta. 48, 47-53 (2016).</li><li>Misra, D. P., Salafia, C. M., Charles, A. K., Miller, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+weights+smaller+or+larger+than+the+placenta+predict+BMI+and+blood+pressure+at+age+7+years.">Birth weights smaller or larger than the placenta predict BMI and blood pressure at age 7 years.</a> J Dev Orig Health Dis. 1 (2), 123-130 (2010).</li><li>Burton, G. J., Fowden, A. L., Thornburg, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+Origins+of+Chronic+Disease.">Placental Origins of Chronic Disease.</a> Physiol Rev. 96 (4), 1509-1565 (2016).</li><li>Srinivasan, A. P., Omprakash, B. O. P., Lavanya, K., Subbulakshmi Murugesan, P., Kandaswamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prospective+study+of+villous+capillary+lesions+in+complicated+pregnancies.">A prospective study of villous capillary lesions in complicated pregnancies.</a> J Pregnancy. 2014, 193925 (2014).</li><li>Jones, C. J. P., Desoye, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+possible+function+for+placental+pericytes.">A new possible function for placental pericytes.</a> Cells Tissues Organs. 194 (1), 76-84 (2011).</li><li>Maly, A., Goshen, G., Sela, J., Pinelis, A., Stark, M., Maly, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histomorphometric+study+of+placental+villi+vascular+volume+in+toxemia+and+diabetes.">Histomorphometric study of placental villi vascular volume in toxemia and diabetes.</a> Hum Pathol. 36 (10), 1074-1079 (2005).</li><li>Ellery, P. M., Cindrova-Davies, T., Jauniaux, E., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. 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S., Burton, G. J., Oyen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+modeling+of+the+structure-function+relationship+in+human+placental+terminal+villi.">Computational modeling of the structure-function relationship in human placental terminal villi.</a> J Biomech. 49 (16), 3780-3787 (2016).</li><li>Mayhew, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stereological+perspective+on+placental+morphology+in+normal+and+complicated+pregnancies.">A stereological perspective on placental morphology in normal and complicated pregnancies.</a> J Anat. 215 (1), 77-90 (2009).</li><li>Teasdale, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gestational+changes+in+the+functional+structure+of+the+human+placenta+in+relation+to+fetal+growth:+a+morphometric+study.">Gestational changes in the functional structure of the human placenta in relation to fetal growth: a morphometric study.</a> Am J Obstet Gynecol. 137 (5), 560-568 (1980).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plaque+formation+and+isolation+of+pure+lines+with+poliomyelitis+viruses.">Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses.</a> J Exp Med. 99 (2), 167-182 (1954).</li><li>Gill, J. S., Salafia, C. M., Grebenkov, D., Vvedensky, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+oxygen+transport+in+human+placental+terminal+villi.">Modeling oxygen transport in human placental terminal villi.</a> J Theor Biol. 291, 33-41 (2011).</li><li>Plitman Mayo, R., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+modeling+of+human+placental+terminal+villi.">Three-dimensional modeling of human placental terminal villi.</a> Placenta. 43, 54-60 (2016).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

治験審査委員会は、整復終了妊娠からホルマリン固定の胎盤絨毛組織のコレクションを承認しました。医療記録の簡単なレビュー パリティ、母体年齢を指摘したし、基になる医療 (例えば、高血圧、糖尿病、狼瘡) または胎児 (構造または染色体の異常の不在を確認した手順を行う前に異常な成長) を行った。データ シートおよび任意の収集標本研究 ID だけにラベル付けされました。?...

発展途上の胎盤とその病態の理解は、大規模な測定では隣接する絨毛と含まれている毛細血管に由来する組織学的セクション間の空間関係を推論する制限されます。この研究では、毛細血管のネットワーク機能 (例えば分岐、堅さ) の解析に適している人間の胎盤毛細血管網の三次元 (3 D) のレンダリングを生成するための手段を開発することによってこの問題に取り組んでまいりました。これを行うに、我々 は 2 つの商業組織クリア製品、Visikol 1、Visikol 2 (以下ソリューション 1 と解決策 2) 蛍光抗体染色を組み合わせています。
ひと胎盤血管母親の絨毛間血液と胎児間のインターフェイスに位置する広大な複合体であります。絨毛のプレートの挿入から延びる、臍帯は、動脈と精巧な血管網と絨毛の表面をカバーする枝分かれ静脈のネットワークに分岐します。その両端は、インテリアや胎盤のディスク数より分岐世代を経るし、終末絨毛で、含まれている毛細血管網、ガス、栄養素、交換サイト終了の場所の深さにダウン浸透と代謝胎児と母体血を無駄に。
開発中に胎盤の毛細血管網への侮辱は、胎児、新生児、創発大人1,2,3の健康のため永続的な影響を持ちます。流産、子宮内胎児発育制限などの妊娠関連病態の観点から子癇前症、母体糖尿病4,5,6は測定方法の開発に置かれる高い値と胎盤絨毛の毛細血管網の特性。主要な障害は胎盤の血管網にスケールの広い範囲が含まれています。表面の血管網は直径 4-5 mm と同じくらい偉大ですることができます。ターミナルの絨毛の毛細血管では、直径 10 -20 μ m 程度、します。胎盤には血管7の 300 キロ以上が含まれています。現時点では、艦船スケールのこれらの極端をキャプチャすることができますほとんどを使用して簡単かつ迅速なテクニックがありません。日には、顕微鏡による絨毛の小さい数だけを表示できます。たとえば、Jirkovskaらに焦点を当てた胎盤絨毛期では、120 μ m 厚いセクションから取得した 1 μ m 間隔でシリアル光学セクションと共焦点顕微鏡を組み合わせること8が提供された研究のサンプルも統計の数上のデータはないです。毛細血管の構造、および絨毛と毛細血管の輪郭手描きトレース画像解析のエクスポートと。著者は、「成長している絨毛血管ネットワーク」の彼らの調査結果影響を議論のみの「期間」(36 + 週妊娠年齢) 組織を検討したときそのような結論問題となります。同様に、メイヨー et、l. ピアースらの血流と酸素転送のシミュレーションのための同じ年齢の組織に依存して、彼らの分析は、いくつか用語のみ終末絨毛9,10に限られていた.ステレオロジーは、絨毛血管の構造の研究にも適用されています。しかし、再び、フォーカスは一般的に産児 1 つ以上妊娠合併症11,12を提供することで後の妊娠にされています。
最近まで、共焦点顕微鏡に限られていた 100-200 μ m の組織の深さにイメージング蛍光の励起の吸収と放出のため上を覆う組織13 。3 D オフ組織学を広く文献に記載されている、組織だろうと何のための多数のメソッドがない組織での使用に適した一般、細胞形態、水分過剰による不可逆損害を与えるのでタンパク質や脂質の除去。したがって、これらの結果、組織自体の処理プロセスをクリア私たちの組織は伝統的な組織に対して検証することができる可逆的手法からはアーティファクトを示すことを確認することはないです。組織の清算は一般的に 3 つの主要なアプローチの 1 つを含む: 1) 連続による重力レンズから引き起こされる累積的な光散乱を除去する RI マッチング ソリューションによる組織成分の屈折率 (RI) の制服と一致します。低 RI (細胞質) の高い RI (タンパク質/脂質) 成分の変動2) ハイドロゲルを埋め込むと脂質成分; を削除する電気泳動/拡散を利用した脂質成分を削除します。3) RI 13の均一性を促進する溶媒の普及率の増加を許可する蛋白質の構造の拡大/変性。一方、これらのアプローチは、組織を透明にレンダリングすることができ、生成するバイオ マーカーの 3 D 表現を可能にする、これらの 3 D 表現は、疑わしい臨床値のそれはこれらの画像が組織プロパティを示しているかどうかを決定するために挑戦や組織のプロセスをクリアします。一方でオフ私たちの組織はリバーシブルなので標準組織学的および免疫組織化学的に適用できる変更が臨床的に重要かどうかを評価する同じ組織。
本稿では 23 の臨床的に正常とされる終端妊娠 9-23 週以降の妊娠と 2 つの満期正常分娩の間の合計 47 遠位絨毛試料の分析。胎盤絨毛細胞と内皮細胞の蛍光標識と、絨毛血管網とその複雑さの変化の定量的および自動分析を可能にしました。
このプロトコルでは、分離され、以前終末絨毛と可能ではない規模で自分の毛細血管網を分析します。このアプローチは、妊娠全体の絨毛と毛細血管のネットワークの開発に適用した場合は、健康な子供の生れのための基盤は、これらのプロパティを識別します。複雑な妊娠の研究に適用されるときと胎盤病理絨毛の木と彼らが鞘毛細血管網の変更どのようにこれらは胎児の幸福に影響を与える方法とまた明白にします。

<table><tbody><tr><td>10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>H-121-08</td><td>General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic</td></tr><tr><td>Scalpel blades</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-916-5B No. 11</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-913-5</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>78354-119</td><td></td></tr><tr><td>Micro Tube (1.7 mL)</td><td>PGC Scientifics</td><td>505-201</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>VWR</td><td>52947-948</td><td>disposable, 3ml transfer pipette</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Boehriner Mannheim</td><td>789 704</td><td>Dilute to 0.1% from stock</td></tr><tr><td>Goat Serum</td><td>Gibco</td><td>16210-064</td><td>Dilute to 2% in PBS solution</td></tr><tr><td>Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MS-1352-RQ</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-CD31 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>green emitting (520 nm) fluorochrome&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11017</td><td>Alexa-Fluor 488</td></tr><tr><td>infrared emitting (652 nm) fluorochrome</td><td>Invitrogen</td><td>A21072</td><td>Alexa Fluor 633</td></tr><tr><td>Ethanol alcohol 200 proof</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>Dilute down to lower concentrations using PBS as needed</td></tr><tr><td>Solution-1</td><td>Visikol Inc.</td><td></td><td>Visikol Histo-1</td></tr><tr><td>Solution-2</td><td>Visikol Inc.</td><td></td><td>Visikol Histo-2</td></tr><tr><td>Skyes-Moore chambers</td><td>BellCo Glass Inc.</td><td>P/N 1943-11111</td><td></td></tr><tr><td>25 gauge needle</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-826AA</td><td>BD Precision Glide Needes</td></tr><tr><td>3 mL syringe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-823-40</td><td>BD disposable syringe</td></tr><tr><td>PDMS silicon sheets</td><td>McMaster-Carr</td><td>P/N 578T31</td><td></td></tr><tr><td>confocal microscope</td><td>Nikon Inc.</td><td></td><td>Nikon C1 Confocal Microscope</td></tr><tr><td>Deconvolution software</td><td>Media Cybernetics</td><td></td><td>AutoQuant X22</td></tr><tr><td>Fiji image processing software</td><td></td><td></td><td>free, Open source&amp;nbsp; software available at https://fiji.sc</td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801570</td><td>Component 1 of SelecTech H&amp;amp;E staining system</td></tr><tr><td>Alcoholic Eosin</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801615</td><td>Component 2 of SelecTech H&amp;amp;E staining system</td></tr><tr><td>Blue Buffer</td><td>Leica Biosystems</td><td>3802918</td><td>Component 3 of SelecTech H&amp;amp;E staining system</td></tr><tr><td>Aqua Define MCX</td><td>Leica Biosystems</td><td>3803598</td><td>Component 4 of SelecTech H&amp;amp;E staining system</td></tr><tr><td>Immunohistochemistry detection system</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TL-125-QHD</td><td>UltraVision Quanto Detection System HRP DAB</td></tr></tbody></table>

three-dimensional rendering and analysis of immunolabeled, clarified human placental villous vascular networks

母と胎児間の栄養とガス交換に母体絨毛間血とひと胎盤の実質の多くを占める広大な絨毛の毛細血管網の界面で発生します。遠位の絨毛の毛細血管網は、臍帯から延びる血管の分岐の数世代後の胎児の血液供給の末端です。このネットワークは、それが継続的に浸されて母体血と胎児血液の混合を防ぐ栄養膜合胞体バリア層連続細胞鞘です。母体の糖尿病、高血圧、肥満などの疾患で発生する胎盤の毛細血管網の整合性への侮辱結果胎児、幼児、および大人のため、現在の深刻な健康リスクがあります。これらの侮辱の構造的な効果を定義するためのプロトコルは 1-2 mm3前記 1 つの完全な複雑さのトポロジカルな特徴を調べることができます順序毛細血管網構造をキャプチャするこの研究のため開発されました。これを達成するために胎盤から終末絨毛のクラスターは解剖、および栄養膜と毛細血管内皮細胞、カルビンディン抗体。これらのサンプルは、クリア処理 〜 1 mm の z 深さに共焦点画像のスタックを取得することが可能になる新しいティッシュで明らかにしました。これらのスタックの 3次元のレンダリングが処理し、分析し、このアプローチのための適合性の検証としてキャピラリー店舗・ キャピラリーのブランチ終了ポイント、ボリュームなど基本的な毛細血管網メジャーを生成します毛細血管網の特性。

ターミナルに納期 8 週間胎からひと胎盤絨毛のクラスターで毛細血管の生成された 3 D レンダリングは個々 のクラスターとしてカウントされ、ネットワーク解析の白骨します。(図 1A) 胎盤の機能ユニットは、表面の血管 (図 1Bと1 Cで拡大) 胎盤実質を浸透している彼らの延長にある絨毛...

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Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

本研究は、リバーシブルの組織免疫染色、3 D レンダリングやひと胎盤絨毛サンプル 1-2 mm3程度の血管ネットワークの解析をクリアするためのプロトコルを示します。

三次元レンダリングとカルビンディン抗体、解析人間の胎盤絨毛血管のネットワークを明らかにしました。

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

three-dimensional-rendering-analysis-immunolabeled-clarified-human

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.6K ビュー.  The New York State Office for People with Developmental Disabilities. 本研究は、リバーシブルの組織免疫染色、3 D レンダリングやひと胎盤絨毛サンプル 1-2 mm3程度の血管ネットワークの解析をクリアするためのプロトコルを示します。

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siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend diseases related to pregnancy. In this protocol, human primary villous cytotrophoblasts freshly isolated from placentas through a standard DNase/trypsin protocol are microporated with small interfering RNA (siRNA). This approach provided greater efficiency for siRNA transfection when compared to a lipofection-based method. Transfected cells can subsequently be analyzed by standard Western blot within a time frame of 3-4 days post-transfection. In addition, using cultured primary villous cytotrophoblasts, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) analysis was optimized and performed on extracts from days 1 to 4. The use of these cultured primary cells and the protocol described allow for an evaluation of the implication of specific genes and transcription factors in the process of villous cytotrophoblast differentiation into a syncytiotrophoblast-like cell layer. However, the limited time span allowable in culture precludes the use of methods requiring more time, such as generation of a stable cell population. Therefore testing of this cell population requires highly optimized gene transfer protocols.

This protocol describes a method for efficiently transfecting siRNA in freshly isolated human villous cytotrophoblasts using microporation and identifying DNA-protein complexes in these cells. Transfected cells can be monitored by Western blot and EMSA analyses during the 4-day culture time.

新たに単離したヒト絨毛細胞栄養芽層に対するsiRNAトランスフェクションおよびEMSA分析

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

遺伝学

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.

This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.

マウス子宮内妊娠中の母体の血管リモデリングの評価

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

発生生物学

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent endothelial progenitors (EPs), which can differentiate into the cell types necessary to assemble mature, functional vasculature, have been derived from both embryonic and induced pluripotent stem cells. However, these cells have not been rigorously evaluated in three-dimensional environments, and a quantitative measure of their vasculogenic potential remains elusive. Here, the generation and isolation of iPSC-EPs via fluorescent-activated cell sorting are first outlined, followed by a description of the encapsulation and culture of iPSC-EPs in collagen hydrogels. This extracellular matrix (ECM)-mimicking microenvironment encourages a robust vasculogenic response; vascular networks form after a week of culture. The creation of a computational pipeline that utilizes open-source software to quantify this vasculogenic response is delineated. This pipeline is specifically designed to preserve the 3D architecture of the capillary plexus to robustly identify the number of branches, branching points, and the total network length with minimal user input.

Endothelial progenitors derived from induced pluripotent stem cells (iPSC-EPs) have the potential to revolutionize cardiovascular disease treatments and to enable the creation of more faithful cardiovascular disease models. Herein, the encapsulation of iPSC-EPs in three-dimensional (3D) collagen microenvironments and a quantitative analysis of these cells&#8217; vasculogenic potential are described.

iPSC由来内皮前駆体の血管学的電位を定量化するインビトロ3Dモデルと計算パイプライン

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

母体・胎児のインターフェイスでの感染症を研究するためにヒト胎盤および脱落膜器官培養

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

免疫・感染学

フローベースアプローチによるex vivo胎盤外植片培養の改善

Ex Vivo Placental Explant Flow Culture - Mimicking the Dynamic Conditions In Utero

The existing ex vivo placental explant culture models are primarily grounded in static culture systems using well plates. However, these models inadequately reflect the dynamic in utero setting, where the placenta encounters constant slight shear stress due to plasma or blood flow. To address this limitation, a flow culture system has been devised to bring ex vivo placental explant cultivation closer to the in utero flow conditions experienced within the maternal body. Within this approach, placental explants are cultivated in a sequence of five interconnected flow chambers. This setting&#160;maintains physiological oxygen concentrations and a consistent flow rate. The collected data reveals that under flow conditions, the preservation of tissue morphology exhibits notable enhancement compared to conventional static methods. This innovative technique introduces a straightforward means of ex vivo placental explant culture, offering a more faithful representation of the dynamic in vivo environment. Moreover, this study introduces new&#160;possibilities for investigating the functional dynamics of the feto-maternal interface. By embracing feasible dynamic methodologies, a deeper comprehension of placental biology is facilitated, underscoring its relevance for maternal-fetal health.

著者スポットライト:胎盤組織におけるシングルセルシーケンシングと空間的組織学による研究の進展 

Here is a protocol for culturing placental explants under constant flow conditions. This approach enhances traditional static villous culture systems by enabling the replication of dynamic physiological environments.

Ex Vivo(エクス・ビボ)胎盤外植体フロー培養 - 子宮内の動的条件の模倣

The existing ex vivo placental explant culture models are primarily grounded in static culture systems using well plates. However, these models ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

胚肢の皮膚の血管系のためのホールマウント免疫組織化学的解析：胚における血管分岐形態形成を研究するモデルシステム

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

生物学

Retinal Pericytes Visualization Using Tissue-Clearing and Fluorescent Labeling

3D Visualization of Retinal Vascular Pericytes in Mice by Immunostaining

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal vasculature. To provide a detailed view of the morphological characteristics of pericytes, this study described a new approach combining the retro-orbital injection of a fluorescent agent, immunofluorescent-staining, and tissue-clearing treatment. Firstly, the fluorescent tomato lectin was injected into the retro-orbital sinus of the live mouse to label the retinal vasculature. After 5 min, the mouse was sacrificed, and its intact retina was carefully removed from the retinal cup and immunofluorescently stained with platelet-derived growth factor receptor &#946; to reveal the pericytes. Additionally, the stained retina was treated with tissue-clearing reagent and whole mounted on the microscope slide. Through these approaches, the retinal vasculature and pericytes were clearly observed in the transparent retina. Under a confocal microscope, we obtained more opportunities to take high-resolution images for further reconstructing and analyzing the morphological characteristics of pericytes along the retinal vascular tree in a three-dimensional view. Methodologically, this protocol offers an effective approach for visualizing pericytes within the retinal vasculature, providing valuable insights into their role under both physiological and pathological conditions.

The pericytes in retinal vasculature were examined by immunofluorescent staining with platelet-derived growth factor receptor &#946; after retro-orbital injection of fluorescent tomato lectin. The labeled retina was further treated with the tissue-clearing method and whole mounted for visualizing the three-dimensional views of pericytes surrounding retinal vasculature under a confocal microscope.

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal ...

生化学

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore largely based on animal studies, despite the high diversity among species in placental anatomy, hemodynamics and duration of the pregnancy. The vast majority of human placenta studies are ex vivo perfusion studies or in vitro trophoblast studies. Although in vitro studies and animal models are essential, extrapolation of the results from such studies to the human placenta in vivo is uncertain. We aimed to study human placenta physiology in vivo at term, and present a detailed protocol of the method. Exploiting the intraabdominal access to the uterine vein just before the uterine incision during planned cesarean section, we collect blood samples from the incoming and outgoing vessels on the maternal and fetal sides of the placenta. When combining concentration measurements from blood samples with volume blood flow measurements, we are able to quantify placental and fetal uptake and release of any compound. Furthermore, placental tissue samples from the same mother-fetus pairs can provide measurements of transporter density and activity and other aspects of placental functions in vivo. Through this integrative use of the 4-vessel sampling method we are able to test some of the current concepts of placental nutrient transfer and metabolism in vivo, both in normal and pathological pregnancies. Furthermore, this method enables the identification of substances secreted by the placenta to the maternal circulation, which could be an important contribution to the search for biomarkers of placenta dysfunction.

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

We present a detailed method to study human placental physiology in vivo at term. The method combines blood sampling from the incoming and outgoing vessels on the maternal and fetal sides of the placenta with ultrasound measurements of volume blood flow and placental tissue sampling.

ヒト胎盤生理学の統合研究への4容器サンプリングアプローチ<em&gt;インビボ</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

三次元レンダリングとカルビンディン抗体、解析人間の胎盤絨毛血管のネットワークを明らかにしました。

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新たに単離したヒト絨毛細胞栄養芽層に対するsiRNAトランスフェクションおよびEMSA分析

マウス子宮内妊娠中の母体の血管リモデリングの評価

iPSC由来内皮前駆体の血管学的電位を定量化するインビトロ3Dモデルと計算パイプライン

母体・胎児のインターフェイスでの感染症を研究するためにヒト胎盤および脱落膜器官培養

Ex Vivo(エクス・ビボ)胎盤外植体フロー培養 - 子宮内の動的条件の模倣

Ex Vivo(エクス・ビボ)胎盤外植体フロー培養 - 子宮内の動的条件の模倣

Ex Vivo(エクス・ビボ)胎盤外植体フロー培養 - 子宮内の動的条件の模倣

胚肢の皮膚の血管系のためのホールマウント免疫組織化学的解析：胚における血管分岐形態形成を研究するモデルシステム

3D Visualization of Retinal Vascular Pericytes in Mice by Immunostaining

ヒト胎盤生理学の統合研究への4容器サンプリングアプローチ