このプロトコルを開発することの彼らの初期の作品の Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP デュアル レポーター mESC ライン ジェニファー タイソン、アシフ Maroof、ティム ・ ペトロスを開発するため清徐に感謝しております。また、テクニカル サポートにチョップ流れ cytometry コアを感謝いたします。この作品は、NIH R01 MH066912 (SA) と F30 MH105045 02 (DT) によって支えられました。

注: このプロトコルで記述されているデュアル レポーター mESC ラインはリクエスト制 (sande@mail.med.upenn.edu です)。
1. メディアの準備
注: は、細胞培養で使用する前に 37 ° C にすべてのメディアを温めます。
<ol><li>
(500 mL の準備) のマウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEF) メディア
	<ol>
<li>ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) と 500 mL 0.22 μ m 孔フィルター ユニットを介してフィルターの 449 mL に 50 mL のウシ胎児血清 (FBS) を追加します。</li>
		<li>ろ過後 1 mL 抗菌剤 (50 mg/mL) を追加します。1 ヶ月または因数 ≤ で店の 4 ° C でメディアを格納-20 ° C</li>
	</ol>
</li>
	<li>
(500 mL の準備) のための N2 メディア
	<ol>
<li>5 mL L アラニン L-グルタミンを追加 (100 x) と 500 μ L 2-メルカプトエタノール (55 mM) 489.5 mL DMEM: 栄養混合物 F-12 (DMEM/F-12)、および 500 mL 0.22 μ m 孔フィルター ユニットを介してフィルター。</li>
		<li>ろ過後 1 mL 抗菌剤 (50 mg/mL)、5 mL N2 サプリメント B を追加します。最大 1 ヶ月間、暗闇の中で 4 ° C でメディアを保管します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
(500 mL の準備) の成長の無血清培地 (KSR)
	<ol>
<li>75 mL 無血清培地のサプリメントは、5 mL の L グルタミンを追加 (100 x) 5 mL MEM 非必須アミノ酸 (MEM NEAA) (100 倍) 500 μ L 2-メルカプトエタノール (55 mM) 413.5 mL 非グルタミンを含む DMEM、500 mL 0.22 μ m 孔フィルター ユニットを介してフィルターと。</li>
		<li>ろ過後 1 mL 抗菌剤 (50 mg/mL) を追加します。1 ヶ月の 4 ° C でメディアを格納します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
(500 mL の準備) のマウス胚性幹細胞のメディア
	<ol>
<li>75 mL 幹細胞グレード FBS、5 mL MEM NEAA を追加 (100 x) 5 mL L グルタミン (100 x) 500 μ L 2-メルカプトエタノール (55 mM) 413.5 mL 非グルタミンを含む DMEM、500 mL 0.22 μ m 孔フィルター ユニットを介してフィルターと。</li>
		<li>ろ過後 1 mL 抗菌剤 (50 mg/mL) を追加します。1 ヶ月または因数 ≤ で店の暗闇の中で 4 ° C でメディアを保管-20 ° C</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 培養 mESCs
<ol><li>3-4 × 10 の4セル/cm2で扱われる組織培養プレートに MEF メディアで有糸分裂アクティブ MEF フィーダー細胞をプレートします。少なくとも 12 h ≥ 95% 相対湿度と 5% CO2と 37 ° C で細胞文化のインキュベーターで、mESCs をめっきする前に解決するを許可します。すぐに使用しない、3 日おきに MEF のメディアを交換してください。処分 MEFs めっき後 7 日以内に使用されていない場合。</li>
	<li>マウス白血病の抑制的な要因 (mLIF) (1,000 U/mL) mESC 培地で MEF プレートに mESCs (× 104セル/cm21 4 から密度範囲) を追加します。≥ 95% 相対湿度と 5% CO2と 37 ° C でセルを孵化させなさい。</li>
	<li>トリプシン-EDTA (0.05% トリプシン) を使用して mESCs の通路 (1:5-1:10) 皿になったら ~ 70-80% の合流や植民地が接触し始めているかどうか。これは通常、2 日ごとに発生しますが、初期めっき密度に応じて 4 または 5 日にかかることが。</li>
	<li>MESC 中多能性を維持する MEF の送り装置の層の mESCs を維持します。</li>
	<li>
分化を開始する前に少なくとも一度 MEFs、MEFs を希釈することがなくゼラチン コーティング プレートの上に細胞を通路します。
	<ol>
<li>ゼラチンをリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) Ca2 +/Mg2 +扱われる細胞培養用ディッシュに 0.1% ゼラチン コーティング プレートを準備し、37 ° c 少なくとも 1 h. プレート 1.5-2 x 10 の6セル/10 cm プレートを残して (10 x 2.7 3.64セル/cm2) の細胞は分化を開始する前に 2 日間の拡大して。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. MGE のような胎生前駆細胞に対する mESCs の差別化
<ol><li>
分化の日 (DD) 0 =「浮遊細胞」
	<ol>
<li>MESCs で育った後 2 日間ゼラチン コーティング プレートはメディアを吸引し、Ca2 +/Mg2 +なし PBS で 1 回洗浄を行う。十分なトリプシン-EDTA (0.05% トリプシン) (通常 4 mL トリプシン-EDTA 1 つ 10 cm 培養皿のため)、プレートの表面をカバーし、4 分の ≥95% の相対湿度と 5% CO2と 37 ° c の定温器に戻るセルに配置を追加します。</li>
		<li>4 分後 mESC メディアで 2 倍のボリュームを使用してトリプシン-EDTA を癒します。適切なサイズの遠心管にセルを転送し、200 x g で 5 分で細胞を遠心分離します。5 分後チューブを削除し、ペレットを乱すことがなくメディアを吸引します。LDN 193189 BMP 阻害剤を含む KSR:N2 メディア (1:1) 1 mL にペレットを再懸濁します (250 nM) および wnt シグナル阻害剤価格 939 (10 μ M)。</li>
		<li>検定または自動化された細胞カウンターを用いた細胞濃度を測定します。LDN 193189 を含む KSR:N2 メディア (1:1) で 75,000 セル/mL を追加することによって胚様体 (EBs) として細胞を成長を開始 (250 nM) および価格 939 (10 μ M) 非付着ティッシュの培養皿で。≥ 95% 相対湿度と 5% CO2と 37 ° C でセルを孵化させなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>DD1、≥ 95% 相対湿度、37 ° C で (O/N)「着陸」ポリ-L-リジン (10 μ g/mL PBS で Ca2 +/Mg2 +) のコーティング処理ティッシュの培養皿で一晩セルのまたは少なくとも 1 時間のために準備します。</li>
	<li>Dd2 は、ポリ-L-リジンを吸引し、ラミニン (10 μ g/mL PBS で Ca2 +/Mg2 +) でプレートをコート O/N ≥ 95% 相対湿度、37 ° C で。 注: O/N は最適な少し中 2 h が十分かもしれません。次の日に板を使用しない場合ラミニンを吸引せず Ca2 +/Mg2 +PBS の変更、4 ° C で 2 週間まで保存します。</li>
	<li>
DD3 (「セルの土地」)
	<ol>
<li>EB 解離を開始する前に、ラミニンを吸引し、プレートをティッシュ文化フードで完全に乾燥します。光沢のあるまたはぬれた目に見えて表示される板は使用しないでください。15 mL チューブに 15 g x または EBs がペレットまでで 3 〜 4 分間遠心するメディアと EBs を転送します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>メディアを吸引し、DNase を含む細胞剥離溶液 3 mL を加える (2 U/mL) と, ≥ 95% 相対湿度、37 ° C で 15 分 5% CO2優しくはじく 3 毎分 EB 解離を支援します。</li>
	<li>EBs が表示されなくまたは 15 分が経過した, DNase を含む 6 mL KSR:N2 (1:1) に追加 (1 U/mL) と 200 x g で 5 分間遠心します。</li>
	<li>LDN 193189 を含む KSR:N2 (1:1) で細胞をプレート (250 nM)、価格 939 (10 μ M)、ROCK 阻害剤の Y-27632 (10 μ M) で 4.5-5 104セル/cm2倍。</li>
</ol>4. SST 豊かプロトコル:「DD12 GFP 高ソニック ・ ザ ・ ヘッジホッグ (SHH)」(3.7 手順からの続き)
<ol><li>DD5、FGF 2 を含んでいる KSR:N2 (1:1) とメディアを変更 (10 ng/mL)、IGF-1 (20 ng/mL)、および SSH (50 ng/mL)。</li>
	<li>日 8 (ステップ 4.4) に再めっき組織培養プレートを準備手順 3.2 3.3 で説明されている手順を使用して。</li>
	<li>DD7、FGF 2 を含んでいる KSR:N2 (1:1) とメディアを変更 (10 ng/mL)、IGF-1 (20 ng/mL) と SHH (50 ng/mL)。</li>
	<li>
DD8、上プレート細胞の再。 注: この手順は必須ではありません、再めっきセル初期分化、不要な細胞の種類減らすことができます。再メッキして、下流の免疫組織化学的解析を難しく細胞のボールを分割後時点で FACS の効率を高めます。<ol>
<li>再細胞をプレート、≥95% の相対湿度と 5% CO2と 37 ° C で 5 分間トリプシン-EDTA (0.05% トリプシン) でプレートから細胞を分離します。KSR:N2 と 2 倍のボリュームを使用してトリプシン-EDTA を消すし、200 x g で 5 分間遠心フィルターいずれかの塊を削除する 40 μ m のフィルター チューブを介して細胞。FGF 2 を含む 250,000 セル/cm2で N2/KSR (1:1) セルを再プレート (10 ng/mL)、IGF-1 (20 ng/mL) と Y-27632 (10 μ M) SHH と (50 ng/mL)。 注: 代わりに、再 DD8 に細胞をプレートに決定、SHH を含む KSR:N2 とメディアを変更 (50 ng/mL) DD7 から DD12 2 日おき IGF-1 に追加して、(20 ng/mL) と FGF 2 (10 ng/mL) DD9 まで。</li>
	</ol>
</li>
	<li>DD10、SHH を含む KSR:N2 とメディアを変更 (50 ng/mL)。</li>
	<li>
DD12、SST のサブタイプの濃縮細胞を得るためには、使用 FACS して切り離します Lhx6::GFP-のみ発現細胞。
	<ol>
<li>セルをデタッチするには、トリプシン-EDTA よりもむしろ非トリプシン含有細胞解離試薬を使用します。細胞 Ca2 +/Mg2 +なし PBS で 1 回洗浄します。DNase を含む予め温めておいた非トリプシン含有細胞解離試薬を追加 (2 U/mL) のセルにします。≥95% の相対湿度と 5% CO2と 37 ° C で 10-30 分またはセルをデタッチするまでのインキュベーターに入れます。解離を支援するために 5 分ごとの板が軽きます。 注: DD11 12 文化の 10-15 分のみ必要があります。用 dd15 用 16 文化のため 30 分以上必要があります完全な解離のため。</li>
		<li>セルが完全にプレートを持ち上げ、一度 FACS 分離標準プロトコルを使用してに進むか、その他の下流解析のセルを使用します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 太陽光発電豊かプロトコル:「DD11/DD17 mCherry + aPKCi」(3.7 の手順からの続き)
<ol><li>DD5、FGF 2 を含んでいる KSR:N2 (1:1) とメディアを変更 (10 ng/mL) と IGF-1 (20 ng/mL)。</li>
	<li>DD8 再めっきの組織培養プレートを準備 3.2 3.3 の手順 (手順 4.4) に記載されている手順を使用して。</li>
	<li>DD7、FGF 2 を含んでいる KSR:N2 (1:1) とメディアを変更 (10 ng/mL) と IGF-1 (20 ng/mL)。</li>
	<li>DD8 に再セルを次の例外を除き、手順 4.4 で説明したプレート: セルは再メッキしているとき、に置き換える SHH 滑らかアゴニスト (サグ; 30 nM) と非定型の PKC 阻害剤 (aPKCi; 2 μ M) を追加。まとめると、再メッキのメディアは今 N2/KSR (1:1) を含む FGF 2 (10 ng/mL)、IGF-1 (20 ng/mL)、Y-27632 (10 μ M)、サグ (30 nM)、および aPKCi (2 μ M)。</li>
	<li>DD10、aPKCi (2 μ M) を含む KSR:N2 のメディアを変更します。</li>
	<li>
DD11 注: この時点で、Nkx2.1::mCherry+ 細胞は、太陽光発電 CIns になる濃縮されています。<ol>
<li>ステップ 4.6 に記載されている同じプロトコルを使用して FACS のためプレートから細胞をデタッチします。決定は後日分化 Nkx2.1::mCherry+ 細胞を収集する場合は、この手順を無視してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>DD12、aPKCi (2 μ M) を含む KSR:N2 のメディアを変更します。DD14、aPKCi (2 μ M) を含む KSR:N2 のメディアを変更します。国鉄 DD16、aPKCi (2 μ M) を含む KSR:N2 のメディアを変更します。DD17、ステップ 4.6 に記載されている同じプロトコルを使用して Nkx2.1::mCherry+ 細胞を収集します。</li>
</ol>6. 太陽光発電豊かプロトコル:「DD17 mCherry 低分子機構」(3.7 手順からの続き)
<ol><li>DD5、FGF 2 を含んでいる KSR:N2 (1:1) とメディアを変更 (10 ng/mL) と IGF-1 (20 ng/mL)。DD7、FGF 2 を含んでいる KSR:N2 (1:1) とメディアを変更 (10 ng/mL) と IGF-1 (20 ng/mL)。</li>
	<li>
DD9、KSR:N2 (1:1) では、メディアを変更します。これ以降に成長因子を追加する必要はありません。
	<ol>
<li>DD17 のセルを収穫まで 2 日おきに、メディアを変更していきます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jones, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+of+cortical+interneurons:+mouse+versus+monkey+and+human.">The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human.</a> Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).</li><li>Wonders, C. P., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+specification+of+cortical+interneurons.">The origin and specification of cortical interneurons.</a> Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696 (2006).</li><li>Ascoli, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Petilla+terminology:+nomenclature+of+features+of+GABAergic+interneurons+of+the+cerebral+cortex.">Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex.</a> Nature reviews. Neuroscience. 9, 557-568 (2008).</li><li>DeFelipe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+classification+and+nomenclature+of+cortical+GABAergic+interneurons.">New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons.</a> Nature reviews. Neuroscience. 14, 202-216 (2013).</li><li>Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemical+characterization+of+inhibitory+mouse+cortical+neurons:+three+chemically+distinct+classes+of+inhibitory+cells.">Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells.</a> J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).</li><li>Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Losing+your+inhibition:+Linking+cortical+GABAergic+interneurons+to+schizophrenia.">Losing your inhibition: Linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia.</a> Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).</li><li>Benes, F. M., Berretta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+interneurons:+implications+for+understanding+schizophrenia+and+bipolar+disorder.">GABAergic interneurons: implications for understanding schizophrenia and bipolar disorder.</a> Neuropsychopharmacology. 25, 1-27 (2001).</li><li>Tyson, J. A., Goldberg, E. M., Maroof, A. M., Petros, T. P., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duration+of+culture+and+Sonic+Hedgehog+signaling+differentially+specify+PV+versus+SST+cortical+interneuron+fates+from+embryonic+stem+cells.">Duration of culture and Sonic Hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells.</a> Development. 142, 1267-1278 (2015).</li><li>Au, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+gain-of-function+approach+to+generate+cortical+interneuron+subtypes+from+ES+cells.">A modular gain-of-function approach to generate cortical interneuron subtypes from ES cells.</a> Neuron. 80, 1145-1158 (2013).</li><li>Petros, T. J., Maurer, C. W., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+derivation+of+mouse+ESC-derived+cortical+interneurons+by+expression+of+Nkx2.1.">Enhanced derivation of mouse ESC-derived cortical interneurons by expression of Nkx2.1.</a> Stem Cell Res. 11, 647-656 (2013).</li><li>Cambray, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+induces+cortical+interneuron+identity+and+differentiation+in+embryonic+stem+cell-derived+telencephalic+neural+precursors.">Activin induces cortical interneuron identity and differentiation in embryonic stem cell-derived telencephalic neural precursors.</a> Nat Commun. 3, 841 (2012).</li><li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+"MGE+Enhancers"+for+Labeling+and+Selection+of+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Medial+Ganglionic+Eminence+(MGE)+Progenitors+and+Neurons.">Use of "MGE Enhancers" for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons.</a> PloS one. 8, e61956 (2013).</li><li>Danjo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subregional+specification+of+embryonic+stem+cell-derived+ventral+telencephalic+tissues+by+timed+and+combinatory+treatment+with+extrinsic+signals.">Subregional specification of embryonic stem cell-derived ventral telencephalic tissues by timed and combinatory treatment with extrinsic signals.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 1919-1933 (2011).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+telencephalic+precursors+from+embryonic+stem+cells.">Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells.</a> Nat Neurosci. 8, 288-296 (2005).</li><li>Tyson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duration+of+culture+and+sonic+hedgehog+signaling+differentially+specify+PV+versus+SST+cortical+interneuron+fates+from+embryonic+stem+cells.">Duration of culture and sonic hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells.</a> Development. 142, 1267-1278 (2015).</li><li>Maroof, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+and+functional+maturation+of+cortical+interneurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).</li><li>Tischfield, D. J., Kim, J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical+PKC+and+Notch+Inhibition+Differentially+Modulate+Cortical+Interneuron+Subclass+Fate+from+Embryonic+Stem+Cells.">Atypical PKC and Notch Inhibition Differentially Modulate Cortical Interneuron Subclass Fate from Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 8, 1135-1143 (2017).</li><li>Liodis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lhx6+activity+is+required+for+the+normal+migration+and+specification+of+cortical+interneuron+subtypes.">Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 3078-3089 (2007).</li><li>Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKX2.1+specifies+cortical+interneuron+fate+by+activating+Lhx6.">NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6.</a> Development. 135, 1559-1567 (2008).</li><li>Marin, O., Anderson, S. A., Rubenstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+molecular+specification+of+striatal+interneurons.">Origin and molecular specification of striatal interneurons.</a> Journal of Neuroscience. 20, 6063-6076 (2000).</li><li>Xu, Q., Wonders, C. P., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+maintains+the+identity+of+cortical+interneuron+progenitors+in+the+ventral+telencephalon.">Sonic hedgehog maintains the identity of cortical interneuron progenitors in the ventral telencephalon.</a> Development. 132, 4987-4998 (2005).</li><li>Glickstein, S. B., Alexander, S., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+cyclin+D2+and+D1+protein+expression+distinguish+forebrain+progenitor+subsets.">Differences in cyclin D2 and D1 protein expression distinguish forebrain progenitor subsets.</a> Cereb Cortex. 17, 632-642 (2007).</li><li>Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+versus+Basal+Neurogenesis+Directs+Cortical+Interneuron+Subclass+Fate.">Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate.</a> Cell Rep. 13, 1090-1095 (2015).</li><li>Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+Nkx2.1-lineage+cells+in+the+mouse+telencephalon.">Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon.</a> J Comp Neurol. 506, 16-29 (2008).</li><li>Wonders, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spatial+bias+for+the+origins+of+interneuron+subgroups+within+the+medial+ganglionic+eminence.">A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence.</a> Dev Biol. 314, 127-136 (2008).</li><li>Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+bias+in+the+mitotic+origins+of+somatostatin-+and+parvalbumin-expressing+interneuron+subgroups+and+the+chandelier+subtype+in+the+medial+ganglionic+eminence.">Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence.</a> Cereb Cortex. 22, 820-827 (2012).</li><li>Flames, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delineation+of+multiple+subpallial+progenitor+domains+by+the+combinatorial+expression+of+transcriptional+codes.">Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 9682-9695 (2007).</li><li>Fogarty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+genetic+patterning+of+the+embryonic+neuroepithelium+generates+GABAergic+interneuron+diversity+in+the+adult+cortex.">Spatial genetic patterning of the embryonic neuroepithelium generates GABAergic interneuron diversity in the adult cortex.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 10935-10946 (2007).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals.">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).</li><li>Colasante, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Conversion+of+Fibroblasts+into+Functional+Forebrain+GABAergic+Interneurons+by+Direct+Genetic+Reprogramming.">Rapid Conversion of Fibroblasts into Functional Forebrain GABAergic Interneurons by Direct Genetic Reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 17, 719-734 (2015).</li><li>Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+cortical+interneuron+subtypes.">Origins of cortical interneuron subtypes.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 2612-2622 (2004).</li><li>Southwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneurons+from+embryonic+development+to+cell-based+therapy.">Interneurons from embryonic development to cell-based therapy.</a> Science. 344, 1240622 (2014).</li><li>Tyson, J. A., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+interneuron+transplants+to+study+development+and+treat+disease.">GABAergic interneuron transplants to study development and treat disease.</a> Trends Neurosci. 37, 169-177 (2014).</li><li>Donegan, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+interneuron+transplants+as+a+treatment+for+schizophrenia:+preclinical+validation+in+a+rodent+model.">Stem cell-derived interneuron transplants as a treatment for schizophrenia: preclinical validation in a rodent model.</a> Mol Psychiatry. , (2016).</li><li>Deglincerti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+human+embryonic+stem+cells+on+micropatterns.">Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns.</a> Nat Protoc. 11, 2223-2232 (2016).</li><li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling.">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+cultivation+of+naive-like+human+pluripotent+stem+cells+based+on+HERVH+expression.">Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression.</a> Nat Protoc. 11, 327-346 (2016).</li><li>Zeltner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+biology+of+disease+severity+in+a+PSC-based+model+of+familial+dysautonomia.">Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia.</a> Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).</li><li>Blahos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+site+on+the+Galpha+-protein+that+recognizes+heptahelical+receptors.">A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors.</a> J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

この方法は J1 から派生した mESCs (SCRC-1010) をパターンで非常に効果的な他 mESC 回線とクローン分離変数の成功を経験した.たとえば、Foxg1::venus mESCs (EB3 派生;男女ら13) 応答このプロトコルと DD12 Foxg1 誘導が不十分な通常 1-2% 程度です。理由は我々 は完全に理解していないが、(JQ27 と呼ばれる) この議定書に記載されている行と同時に分離された (JQ59 と呼ばれる) もう一?...

マウスとヒトの両方でほぼすべて皮質抑制性介在ニューロン (CIns) の半分で内側の神経節隆起 (MGE) として知られている一時的な皮質下構造内で発信 CIns 他神経細胞とグリア細胞の上皮細胞内前駆細胞サブグループは、転写因子 Nkx2.11,2を表現します。CIn サブグループまたはサブタイプは、形態学的、神経化学的、電気生理学的の交差と接続特性3,4によって定義されます。MGE 派生 CIns に分けられます太陽光発電または SST、電気生理学的および接続の特定の傾向5どの相関式の表現に基づいて主に非重複のサブグループ。特に PV サブグループ、介在神経の機能不全は、複数神経疾患と疾患6,7に関与しています。このメソッドの全体的な目標は、幹細胞由来細胞分裂前駆細胞と太陽光発電または SST CIn の運命: 皮質介在ニューロンの生物学を勉強するため、細胞ベースの治療で使用するための濃縮渡り鳥の前駆体を生成することです。
Nkx2.1 表現する介在ニューロン前駆細胞とその子孫な mESCs からの派生のためのスケーラブルな非常に効率的な手法を提案します。Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP を使用してデュアル レポーター mESC 行8、Nkx2.1 前駆細胞、または彼らの Lhx6 を表現するポスト mitotic 子孫を FACS による分離し後で多くのダウン ストリーム アプリケーションで使用できます。シグナル伝達経路の数、文化の期間、神経新生のモードを操作することによって数百万の蛍光に分類された介在ニューロン前駆体下流のアプリケーション ホストに適してを取得できます。
MESCs9,10、11,12,13,14, Wnt に依存している私たちのメソッドから MGE のような前駆細胞を生成するためにいくつかの他の方法が存在するが価格 939、拮抗薬は、Foxg1/Nkx2.1 胎生前駆細胞の共発現を生成するに特に効果的です。さらに、介在ニューロン前駆細胞や、デュアル レポーター システムを介して彼らポスト mitotic Lhx6 表現の子孫を選択する能力は大きく異なる前駆細胞および彼らの子孫を生成する能力を高めます。

<table><tbody><tr><td>Bottle-top vacuum filter system</td><td>Corning</td><td>CLS430769</td><td></td></tr><tr><td>Test Tube with Cell Strainer Snap Cap</td><td>ThermoFisher</td><td>Corning 352235</td><td></td></tr><tr><td>Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M)</td><td>MTI-Globalstem</td><td>GSC-6101G</td><td>1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: &lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;29&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;35&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>Ant-pm-2</td><td>Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media -- add after filtration. References: &lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;9&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;11&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;36&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;37&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>N2 supplement-B</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7156</td><td>Do not filter with base media -- add after filtration</td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td>Also known as L-alanine-L-glutamine. References: &lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;9&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;11&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;38&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;39&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement (KSR)</td><td>ThermoFisher</td><td>10828028</td><td>Also known as serum-free medium supplement. References: &lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;9&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>L-glutamine (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>ThermoFisher</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>10829018</td><td>Also known as non-glutamine containing DMEM. References: &lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;9&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>VWR</td><td>82013-578</td><td>Also known as stem cell grade FBS. References: &lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;9&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Tissue culture treated dish (10cm)</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Non-adherent sterile petri dish (10cm)</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>Leukemia inhibitory factor (mLIF)</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td>Do not freeze, store at 4&#039;C. References: &lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;9&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>0.1% Gelatin Solution</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-999-027</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P6282</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ThermoFisher</td><td>A1110501</td><td>Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: &lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;9&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;,&lt;/sup&gt;&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>RQ1 RNase-Free DNase</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td>Resuspend in DMSO and store at -80&#039;C in single use aliquots</td></tr><tr><td>XAV939</td><td>Stemgent</td><td>04-0046</td><td>Resuspend in DMSO and store at -80&#039;C in single use aliquots</td></tr><tr><td>rhFGF-2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB</td><td>Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80&#039;C in single use aliquots</td></tr><tr><td>rhIGF-2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>291-G1</td><td>Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80&#039;C in single use aliquots</td></tr><tr><td>ROCK inhibitor (Y-27632)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Resuspend in DMSO and store at -80&#039;C in single use aliquots</td></tr><tr><td>Smoothened agonist (SAG)</td><td>Millipore</td><td>566660-1MG</td><td>Resuspend in H20 and store at -80&#039;C in single use aliquots</td></tr><tr><td>rm Sonic Hedgehog/SHH</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>464-SH-025</td><td>Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80&#039;C in single use aliquots</td></tr><tr><td>PKC&amp;zeta; Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated</td><td>EMD Millipore</td><td>539624</td><td>Resuspend in H20 and store at -80&#039;C in single use aliquots</td></tr></tbody></table>

differentiation of mouse embryonic stem cells into cortical interneuron precursors

Gaba 作動性皮質介在ニューロンは、興奮性錐体細胞の出力を調節するだけでなく、アンサンブル錐体細胞の出力を同期で重要な役割を果たす細胞の異種集団です。介在ニューロン機能の欠損は、さまざまな統合失調症、自閉症、てんかんなどの精神・神経疾患に関与しています。胚性幹細胞から皮質介在ニューロンの導出は、彼らの開発と機能の研究では、だけでなく、皮質介在関連疾患の発症分子メカニズムに洞察力を提供します。介在ニューロンはまた生き残るため、移行、および統合ホスト皮質回路移植後、細胞ベースの治療で使用するための理想的な候補者を作る顕著な能力を持っています。Nkx2.1 を表現する介在ニューロン前駆細胞とその子孫なマウス胚性幹細胞 (mESCs) からの派生にスケーラブルな非常に効率的な変更された胚様体-単層メソッドを紹介します。Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP デュアル レポーター mESC ラインを使用して、Nkx2.1 前駆細胞または彼らの Lhx6 を表現するポスト mitotic 子孫蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えを介して分離でき後でダウン ストリーム アプリケーションの数で使用します。我々 はまた運命決定の側面を研究するため、または使用するためサブグループ濃縮介在から寄与する治療への応用に役立つ可能性があります (SST) 介在のサブグループ、パルブアルブミン (PV) またはソマトスタチンの豊かにするメソッドを提供します。移植。

このペーパーで説明したプロトコルの公開プロトコル15,16,17の修正版で、私たち Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP デュアル レポーター mESC ラインでの使用に最適化されています。DD0 ~ 5 DD8、再メッキと組み合わせる価格 939 wnt シグナル阻害剤を追加することにより前記の文化のすべての DAPI + 核の 50% 以上も Nkx2....

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Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

このプロトコルでは、変更された胚様体-単層法を用いたマウス胚性幹細胞から皮質介在ニューロン前駆細胞と後細胞分裂の介在ニューロン前駆体を生成するためのメソッドについて説明します。これらの前駆細胞/前駆体生体外で使用することができますまたは蛍光ソート運命決定を研究するため新生児大脳新皮質に移植や治療への応用で使用されます。

マウス胚性幹細胞の皮質介在ニューロン前駆細胞への分化

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-into-cortical-interneuron

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.3K ビュー.  University of Pennsylvania. このプロトコルでは、変更された胚様体-単層法を用いたマウス胚性幹細胞から皮質介在ニューロン前駆細胞と後細胞分裂の介在ニューロン前駆体を生成するためのメソッドについて説明します。これらの前駆細胞/前駆体生体外で使用することができますまたは蛍光ソート運命決定を研究するため新生児大脳新皮質に移植や治療への応用で使用され...

ビデオ: Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

Culture of Mouse Neural Stem Cell Precursors

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase our understanding of the nervous system and may allow us to develop treatments for currently incurable brain diseases and injuries. In addition, stem cells should be used for stem cell research aimed at the detailed study of mechanisms of neural differentiation and transdifferentiation and the genetic and environmental signals that direct the specialization of the cells into particular cell types.  This video demonstrates a technique used to disaggregate cells from the embryonic day 12.5 mouse dorsal forebrain. The dissection procedure includes harvesting E12.5 mouse embryos from the uterus, removing the "skin" with fine dissecting forceps and finally isolating pieces of cerebral cortex. Following the dissection, the tissue is digested and mechanically dissociated. The resuspended dissociated cells are then cultured in "stem cell" media that favors growth of neural stem cells.

This video describes the method used for isolation of neuroprecursors from the developing cortex of embryonic mice. The procedure for removing embryos from the uterus, dissecting the cortical tissue, and digesting the isolated cerebral cortex is shown.

マウス神経幹細胞の前駆体の文化

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase ...

生物学

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

無血清単層培養中のマウス胚性幹細胞の神経分化

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

発生生物学

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

マウス胚性幹細胞からの神経前駆細胞とニューロンの分化と特徴付け

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

オリゴデンドロサイト前駆体に胚性幹細胞の分化

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

運動ニューロンにマウス胚性幹細胞の効率的な分化

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

化学遺伝子解析で作られた皮質間ニューロン前駆体を早期産後マウス脳に移植

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

神経科学

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

インビトロにおけるマウス胚性幹細胞からの神経細胞分化

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Generating Cortical Interneuron Precursors From Mouse Embryonic Stem Cells

Source: Tischfield, D. J., et al <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/56358">Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video presents a method for generating cortical interneuron precursors from mouse embryonic stem cells. The protocol entails culturing the stem cells in media containing specific small molecule inhibitors, which facilitate stem cell proliferation and aggregation into embryoid bodies (EBs). Subsequently, the EBs are dissociated with enzymes and plated on culture plate wells coated with adhesion proteins to promote their differentiation into cortical interneuron precursors.

マウス胚性幹細胞からの皮質介在ニューロン前駆体の生成

1. Media Preparation
NOTE: Warm all media to 37 &#38;#176;C before use in cell culture.

	Mouse Embryonic Fibroblast (MEF) media (for preparing 500 mL)
	
	...

JoVE Encyclopedia of Experiments

神経細胞培養技術

高度な神経細胞モデル

A Technique for Generating Neural Progenitor Cells from Mouse Embryonic Stem Cells

Source: Mao, X., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/61190">Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a method for the in vitro generation of neural progenitor cells (NPCs) from mouse embryonic stem cells (mESCs). The mESCs are cultured in suspension to form embryoid bodies (EBs), which are then guided to differentiate into NPCs via retinoic acid treatment in an adherent culture.

マウス胚性幹細胞から神経前駆細胞を作製する技術

1. Mouse embryonic stem cell culture

	Prepare 0.1% gelatin coated cell culture dishes or plates.
	
		Add 2 mL of sterilized 0.1% gelatin (0.1% w/v in ...

Differentiating Mouse Embryonic Stem Cells into a Networked Neuron Population

Source: Hubbard, K. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/52361">Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates a technique for embryonic stem cell differentiation into a networked population of neurons with functioning synapses. It outlines the steps involved in embryonic stem cell differentiation into neurons, induction of neuronal network formation, and enrichment of the culture with networked neurons.

マウス胚性幹細胞のネットワーク化ニューロン集団への分化

1. Neuronal Differentiation
NOTE: Conduct steps 1.1 - 1.5 before noon and step 1.7 after noon. An overview of the differentiation procedures is presented ...