私たちはサンプルの痕跡とTin Ki Tsangの助けを借りて、絵の助けを借りてYe Zhangに感謝します。この研究は、レイ・トーマス・エドワーズの早期キャリア賞とC.-YSおよびNIHグラント（R01DC009597およびR01DK092640）のNIHグラント（R01DC015519）がJWW

1. at4記録用ハードウェアの準備<ol><li>ピペットプラー装置を使用して、アルミノシリケートガラスキャピラリー（OD 1.0mm、ID 0.64mm）で電極を調製する。ハエの頭蓋内への挿入を容易にするために、一対の細かい鉗子で参照電極の先端をわずかに鈍らせる（ すなわち 、ハエ頭の前部、口部の上の丸いプレート）。 注：7日齢のWT男性（ベルリン）をこの研究で使用した。両方の電極の電解質としてAHL生理食塩水14を使用する。 </li><li> NaCl 6.312グラム、塩化カリウムの0.373グラム、NaHCO 3を0.337グラム、のNaH 2 PO 4、トレハロースּ2 H 2 O、スクロース3.423グラムの1.892グラムの0.1120グラムを用いて、蒸留水900mlを混合することによってAHLの1 Lを調製1.192gのHEPES、および8.2mLの1M MgCl 2を入れた 。蒸留水を使用して、全容量を1 Lにする。1 N NaOHを使用してpHを7.4にし、溶液を滅菌する。真空駆動フィルターシステム。長期間保存するには、AHLアリコートを4℃に保ちます。 注：パルミトレイン酸の一貫したデリバリーは、カートリッジ間の均一性に左右されます。各カートリッジが再現可能な方法で組み立てられることが重要です。 </li><li>カミソリの刃を使用して、200μLのピペットチップの先端から0.9cmを取り除いて、4.1cmの第1のカートリッジセクションを作成する。 図1Aに詳述されている寸法を参照してください。別の200μLピペットチップを使用し、チップとベースからそれぞれ1.7cmと1.5cmを取り除いて、1.8cmの第2カートリッジセクションを作成します（ 図1A ）。再現性を保証するためにルーラーを使用してください。 </li><li>濾紙からディスクを切断するには、1/8 &quot;穴パンチャーを使用してください。 </li><li>鉗子を使用して、第2カートリッジセクションの先端に濾紙ディスクを置きます。空気が通過できる開口部がカートリッジの先端にあることを視覚的に確認する。 </li><li> 図1Aに示すように、第1と第2のカートリッジセクションを一緒に取り付けます 。第2のカートリッジ部分を下方に傾けて、準備を正方形にすることを容易にする（ 図1B ）。 </li><li>カートリッジをマイクロマニピュレーターに取り付けられた臭気送達チューブに接続します。 注記：この設計により、交換を容易にするためにカートリッジを外側に旋回させることができます（ 図1C ）。 </li><li> 1つの質量コントローラで一定の加湿空気流量を2 L /分に設定し、別の質量コントローラで付臭剤フローを500 mL /分に設定します。 </li><li>ソフトウェア（ 表の表を参照）を使用して、500 msの臭気パフを管理する手順をプログラムします。 </li></ol> 2.送達のためのパルミトレイン酸匂い溶液の調製注：Or47b ORNは、 シス及びトランスパルミトレイン酸の両方に応答する。パルミトレイン酸はRで不安定であるのでTは-20℃で貯蔵し、開封後1ヶ月以内に使用する。エタノールは、パルミトレイン酸のために選択される溶媒である。 <ol><li>ボルテックスミキサーを使用して、10μLのシスまたはトランス -パルミトレイン酸のストックまたは希釈液を、1.7mLのマイクロチューブで10倍連続希釈するために100μLのエタノール90μLと完全に混合する。実験前に毎日新鮮なパルミトレイン酸希釈液を調製し、1日以内に使用する。 注：エタノールに溶けないにおい物質の場合、他の種類の有機溶媒で臭い希釈液を調製するには、ガラスバイアルの使用を推奨します。 </li><li> P10マイクロピペットを用いて、所望の希釈液のシス -パルミトレイン酸溶液5μLを対応するカートリッジの濾紙に塗布する。 注：最高用量（10 -1 ）には450μgの化合物が含まれています。 トランス -パルミトール酸溶液の場合、最高用量（10 -1 ）に450μLのt彼は化合物。 </li><li>溶媒を完全に蒸発させるために、パルミトレイン酸カートリッジを真空デシケーター中に室温および圧力7.59mmHgで1時間置く。 注記：カートリッジはRTで4時間まで使用できます。 </li></ol> インビボ電気生理学的記録のためのat4センシラへの容易なアクセスのためのショウジョウバエの調製注：WTハエ（ベルリン）は、12：12の明暗サイクルで25℃で標準的なコナミール培地で飼育される。勃起すると、ハエは性別によって10のグループに分けられ、それによって7歳までグループに収容されます。オスとメスの両方でor47b ORNがパルミトレイン酸に応答する。簡単にするために、現在の研究では雄ハエのみを調べる。 <ol><li>フライ・プレップ・スライドを組み立てる：ガラス・スライド上にガラス・カバースリップ（18×18mm 2 ）を少量のモデリング・クレー上に置き、スライドガラスと約3°の角度をなす。内部Eに両面テープを置きますカバースリップとすぐ下のスライドの領域に表示されます。記録の毎日のために新鮮なテープで交換してください（ 図2A ）。 </li><li>フライアスピレーター15を使用してチュービングのフライを集め、チューブの端に200μLのピペットチップを取り付けます。同時にチューブを前方に軽く叩きながらチューブに空気を吹き込み、ピペットチップの端にフライを押します。かみそりの刃を使って、フライの身体のすぐ下と、フライの上の2頭の長さを切断します。 </li><li>アンテナとクライスが両方露出するまで、飛行を上に押して、モデリング粘土でピペットチップの底を塞ぎます（ 図2B ）。フライの腹部が潰れないように、飛行機を殺すのを避けるために、アンテナとアルスターを暴露するのに十分な粘土だけを加えてください。さらに、粘土をゆっくりと穏やかに加えて突然の狭窄を防ぐ。ハエが生きていることを確認するには、または頸動脈の動き。 </li><li>フライを収容するピペットチップを操作するために鉗子を使用してください。頭頂部が観察者の右を向くように頭を向ける。アンテナの側面がテーピングされたカバースリップの表面（ 図2B ）に当たるまで、細かいピンセットを使用してカバースリップに沿って準備を調整します。 </li><li>アンテナを両面テープに固定して動きを防止するために、支柱に支柱を置きます （ 図2B ）。 注記：保持ロッドはピペットプラーでホウケイ酸ガラスキャピラリーから引き出され、モデリング粘土で定位置に保持されます （ 図2A ）。 </li><li>リグのステージ上にプレパラートを置く（ 図2C ）。顕微鏡を使用して、トリコイドがアンテナの3番目のセグメントの遠位端に沿って見えることを確認します。 注：理想的には、sensillaはバックグラウンドに対して明確なシルエットを持つ必要があります。<html>記録を容易にします（ 図3 ）。この調製では、アクセス可能なトリコイド感受性物質の大部分はat4型である。 </li><li>先に図2 に 示す ように、15のように、分取から約2cmの距離（ 図4）からの別個の空気送達チューブを介して送達定数加湿空気流（2L /分）下で分取を保ちます。 </li></ol> 4.パルミトレイン酸に反応したat4トリコイド中のOr47b ORNからのat4感覚活性の記録<ol><li>参照電極を鞘に挿入する（ 図3A ）。組織の損傷を避けるために、電極が表面のすぐ下に挿入されていることを確認してください。電極がキューティクルの下の血リンパと接触できるようにしてください。 </li><li>ターゲット電極と同じ平面に入るまで記録電極をゆっくりと下げてください（= &quot;xfig&quot;&gt;図3B）。 50倍の対物レンズで記録します。 注記：タフタコイダルキューティクルは、記録電極を感知器ベースに挿入する必要があり、その広い領域は、電極が偏向される可能性を低減する大きなターゲットを提供する（ 図3B 、挿入図）。 </li><li> 感覚刺激に匂い刺激を加える前に、以下の選択基準を守ってください。これらの基準を満たしていないトリコイドは拒絶され、もう一つの感覚は選択されるべきである。 <ol><li>高い信号対雑音比（例として図3Cを参照）を観察してください。 </li><li> at4Aおよびat4Cニューロンからの同定可能なスパイクを観察する（ 図3C ）。 注意：注目すべきは、at4Bスパイク振幅はat4A 10と非常によく似ており、臭い刺激なしでは容易に同定できないことです。 </li><li> at4Aニューロンの基礎発火率は、約20Hz以下である。 注：この基準は、ニューロンの基礎発火率が基底ORNs 2のそれよりも高いため、at4Aに特有である。はるかに高い基礎発火は、ニューロンが電極挿入中に損傷を受けた可能性があることを示す。 </li></ol></li><li>カートリッジを付臭剤供給チューブに接続します。溶媒制御装置で始め、次に臭い物質を低濃度から高濃度にします。マイクロマニピュレーターを使用してカートリッジを準備の方向に動かし、カートリッジを準備の頭に正対して向ける。数ミリメートル離れたところからカートリッジがアンテナに直接向いていることを目視で確認します （ 図4 ）。 注：目的は、カートリッジの開口部をアンテナに直接向け、標的組織に近接して配置することです。 </li><li>付臭剤カートリッジが記録電極から右に1〜2 mm離れていることを確認してください。pを約1 mm下にスライドさせます。 注記：ここで説明する設定では、付臭剤カートリッジは、記録電極、参照電極、フライ・プレップ・スライド（ 図4 ）と密接に接しています。 注記：カートリッジと記録/参照電極間の距離に注意してください。約4 mmの距離をお勧めします1 。意図しない接触は、信号を終了させ、記録電極の先端を壊し、現在のニューロンに損傷を与え、さらなる記録を複雑にする可能性がある。 注記：カートリッジとフライ・プレップ・スライドとの距離を考慮してください。カバースリップに触れても記録電極がはずれて記録が中断されることがあります。 </li><li>記録を開始するには、データ収集ソフトウェアの &quot;Record&quot;を押します。 注：10秒ごとの録音ごとに、ステップ1.9で説明したように、500 msの単一臭いパルスがアンテナに直接送られます。 </li><li>ニオイ剤塗布後、次の濃度のカートリッジに交換する前にカートリッジを注意深く引き出してください。投与量の全範囲が得られるまで続ける。 注：適応の影響を避けるために、各フライから1つのOr47b ORNしか記録されないことが推奨される。 </li><li>記録電極を蒸留水で徹底的にすすいでください。 </li><li>市販のオフライン解析ソフトウェアを使用してデータを分析およびプロットする。 </li></ol>

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著者は何も開示することはない。

ここでは、Or47b ORNのパルミトレイン酸に対する応答を強く誘発し、記録することができる手順を記載した。我々は不十分フェロモン臭気物質の送達の問題を解決するために、従来の長距離臭気配信方法2、7、10を修正しました。臭気物質カートリッジを介して化合物を送達することにより、低い臭気物質の揮発性の問題に?...

<html> ショウジョウバエ ORNは、エステル、アルコール、ケトン、ラクトン、アルデヒド、テルペン、有機酸、アミン、硫黄化合物、複素環および芳香族化合物を含む広範な炭素鎖長および様々な官能基を有する膨大な数の匂い物質に反応する2 、 3 。それらの物理化学的特徴が異なる匂い物質は、化合物の蒸気圧によって示される顕著に異なる揮発性を有することができる。特に、 ショウジョウバエのメラノガスターの生物学的に関連する臭気物質は、そのボラティリティにおいて著しく異なる。例えば、Ir92a ORNは、20℃で6322Hgの蒸気圧で、非常に揮発性の高いアンモニア4に反応します。対照的に、Or67d ORN類は男性フェロモン、 シス -vaccenyl酢酸（C VA）5、6、20°Cで43 mmHgであるの蒸気圧に応答します。 低揮発性の匂い物質に対する嗅覚応答の研究は、匂い物質が比較的長い距離（ すなわち、数センチメートル）にわたって担体空気流を介して送達される従来の匂い送達方法では特に困難である。所定の低揮発性臭気物質に臭気デリバリーシステムの設計に依存して、大きく変化することができ、例えば、C VAの高用量にOr67d ORN類の報告された応答は、約40 7の範囲である- &gt; 200スパイク/秒6さらに、従来の送達方法とCの VAの無効送達がそうVA C単独ではOr67d ORN類8を活性化するのに十分ではないという解釈につながる、偽陰性の結果に起因する。この解釈は、後で使用する別の研究によりチャレンジしました近距離匂い送達方法9それゆえ、それはイペラ低揮発性の臭気物質を効果的に提示するための強力な臭気供給システムを開発しています。 最近、我々は、Or47b ORNのリガンドとしていくつかの長鎖クチクラ脂肪酸を同定した。彼らはタイプ4 Antennal Trichoid Sensillum（at4）に収容されています。長鎖脂肪酸臭気物質の中で、我々はOr47bのORN類1を活性化することにより、男性の求愛を促進媚薬フェロモンとしてそのパルミトレイン酸機能を発見しました。しかし、従来の臭気送達法を用いた別の研究では、ラウリン酸メチルはOr47b ORNからの応答を誘発することが示されたが、パルミトレイン酸は同じ距離から提示された場合に応答を示さなかった10 。 VA Cと比較して、長鎖脂肪酸は、25°C 11未満で0.001 mmHgの蒸気圧であっても低揮発性です。長鎖脂肪酸臭気物質の本質的に低い揮発性は、経由するアンテナへの効率的な提示を妨げる​​。従来の匂いデリバリーシステムは、偽陰性の結果である可能性が高い10 。この不一致は、低揮発性臭気物質を提示する際の従来の匂い供給システムの不備を強調する。フライクチクラの臭いの効果的な送達には、臭気源と標的組織との間の近接性が必要であることが以前に示された6 。このように、完全に彼らはおそらく、自然12、13でショウジョウバエが遭遇され、そこから距離を模倣しながら、生物学的に活性なフェロモンの効果を特徴づけるために、我々は、最小距離が私たちの手順に高い優先順位を与えられる必要があることに同意しました。 我々の方法は、標準的な電気生理学リグおよび技術との互換性を含むさらなる利点を保持する。既存のリグセットアップでは、このプロトコルに対応するために最小限の変更が必要です。ほとんどのSSR手順では、わずかな調整しか必要ありません。この我々の技術はSSRで経験された研究者に容易にアクセス可能にする。さらに、我々の技術は、神経応答と刺激伝達を相関させる、鋭い発症およびオフセットを伴う低揮発性臭気物質の提示を可能にする。最後に、ハードウェアレイアウトは、ニオイのカートリッジ間の迅速な交換を容易にし、所望の用量範囲にわたってデータ収集を迅速化する。 我々は、参照電極および記録電極、成人ヘムリンパ様（AHL）溶液、付臭剤送達カートリッジ、および対応する嗅覚器の調製を検討することから始める。次に、パルミトレイン酸臭気物質溶液の調製、その後の記録用フライの調製について議論する。我々は、この方法を使用して得られた代表的なデータを提示する前に、トリコイド感知物質を選択し、付臭剤カートリッジの位置をより詳細に記録するための基準を検討することに進む。最後に、このtechniqの有用なアプリケーションを調べることで結論づけますue、いくつかの遭遇した問題、およびその解決策。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Prep Setup &amp;amp; Miscellaneous Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette Puller Instrument&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments&lt;br/&gt; Novato CA USA</td><td>P97</td><td>Pipette Puller</td></tr><tr><td>Borosilicate Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments&lt;br/&gt; Sarasota FL USA</td><td>1B100F-4</td><td>to make holding rods</td></tr><tr><td>Aluminosilicate Glass Capillaries&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments&lt;br/&gt; Novato CA USA</td><td>AF100-64-10</td><td>to make electrodes</td></tr><tr><td>Superfrost Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific&lt;br/&gt; Pittsburgh PA USA</td><td>12-550-143</td><td>for fly-prep station</td></tr><tr><td>Permanent Double Sided Tape</td><td>Scotch&lt;br/&gt; St. Paul MN USA</td><td>NA</td><td>for fly-prep station</td></tr><tr><td>Upright microscope</td><td>Olympus&lt;br/&gt; Shinjuku Tokyo Japan</td><td>BX51</td><td>for recording rig</td></tr><tr><td>Plastalina modeling clay</td><td>Van Aken&lt;br/&gt; North Charleston SC USA</td><td>B0019QZMQQ</td><td>for prep station and to stablize the holding rod</td></tr><tr><td>Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm</td><td>Nalgene&lt;br/&gt; Rochester NY USA</td><td>#156-4045</td><td>to sterilize AHL solution</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cartridge Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L pipette tip&amp;nbsp;</td><td>VWR&lt;br/&gt; Radnor PA USA</td><td>53508-810</td><td>to make odor cartridges and fly prep</td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>Whatman&lt;br/&gt; Maidstone Kent UK</td><td>740-E</td><td>to make odor cartridges&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vacuum Desiccator&amp;nbsp;</td><td>Cole-Parmer&lt;br/&gt; Vernon Hills IL USA</td><td>VX-06514-30</td><td>to vaporize ethanol solvent</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Odorant Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cis-palmitoleic acid</td><td>Cayman Chemical&lt;br/&gt; Ann Arbor MI USA</td><td>#10009871 (CAS # 373-49-9)</td><td>Or47b odorant</td></tr><tr><td>trans-palmitoleic acid</td><td>Cayman Chemical&lt;br/&gt; Ann Arbor MI USA</td><td>#9001798 (CAS # 10030-73-6)</td><td>Or47b odorant</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Spectrum Chemical MFG.&amp;nbsp;&lt;br/&gt; New Brunswick NJ USA</td><td>E1028-500MLGL</td><td>to dilute palmitoleic acid&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Rig Setup Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odorant Cartridge Micromanipulator</td><td>Siskiyou&lt;br/&gt; Grants Pass OR USA</td><td>MX130R</td><td>to position the olfactometer</td></tr><tr><td>Flow Vision software&amp;nbsp;</td><td>Alicat&lt;br/&gt; Tuscon AZ USA</td><td>FLOWVISIONSC</td><td>software to control flow rate</td></tr><tr><td>Mass Controller</td><td>Alicat&lt;br/&gt; Tuscon AZ USA</td><td>MC-2SLPM-D</td><td>to control the flow rate for humidified air</td></tr><tr><td>Mass Controller</td><td>Alicat&lt;br/&gt; Tuscon AZ USA</td><td>MC-500SCCM-D</td><td>to control the flow rate for odor stimulation</td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Molecular Devices&lt;br/&gt; Sunnyvale CA USA</td><td>Ver. 10.4</td><td>Data acquisition software</td></tr><tr><td>Air delivery tube</td><td>Ace Glass&lt;br/&gt; Vineland NJ USA</td><td>8802-936&amp;nbsp;</td><td>to deliver humidified air</td></tr><tr><td>50X objective lens&amp;nbsp;</td><td>Olympus&lt;br/&gt; Shinjuku Tokyo Japan</td><td>LMPLFL50X</td><td>recording rig</td></tr><tr><td>Clampfit 10</td><td>Molecular Devices&lt;br/&gt; Sunnyvale CA USA</td><td>Ver. 10.4</td><td>software for spike analysis&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Igor Pro 6</td><td>WaveMetrics&lt;br/&gt; Lake Oswego OR USA</td><td>Ver. 6.37</td><td>software for data analysis&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Audio Monitor</td><td>ALA Scientific Instruments&lt;br/&gt; Farmingdale NY USA</td><td>NPIEXB-AUDIS-08B</td><td>Aurally reports individual spikes</td></tr><tr><td>Extracellular Amplifier</td><td>ALA Scientific Instruments&lt;br/&gt; Farmingdale NY USA</td><td>NPIEXT-02F</td><td>to increase the amplitude of electrical signals</td></tr><tr><td>Valve Controller</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>VC-8</td><td>to control the opening of the valve for odor stimulation</td></tr><tr><td>Recording Electrode Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments&lt;br/&gt; Novato CA USA</td><td>MP-285</td><td>to position recording electrode</td></tr><tr><td>Headstage Amplifier</td><td>ALA Scientific Instruments&lt;br/&gt; Farmingdale NY USA</td><td>EQ-16.0008</td><td>to increase the amplitude of electrical signals</td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix&lt;br/&gt; Beaverton OR USA</td><td>TDS2000C</td><td>Visual report of individual spikes</td></tr></tbody></table>

electrophysiological recording from drosophila trichoid sensilla in response to odorants of low volatility

昆虫は、食物探索、捕食者回避、産卵、交尾など、生存に不可欠な幅広い行動を導くために、嗅覚に頼っています。変化する揮発性の無数の化学物質は、昆虫の嗅覚受容器ニューロン（ORN）を活性化する天然臭気物質として同定されている。しかしながら、低揮発性臭気物質に対する嗅覚応答の研究は、従来の臭気伝達方法を用いてそのような刺激を効果的に提示することができないことによって妨げられてきた。ここでは、インビボ Single-Sensillum Recording（SSR）の低揮発性臭気物質の効果的な提示を可能にする手順を説明します。臭気源と標的組織との間の距離を最小にすることによって、この方法は、生物学的に顕著なのアプリケーションが、パルミトレイン酸、求愛と交尾行動1に関与ORN類で実証効果を有する刺激性フェロモンを含むこれまでアクセスできない着臭剤、を可能にします。従って、我々の手順は、昆虫嗅覚およびフェロモン通信の研究のための低揮発性臭気物質の宿主をアッセイする新しい手段を提供する。

我々の技術は、パルミトレイン酸のシス （ 図5B ）異性体対トランス （ 図5A ）の相対的有効性を決定するために首尾よく適用された。本発明者らの代表的なデータは、 トランス -パルミトレイン酸が、 シスアイソフォームと比較した場合、Or47b ORNのより有効なリガンドであることを実証する（ <...

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Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

このプロトコールの全体的な目標は、長鎖クチクラフェロモンに応答するショウジョウバエの嗅覚受容体ニューロンからの単一感覚記録のための低揮発性の付臭剤を提示する方法を示すことである。

からの電気生理学的記録<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;低揮発性の臭気物質に対するトリコイドセンシラ

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

electrophysiological-recording-from-drosophila-trichoid-sensilla

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

8.8K ビュー.  University of California San Diego. このプロトコールの全体的な目標は、長鎖クチクラフェロモンに応答するショウジョウバエの嗅覚受容体ニューロンからの単一感覚記録のための低揮発性の付臭剤を提示する方法を示すことである。 

ビデオ: Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

昆虫における単一感覚子録音キイロショウジョウバエとハマダラカ</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

神経科学

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

ショウジョウバエの幼虫の匂い駆動型の動作の高分解能測定

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

生物学

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

の臭気誘発応答のカルシウムイメージングショウジョウバエ触角葉

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the researcher to measure gustatory responses directly and quantitatively, reflecting the sensory input that the insect nervous system receives from taste stimuli in its environment. This protocol outlines all key steps in performing this technique. The critical steps in assembling an electrophysiology rig, such as selection of necessary equipment and a suitable environment for recording, are delineated. We also describe how to prepare for recording by making appropriate reference and recording electrodes, and tastant solutions. We describe in detail the method used for preparing the insect by insertion of a glass reference electrode into the fly in order to immobilize the proboscis. We show traces of the electrical impulses fired by taste neurons in response to a sugar and a bitter compound. Aspects of the protocol are technically challenging and we include an extensive description of some common technical challenges that may be encountered, such as lack of signal or excessive noise in the system, and potential solutions. The technique has limitations, such as the inability to deliver temporally complex stimuli, observe background firing immediately prior to stimulus delivery, or use water-insoluble taste compounds conveniently. Despite these limitations, this technique (including minor variations referenced in the protocol) is a standard, broadly accepted procedure for recording Drosophila neuronal responses to taste compounds.

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

This protocol describes extracellular recording of the action potential responses fired by labellar taste neurons in Drosophila.

から電気生理学的記録<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt; Labellar味感覚器

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

の生理反応を測定します<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ライブカルシウムイメージングを使用して脂質フェロモンの感覚ニューロン

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

免疫・感染学

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

臭気誘導挙動の高分解能定量<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;使用<em&gt; Flywalk</em&gt;パラダイム

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

の記録細胞内の電圧応答のための電気生理学的手法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;光刺激に感光体と介在ニューロン<em&gt;インビボ</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

のコンピュータ追跡することによってアッセイ嗅覚行動<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt; 4象限オルファクトメーターで

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

Single Sensillum Recordings for Locust Palp Sensilla Basiconica

The palps of locust mouthparts are considered to be conventional gustatory organs that play an important role in a locust&#39;s food selection, especially for the detection of non-volatile chemical cues through sensilla chaetica (previously named terminal sensilla or crested sensilla). There is now increasing evidence that these palps also have an olfactory function. An odorant receptor (LmigOR2) and an odorant-binding protein (LmigOBP1) have been localized in the neurons and accessory cells, respectively, in the sensilla basiconica of the palps. Single sensillum recording (SSR) is used for recording the responses of odorant receptor neurons, which is an effective method for screening active ligands on specific odorant receptors. SSR is used in functional studies of odorant receptors in palp sensilla. The structure of the sensilla basiconica located on the dome of the palps differs somewhat from the structure of those on the antennae. Therefore, when performing an SSR elicited by odorants, some specific advice may be helpful for obtaining optimum results. In this paper, a detailed and highly effective protocol for an SSR from insect palp sensilla basiconica is introduced.

This paper describes a detailed and highly effective protocol for single sensillum recordings from the sensilla basiconica on the palps of insect mouthparts.

イナゴ Palp 触角 Basiconica の単一ゴキブリ録音

The palps of locust mouthparts are considered to be conventional gustatory organs that play an important role in a locust&#39;s food selection, especially ...

昆虫の味覚ニューロン活動の強化された分析のための新しい方法

Base Recording: A Technique for Analyzing Responses of Taste Neurons in Drosophila

Insects taste the external world through taste hairs, or sensilla, that have pores at their tips. When a sensillum comes into contact with a potential food source, compounds from the food source enter through the pore and activate neurons within. For over 50 years, these responses have been recorded using a technique called tip recording. However, this method has major limitations, including the inability to measure neural activity before or after stimulus contact and the requirement for tastants to be soluble in aqueous solutions. We describe here a technique that we call base recording, which overcomes these limitations. Base recording allows the measurement of taste neuron activity before, during, and after the stimulus. Thus, it allows extensive analysis of OFF responses that occur after a taste stimulus. It can be used to study hydrophobic compounds such as long-chain pheromones that have very low solubility in water. In summary, base recording offers the advantages of single-sensillum electrophysiology as a means of measuring neuronal activity - high spatial and temporal resolution, without the need for genetic tools - and overcomes key limitations of the traditional tip recording technique.

著者スポットライト:化学受容の進歩 – 昆虫の匂い受容体からノンコーディングRNAまで

A rarely used method of electrophysiological recording, base recording, allows analysis of features of taste coding that cannot be examined by conventional recording methods. Base recording also allows the analysis of taste responses to hydrophobic stimuli that cannot be studied using traditional electrophysiological methods.

塩基記録:ショウジョウバエの味覚ニューロン応答解析技術

Insects taste the external world through taste hairs, or sensilla, that have pores at their tips. When a sensillum comes into contact with a potential ...

からの電気生理学的記録

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昆虫における単一感覚子録音キイロショウジョウバエとハマダラカ

ショウジョウバエの幼虫の匂い駆動型の動作の高分解能測定

の臭気誘発応答のカルシウムイメージングショウジョウバエ触角葉

から電気生理学的記録

の生理反応を測定します

臭気誘導挙動の高分解能定量

の記録細胞内の電圧応答のための電気生理学的手法

のコンピュータ追跡することによってアッセイ嗅覚行動

イナゴ Palp 触角 Basiconica の単一ゴキブリ録音

塩基記録:ショウジョウバエの味覚ニューロン応答解析技術