この作業によって支えられた公衆衛生サービスを健康の国民の協会 (T32 DA007097、R01AI096966、andUM1AI26617) から付与します。

1 です。 一日 1: 新鮮なティッシュの区分と主なインキュベーション <ol><li>使用メス小 (約 0.5 センチ幅 0.5 cm 背の高い) 部分に新しいティッシュをカットします。別にプランジャーを各組織を接着し、4% 低溶解アガロースの 3-5 mL の PBS に埋め込みます。ステッカーを使用して組織情報にプランジャーをラベルします。固めるため氷バケットにチルド ホルダーに入れています</li>。
	<li>ミクロトームとインストール ミクロトームと挿入ピストンにかみそりの刃は、200 μ m にセクションの厚さはティッシュ ミクロトーム風呂でマウント セットを有効にします</li>。
	<li>は、RNA を維持するために、潜在的なっぽいアプリケーション下流を許可する pbs 100 μ g/mL または 18.7 U/mL のヘパリンを追加してリン酸緩衝生理食塩水 (PBS H) とを準備します。埋め込まれた組織は、チルド、滅菌 PBS H の 100-120 mL をカバー、ミクロトーム風呂します。0 - で温度を維持するためにお風呂に PBS H アイス キューブを追加 2 ° c. の開始ミクロトームとカット 200 μ m のセクションに組織します 。
	注: 組織内で細胞の活動を最小限に抑えるため氷の上冷蔵組織を維持することが重要だ、新鮮な組織は、冷やされてセクションに簡単に。下流 ISH のための計画がない場合に単独で PBS を使用できます</li>。
	<li>(例えば 腸と肺)、ミクロトームでうまく切れない組織として細い短冊状に組織を切断するメスや剃刀の刃を使用して、または、200 μ m まで可能な限り近い</li>。
	<li>実験的サンプル情報 24 ウェル培養プレートの蓋のラベルし、対応する井戸における組織室を配置します。セクションを組織の商工会議所に転送するペイント ブラシ セット 1 mL を含む 24 ウェル培養プレートの井戸に使う冷蔵 PBS H. 
	注: 再利用可能な組織のチャンバーは染色を開始する前にすべきであります。組織 14 mL ポリプロピレン製丸底スナップ キャップ チューブを使用して行うことができ、ワイヤー メッシュ。14 mL ポリプロピレン製丸底スナップ キャップ チューブの下部を切断するのに鋭いかみそりの刃を使用します。管の下部にある穴に合わせて輪にワイヤー メッシュをカットします。熱赤熱するまでにブンゼン バーナーを使ってワイヤ メッシュ サークル。非常に迅速にワイヤー メッシュ丸を設定し、メッシュにチューブをプッシュします。ワイヤー メッシュをチューブの底にしっかりと接続するか、慎重に鋭いかみそりの刃を使用して、3 mL マーク チューブの上部を切断し、確認してください。各組織の商工会議所または最大 1 cm 2 あたりも組織の組織切片を最大 3 を置きます。交差汚染を避けるために異なる抗体併用井戸間少なくとも 1 つの空井戸を維持します</li>。
	プライマリ <li>進む四量体と抗体の組織の部屋にすべてカット セクションの転送を終えた後すぐに染色します。浸漬し、すべての回で 1 ml の PBS H 冷蔵セクションを維持します</li>。
	<li>インキュベート 0.5 μ G/ml の FITC 結合、ペプチド負荷の MHC と一晩ティッシュ セクション-私テトラマー 2% ヤギ血清 (NGS) で H PBS で希釈します。マウスまたはウサギ以外がこの培養に興味の細胞外の抗原に抗体が含まれます (例えば ラット抗 CD8 抗体希釈 2% PBS H でレバレッジ NGS)。各ウェルに 1 mL の希釈した抗体を配置します 。
	注: いくつかを強化することができ、T 細胞受容体 4 , 21 にバインド MHC テトラマーを抑制することがいくつか CD8 抗体を選択するときは、注意をすべき。ここで説明したラット抗 CD8 抗体は不安定なので、場合によってはやや弱い染色結果します。それは唯一の非-ウサギ、マウス非 CD8 抗体テストそのステンド グラス アカゲザル マカクザル CD8 T 細胞をラベル付けトリプル使用します</li>。
	<li>一次抗体とそれ以降のすべての孵化、ウェルあたり溶液 1 mL を使用し、このそのロッキング プラットフォーム上のプレートの 4 ° C ですべての後続孵化します 。
	注: 組織は、商工会議所で自由にフロートする必要があります</li>。
</ol> 2。2 日目: 固定および二次培養 <ol><li>主なインキュベーション後洗って 1 mL で 2 回 20 分冷やした PBS H 部各洗浄。組織の部屋を対応する井戸で冷やした PBS H の 1 mL を含む異なる 24 ウェル培養プレートに転送することによってこれを行うにします 。
	注: 組織の部屋間を移動するとき別のものに 1 つの実験試料から内容を流れないように気をつけてください。すべての後続の孵化および洗浄、同様に組織のチャンバーを適切なソリューションを含むきれいなプレートに転送します。節に立ち往生が組織の部屋の側面にしていないことを確認する手順の中に組織の部屋でセクションを監視しなければなりません。彼らは戻ってソリューションにそれらをプッシュ、場合</li>。
	<li>は、室温で 2 時間の新鮮な PBS バッファー 4% パラホルムアルデヒドの ml の 1 セクションを修正 (過剰修正しない)。5 分間 2 回冷 PBS h 洗浄 
	注意: パラホルムアルデヒドは有毒である;適切な保護具を着用します 。
	注: 抗原検索、透過は、細胞内の抗原を検出する必要がある場合抗原によって取得できますパラホルムアルデヒドの固定後 0.01 mol の尿素のセクションを沸騰します</li>。
	<li>は 0.01 mol の尿素を含む 24 ウェル培養皿にセクションを転送し、電子レンジでこれらのプレートを配置します。3 回約 10 のセクションを沸騰 s ごとに、合計 30 s. 
	注: 非常に注意して、沸騰としてソリューションは井戸の断面を強制的ことができます。このような場合かをプッシュするセクション組織チャンバーの側面からプレートの蓋から戻って適切な組織チャンバーの底に絵筆を使用します</li>。
	二次抗体の孵化する前に <li>を permeabilize し、ブロッキング溶液 2%、0.3% 洗剤 (PBS H T) PBS H にそれらをインキュベートしティッシュ セクションをブロック 4 ° C とその後抗体の孵化を実行で 1 時間ロッカーに NGSPBS-H-T/2% NGS</li>。
	<li>二次培養組織チャンバー内のセクションを PBS-H-T/2% NGS でウサギ抗 FITC 抗体希釈 1: 10,000 を含んでいる井戸に転送します。一晩インキュベートします</li>。
	<li>実行 counterstaining を用いたマウス抗 CD20 抗体希釈 1: 200 PBS-H-T/2% NGS で。必要なら、このオプションのエピトープを取得、細胞に浸透、前述のようにこの培養する前にブロックします</li>。
</ol> 3。3 日目: 第三紀インキュベーション <li>2 番目の培養後 3 回、少なくとも 20 分のための 4 ° C で PBS H 内のセクションを洗う</li> <ol>
	<li>は、蛍光標識抗体 (例えば ヤギ抗うさぎ共役の緑がかった黄色、ヤギ抗ラット共役遠赤色染料、およびヤギ抗マウス共役緑色素抗体希釈 1:5, 000、適切な最終的なインキュベーションを実行します。1:5, 000 と 1:2, 000 PBS-H-T/2% NGS でそれぞれ)。一晩インキュベートします 。
	注: この時点で、孵化の延長が可能 3 日間必要な場合。このインキュ中にスズ箔のプレートをラップすることによって光から保護されたセクションを維持します。マリファナのステップとその後、光消光 fluorophores</li>。
</ol> 4。4 日目: マウント セクション <ol><li>洗浄セクション 3 回で少なくとも 20 分 PBS h 
	注: 下流っぽい 19 の計画、テトラマーと場所で抗体を確保し 5 分 PBS H で二回セクションを洗う 1 h の 4% のパラホルムアルデヒドのセクションを修正します 。
	注意: パラホルムアルデヒドは有毒である;適切な保護具を着用します</li>。
	<li>は、顕微鏡のスライドにセクションを転送するのに絵筆を使用します。あまりにも多くの組織を突くをつけてください。グリセリン/ゼラチン 4 mg/mL n-プロピルガ レートまたは fluorophore 防腐剤が含まれている別のマウント媒体含むで各セクションをコートします。観察でカバーします</li>。
	<li>-20 の光保護スライド容器でスライドを保存する ° c. 組織培養プレートを洗浄し、アルコールを使用して蓋のラベルを削除します 。
	注: プレートは再利用することができます</li>。
</ol> 5。共焦点顕微鏡画像の取得 <ol><li>( 図 1 a と B) 各 fluorophore の適切なレーザーとフィルターを使用して、共焦点顕微鏡を用いた高解像度画像をキャプチャします 。
	注: この例では、共焦点顕微鏡が使用された (材料の表 を参照してください)。画像は、緑がかった黄色標識抗原特異的 T 細胞、グリーン ラベルの CD20 を表現する B 細胞の 10% の電力で 488 nm レーザーまで赤札 CD8 T 細胞の 15% の電力で 640 nm レーザーの 20% の電力で 561 nm のレーザーを使用して収集されました。客観的かつ開口 0.8 X 20 が使用された</li>。
	<li>は、順番に複数の 800 x 800 ピクセル フィールドで 3 つのチャンネルで z-シリーズ 3 μ m (または他の) 間隔を収集します。収集されたフィールドのモンタージュを作成 ( 図 1 -E)。対応するスライドの情報に基づいて各モンタージュ画像を名前を付けて解析します</li>。
	<li>それぞれの共焦点顕微鏡分析・数量化ソフトウェアを使用してまたは ImageJ を用いた定量的画像解析を実行します</li>。
</ol> 6。定量的画像解析 注: 共焦点の顕微鏡分析・数量化ソフトウェアを使用して、定量的画像解析を行うことができますまたは ImageJ ソフトウェアを使用しています。ここでは、ImageJ は例として使用された。
ImageJ の] ウィンドウ ( 図 2 a) にドラッグすることによって <ol><li>オープン共にモンタージュ 。
	注: ImageJ 直接多くの異なる共焦点顕微鏡によって収集されたモンタージュを開くことができます。モンタージュは、ImageJ で直接開くことができません、それを開くには TIFF ファイルとしてエクスポートして選択した z スキャン</li>
	<li>分析のため選択した z スキャンを複製 (&#34; 画像 &#34;-&#62; &#34; を複製する &#34;) ( 図 2 b).</li>
	<li>別のチャンネルに分割 (&#34; 画像 &#34;-&#62; &#34; 色 &#34;-&#62; &#34; チャンネルの分割 &#34;) ( 図 2).</li>
	<li>と押すことによって ROI マネージャーに追加対応するチャネルでの定量分析のための投資収益率の描画 &#34; T &#34; キーボード上。面積を測定します 。
	注: ImageJ の ROI マネージャー μ m 2 ( 図 2 D) の領域を示しています</li>。
	<li>蛍光明るさと分析するチャンネルのコントラスト調整 (&#34; 画像 &#34;-&#62; &#34; 調整 &#34;-&#62; &#34; 明るさ/コントラスト &#34;) ( 図 2 e).</li>
	<li>画像の ROI を平らにする (&#34; ROI マネージャー &#34;-&#62; &#34; フラット &#34;) ( 図 2 f).</li>
	<li>画像で陽性細胞を定量化、&#34; 多点 &#34; ツール ( 図 2).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li><li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+Class+II+tetramers+identify+peptide-specific+human+CD4(+)+T+cells+proliferating+in+response+to+influenza+A+antigen.">MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen.</a> J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).</li><li>Steinert, E. 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IHC と組み合わせて IST は、検出、特性評価、および他の細胞や組織構造のコンテキストでネイティブ環境での抗原特異的 CD8 T 細胞の定量化のために不可欠なツールを提供します。ここでは、イストの IHC、定量的画像解析に続いての場所、豊富とアカゲザルからリンパ節における抗原特異的 CD8 T 細胞の表現型を決定するために結合用の詳細な手順を説明します。ヒトに応用マウス、またはど?...

T 細胞の検出やウイルス感染細胞を排除すること、自己免疫疾患を防止する抗体と検出し、がん細胞を排除する B 細胞や形質細胞の生産の支援など、多くの免疫学的プロセスに重要です。ペプチド/MHC のクラス I のテトラマー CD8 T 細胞の抗原特異的染色1と MHC クラス II 四量体染色の CD4 T 細胞2のフローサイトメトリーによる最近の開発研究し、理解する当社の能力に革命をもたらしました、T 細胞の免疫生物学。量と抗原特異的 T 細胞の表現型を決定する非常に便利ですが、他の細胞や組織、現在構造に抗原特異的 T 細胞の空間定位の検出でフローサイトメトリーは、します。T 細胞を抽出する分解テクニック必要フローサイトメトリー限られている非リンパ系組織3で有効性。
私たちと他の人は私とクラス II 四量体や多量体試薬ペプチド負荷 MHC のクラスを使用して組織4,5,6,7,抗原特異的 CD8 および CD4 T 細胞を染色する方法を開発しました。8,9,10,11,12,13。 これら IST メソッドの場所、豊富、と組織における抗原特異的 CD8 と CD4 T 細胞の表現型の定量を可能にすると、他の細胞や組織の構造を基準にしてこれらの細胞を検出する手段を提供します。当社グループは、広く MHC を使用います-私四量体でひと免疫不全ウイルス (HIV) - とサル免疫不全ウイルス (SIV) - 染色 HIV と SIV の免疫病態の理解を得るためにリンパ、生殖器、直腸の組織における特定の CD8 T 細胞成功した予防接種戦略14,15,16,17の関連要因を識別します。さらに、組織と生体内でエフェクタ-ターゲット レベルを決定する我々 はもイストを組み合わせたものの in situハイブリダイゼーション (っぽい) をローカライズし、ウイルス特異的 cd8 陽性 T 細胞、ウイルス感染細胞を定量化する技術を開発しました。18,19。
ここでは、用いたペプチド負荷プロトコルについて述べる-私テトラマー IHC を使用して対比染色組織に新鮮な組織切片の抗原特異的 CD8 T 細胞を染色して特定の組織コンパートメントにおける特定の表現型と細胞を定量化します。これらの手順は、李ら、慢性 SIV 感染サル20時、場所、豊富とリンパ組織における SIV 特異的 T 細胞の表現型を決定私たちによる私たちの最近の出版物で使用されたと同じです。
この手順では、新鮮な組織を断面し、ペプチド負荷 MHC で夜通し孵化-私テトラマー共役フルオレセイン チオシアン酸分子 (FITC)。彼らは、パラホルムアルデヒドで固定されます。組織を固定した後は、ウサギ抗 FITC 抗体を使用し、さらにバインドされたテトラマーからの信号を増幅、蛍光タグの抗うさぎ IgG 抗体とインキュベート MHC テトラマーからの信号は増幅されます。IHC は、抗原特異的 T 細胞と周囲の細胞を特徴付ける IST と組み合わせて使用です。細胞外空間、細胞表面上のエピトープを認識する抗体は、テトラマーとプライマリの孵化に含まれます。細胞エピトープを認識する抗体染色前に細胞壁の透過性が必要です。染色組織切片を共焦点顕微鏡を用いたイメージングが行い共焦点ソフトウェアを使用しています。ラベル付きセルは、共焦点顕微鏡によるソフトウェアや ImageJ を用いた定量化しました。どの MHC の本質的に抗原特異的 CD8 T の任意のセルの任意の組織を染色する記述のプロトコルを使用できます-私テトラマーがあります。

<table><tbody><tr><td>MHC-I monomer</td><td>NIH tetramer core facility</td><td></td><td>Materials for MHC-tetramer preparation</td></tr><tr><td>ExtrAvidin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2716</td><td>Materials for MHC-tetramer preparation</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBL6391V</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6878</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>J.T.Baker</td><td>4204-05</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBH2672V</td><td></td></tr><tr><td>n-propyl gallate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>rat-a-h-CD8 (1:500)</td><td>Acris</td><td>0714</td><td>Antibody unstable, use single use frozen aliquot</td></tr><tr><td>m-a-h-CD20 (1:500)</td><td>NOVOCASTRA</td><td>6026819</td><td></td></tr><tr><td>m-a-h-Ki67 (1:500)</td><td>Vector</td><td>6022201</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-m-A488 (1:2,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>124083</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rb-Cy3 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>106232</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-rat-Cy5 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>118088</td><td></td></tr><tr><td>goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>86579</td><td></td></tr><tr><td>Compresstome: VF-300 Microtome</td><td>Precisionary Instruments, LLC</td><td>1079</td><td></td></tr><tr><td>Quick Set Instant Adhesive</td><td>Loctite</td><td>46551</td><td></td></tr><tr><td>24-well flat bottomed tissue culture plates</td><td>Falcon</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Globe scienfitic Inc.</td><td>#1321</td><td></td></tr><tr><td>Razor&amp;nbsp; blade</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Feather Disposable Scalpel</td><td>FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.</td><td>No. 21</td><td></td></tr><tr><td>Round paintbrush #2</td><td>PRINCETON ART &amp;amp; BRUSH CO.</td><td>4350R</td><td>Can trim as needed with razor</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>FV10-ASW_Viewer4.0</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in situ mhc-tetramer staining and quantitative analysis to determine the location, abundance, and phenotype of antigen-specific cd8 t cells in tissues

T 細胞の検出やウイルス感染細胞を排除すること、自己免疫疾患を防止する抗体と検出し、がん細胞を排除する B 細胞や形質細胞の生産の支援など、多くの免疫学的プロセスに重要です。フローサイトメトリーで分析した抗原特異的 T 細胞の MHC テトラマー染色の開発研究し、T 細胞の免疫生物学を理解する当社の能力をもたらしました。フローサイトメトリーは、抗原特異的 T 細胞を他の細胞や組織、および現在の分解技術の構造の空間定位を判断できない量と抗原特異的 T 細胞の表現型を決定する非常に便利ですが、T を抽出するセル必要とフローサイトメトリー限られている非リンパ系組織の有効性。その場でMHC テトラマー染色 (IST) は、組織の興味の抗原のために特定が T 細胞を可視化する手法です。免疫組織染色 (IHC) と組み合わせて、IST は、豊かさ、場所、および組織における抗原特異的 CD8 と CD4 T 細胞の表現型を決定できます。ここでは、染色し、特定の組織のコンパートメント内にある特定の表現型を持つ抗原特異的 CD8 T 細胞を列挙するプロトコルについて述べる.これらの手順は、李ら、権利によって我々 の最近の出版物で使用した同じ「卵胞は CD8 によって抑制されます部分的にサル免疫不全ウイルス産生細胞細胞の+ In Vivo。」説明する方法は、彼らは、表現型のローカライズに使用することができ、本質的に、抗原特異的 CD8 T 細胞 MHC テトラマーは任意の組織で利用可能なを定量化に広範に適用されます。

図 1は、共焦点顕微鏡を用いた共焦点画像を収集する方法を示します。図 2は、ImageJ を用いた定量的画像解析を示しています。図 3と4 SIV からリンパ節組織の画像感染アカゲザル MHC テトラマー、CD8 抗体、CD20 抗体で染色代表を示すし、MHC テトラマー染色の特異性を示すためになります。<strong class=...

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In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

ここでは、免疫組織化学的局在、表現型、組織における抗原特異的 T 細胞の量を決定するとその場でMHC テトラマー染色を組み合わせた手法について述べる。このプロトコルは、他のセルの種類および組織の構造を基準にして抗原特異的 CD8 T 細胞の表現型特性を決定する使用です。

その場でMHC テトラマー染色と場所、豊富と組織における抗原特異的 cd8 陽性 T 細胞の表現型を決定するための定量解析

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

in-situ-mhc-tetramer-staining-quantitative-analysis-to-determine

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

12.2K ビュー.  University of Minnesota. ここでは、免疫組織化学的局在、表現型、組織における抗原特異的 T 細胞の量を決定するとその場でMHC テトラマー染色を組み合わせた手法について述べる。このプロトコルは、他のセルの種類および組織の構造を基準にして抗原特異的 CD8 T 細胞の表現型特性を決定する使用です。

ビデオ: In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it is now well established that the immune infiltrate in human tumors can correlate with prognosis and response to therapy. The analysis of the immune infiltrate in the tumor microenvironment has become a major challenge for the classification of patients and the response to treatment.
The co-expression of inhibitory receptors such as Program Cell Death Protein 1 (PD1; also known as CD279), Cytotoxic T Lymphocyte Associated Protein 4 (CTLA-4), T-Cell Immunoglobulin and Mucin Containing Protein-3 (Tim-3; also known as CD366), and Lymphocyte Activation Gene 3 (Lag-3; also known as CD223), is a hallmark of T cell exhaustion. We developed a multiparametric in situ immunofluorescence staining to identify and quantify at the cellular level the co-expression of these inhibitory receptors. On a retrospective series of frozen tissue of renal cell carcinomas (RCC), using a fluorescence multispectral imaging technology coupled with an image analysis software, it was found that co-expression of PD-1 and Tim-3 on tumor infiltrating CD8+ T cells is correlated with a poor prognosis in RCC. To our knowledge, this represents the first study demonstrating that this automated multiplex in situ technology may have some clinical relevance.

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Studying tumor microenvironment may identify prognostic or predictive biomarkers of clinical response to immunotherapy. Presented here, is an innovative method based on in situ fluorescence multispectral imaging to analyze and count automatically various subpopulations of CD8+ T cells. This reproducible and reliable technique is suitable for large cohort analyses.

多重蛍光分析・数量化腫瘍 PD 1+ティム-3+ CD8 の+ T 細胞

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it ...

がん研究

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an ability to identify T cells based on their T cell antigen receptor (TCR) specificity. Many indirect methods are available in which a bulk population of T cells is stimulated in vitro with a specific antigen and epitope-specific T cells are identified through the measurement of a functional response such as proliferation, cytokine production, or expression of activation markers1. However, these methods only identify epitope-specific T cells exhibiting one of many possible functions, and they are not sensitive enough to detect epitope-specific T cells at naive precursor frequencies. A popular alternative is the TCR transgenic adoptive transfer model, in which monoclonal T cells from a TCR transgenic mouse are seeded into histocompatible hosts to create a large precursor population of epitope-specific T cells that can be easily tracked with the use of a congenic marker antibody2,3. While powerful, this method suffers from experimental artifacts associated with the unphysiological frequency of T cells with specificity for a single epitope4,5. Moreover, this system cannot be used to investigate the functional heterogeneity of epitope-specific T cell clones within a polyclonal population.
	The ideal way to study adaptive immunity should involve the direct detection of epitope-specific T cells from the endogenous T cell repertoire using a method that distinguishes TCR specificity solely by its binding to cognate peptide:MHC (pMHC) complexes. The use of pMHC tetramers and flow cytometry accomplishes this6, but is limited to the detection of high frequency populations of epitope-specific T cells only found following antigen-induced clonal expansion. In this protocol, we describe a method that coordinates the use of pMHC tetramers and magnetic cell enrichment technology to enable detection of extremely low frequency epitope-specific T cells from mouse lymphoid tissues3,7. With this technique, one can comprehensively track entire epitope-specific populations of endogenous T cells in mice at all stages of the immune response.

This protocol describes the use of peptide:MHC tetramers and magnetic microbeads to isolate low frequency populations of epitope-specific T cells and analyze them by flow cytometry. This method enables the direct study of endogenous T cell populations of interest from in vivo experimental systems.

ペプチドエピトープ特異的T細胞のMHCテトラマーベースの濃縮

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

免疫・感染学

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method relies on the highly specific interaction between peptide loaded MHC and the corresponding T-cell receptor.  While the affinity of a single MHC/peptide molecule is low, cross-linking MHC/peptide complexes with streptavidin increases the avidity of the interaction, enabling their use as staining reagents.  Because of the relatively low frequencies of CD4+ T cells (~1 in 300,000 for a single specificity) this assay utilizes an in vitro amplification step to increase its threshold of detection.  Mononuclear cells are purified from peripheral blood by Ficoll underlay.  CD4+ cells are then separated by negative selection using biotinylated antibody cocktail and anti-biotin labeled magnetic beads.  Using adherent cells from the CD4- cell fraction as antigen presenting cells, CD4+ T cells are expanded in media by adding an antigenic peptide and IL-2.  The expanded cells are stained with the corresponding class II tetramer by incubating at 37 C for one hour and subsequently stained using surface antibodies such as anti-CD4, anti-CD3, and anti-CD25.  After labeling, the cells can be directly analyzed by flow cytometry.  The tetramer positive cells typically form a distinct population among the expanded CD4+ cells.  Tetramer positive cells are usually CD25+ and often CD4 high.  Because the level of background tetramer staining can vary, positive staining results should always be compared to the staining of the same cells with an irrelevant tetramer.  Multiple variations of this basic assay are possible.  Tetramer positive cells may be sorted for further phenotypic analysis, inclusion in ELISPOT or proliferation assays, or other secondary assays.  Several groups have also demonstrated co-staining using tetramers and either anti-cytokine or anti-FoxP3 antibodies.  

This procedure demonstrates the purification and in vitro expansion of antigen specific CD4+ T cells from whole peripheral blood and their visualization using MHC class II tetramers. Tetramers permit the direct visualization of T cells with a single antigen specificity and defined MHC class II restriction.

抗原特異的CD4 + T細胞はMHCクラスIIテトラマーを用いての可視化

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

生物学

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in eradicating cancerous cells. However, the origins and replenishment of tumor antigen-specific CD8+ T cells within the tumor microenvironment (TME) remain obscure. This protocol employs the B16F10-OVA melanoma cell line, which stably expresses the surrogate neoantigen, ovalbumin (OVA), and TCR transgenic OT-I mice, in which over 90% of CD8+ T cells specifically recognize the OVA-derived peptide OVA257-264 (SIINFEKL) bound to the class I major histocompatibility complex (MHC) molecule H2-Kb. These features enable the study of antigen-specific T cell responses during tumorigenesis.
Combining this model with tumor transplantation surgery, tumor tissues from donors were transplanted into tumor-matched syngeneic recipient mice to precisely trace the influx of recipient-derived immune cells into transplanted donor tissues, allowing the analysis of the immune responses of tumor-inherent and periphery-originated antigen-specific CD8+ T cells. A dynamic transition was found to occur between these two populations. Collectively, this experimental design has provided another approach to precisely investigate the immune responses of CD8+ T cells in TME, which will shed new light on tumor immunology.

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Here, we present a tumor transplantation protocol for the characterization of tumor-inherent and periphery-derived tumor-infiltrated lymphocytes in a mouse tumor model. Specific tracing of the influx of recipient-derived immune cells with flow cytometry reveals the dynamics of the phenotypic and functional changes of these cells during antitumor immune responses.

マウスにおける腫瘍浸潤CD8+ T細胞の動態を評価するための腫瘍移植

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

主要組織適合遺伝子複合体クラスII Dextramersを用いて脳および心臓において自己反応性CD4 T細胞のその場検出に

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in determining outcomes that range from clearance to chronic persistent infections. We describe here a method for assessing the spatial and quantitative relationships between immune effector (E) virus-specific CD8+ T cells and infected targets (T) that combines in situ tetramer (IST) staining to detect virus-specific CD8+ T cells and in situ hybridization (ISH) to detect viral-RNA+ cells in the tissues where the battle between immune defenses and infection takes place. The combination of IST staining and ISH, abbreviated ISTH, enables visualization and mapping of the locations of immune effector cells and targets, and facile determination of E:T ratios.  These parameters in turn can then be used to determine the relationships between spatial proximity, and the timing and magnitude of the immune response that predict outcomes in early infection.

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A technique combining in situ tetramer staining and in situ hybridization (ISTH) enables visualization, mapping and analysis of the spatial proximity of virus-specific CD8+ T cells to their virus-infected targets, and determination of the quantitative relationships between these immune effectors and targets to infection outcomes.

同時にウイルス特異的CD8 + T細胞やウイルス感染細胞を可視化するテクニックその場で</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

ナノ粒子ワクチン接種後の抗原特異的CD8 + T細胞応答の分析のための全動物イメージングとフローサイトメトリー技術

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents directly bind to T-cell receptors on the surface of CD8+ T-lymphocytes, fluorochrome-labeled pMHC-I tetramers enable the accurate detection of antigen (Ag)-specific CD8+ T-cells without the need for in vitro re-stimulation. Moreover, when combined with multi-color flow cytometry, pMHC-I tetramer staining can reveal key aspects of Ag-specific CD8+ T-cells, including differentiation stage, memory phenotype, and activation status. These types of analyses have been especially useful in the field of HIV immunology where CD8+ T-cells can affect progression to AIDS. Experimental infection of rhesus macaques with simian immunodeficiency virus (SIV) provides an invaluable tool to study cellular immunity against the AIDS virus. As a result, considerable progress has been made in defining and characterizing T-cell responses in this animal model. Here we present an optimized protocol for enumerating SIV-specific CD8+ T-cells in rhesus macaques by pMHC-I tetramer staining. Our assay permits the simultaneous quantification and memory phenotyping of two pMHC-I tetramer+ CD8+ T-cell populations per test, which might be useful for tracking SIV-specific CD8+ T-cell responses generated by vaccination or SIV infection. Considering the relevance of nonhuman primates in biomedical research, this methodology is applicable for studying CD8+ T-cell responses in multiple disease settings.

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Here, we present an optimized protocol for enumerating and characterizing rhesus macaque CD8+ T cells against the AIDS virus. This article is useful not only to the field of HIV immunology, but also to other areas of biomedical research where CD8+ T cell responses are known to affect disease outcome.

サル免疫不全ウイルス特異的CD8の分析<sup&gt; +</sup&gt;ペプチドMHC-I四量体染色によりアカゲザルにおけるT細胞

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of pathogens. Therefore, the frequency of antigen-specific CTLs is indicative of the strength of the T cell response against a specific antigen. Such analysis is important in basic immunology, vaccine development, cancer immunobiology and the adaptive immunology. In the vaccine field, the CTL response directed against components of a viral vector co-determines how effective the generation of antigen-specific cells against the antigen of interest (i.e., transgene) is. Antigen-specific CTLs can either be detected by stimulation with specific peptides followed by intracellular cytokine staining or by the direct staining of antigen-specific T cell receptors (TCRs) and analysis by flow cytometry. The first method is rather time-consuming since it requires sacrificing of animals to isolate cells from organs. Also, it requires isolation of blood from small animals which is difficult to perform. The latter method is rather fast, can be easily done with small amounts of blood and is not dependent on specific effector functions, such as cytolytic activity. MHC tetramers are an ideal tool to detect antigen-specific TCRs.
Here, we describe a protocol to simultaneously detect antigen-specific CTLs for the immunodominant peptides of the viral vector VSV-GP (LCMV-GP, VSV-NP) and transgenes (OVA, HPV 16 E7, eGFP) by MHC I tetramer staining and flow cytometry. Staining is possible either directly from blood or from single cell suspensions of organs, such as spleen. Blood or single cell suspensions of organs are incubated with tetramers. After staining with antibodies against CD3 and CD8, antigen-specific CTLs are quantified by flow cytometry. Optionally, antibodies against CD43, CD44, CD62L or others can be included to determine the activation status of antigen-specific CD8+T cells and to discriminate between na&#239;ve and effector cells.

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Here, we present a protocol for the ex vivo qualitative detection of antigen-specific CD8+ T cells. Analysis is possible with single cell suspensions from organs or from small amounts of blood. A broad range of studies require the analysis of cytotoxic T cell responses (vaccination and cancer immunotherapy studies).

反ベクトルと反遺伝子特定 CD8 の同時定量+ T はマイク ウイルスベクターを用いたワクチン後染色テトラマー MHC を介して細胞

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of ...

マウス肺における抗原特異的T細胞の単離と特性評価

Identification of Rare Antigen-Specific T Cells from Mouse Lungs with Peptide:Major Histocompatibility Complex Tetramers

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune pathophysiology. The technical challenges of tracking antigen-specific T cell populations within the endogenous T cell repertoire have been greatly advanced by the development of peptide:MHC tetramer reagents. These fluorescently labeled soluble multimers of MHC class I or class II molecules complexed to antigenic peptide epitopes bind directly to T cells with corresponding T cell receptor (TCR) specificity and can, therefore, identify antigen-specific T cell populations in their native state without a requirement for a functional response induced by ex vivo stimulation. For exceedingly rare populations, tetramer-bound T cells can be magnetically enriched to increase the sensitivity and reliability of detection.
As the investigation of tissue-resident T cell immunity deepens, there is a pressing need to identify antigen-specific T cells that traffic to and reside in nonlymphoid tissues. In this protocol, we present a detailed set of instructions for the isolation and characterization of antigen-specific T cells present within mouse lungs. This involves the isolation of T cells from digested lung tissue followed by a general T cell magnetic enrichment step and tetramer staining for flow cytometry analysis and sorting. The steps highlighted in this protocol utilize common techniques and readily available reagents, making it accessible for nearly any researcher engaged in mouse T cell immunology, and are highly adaptable for a variety of downstream analyses of any low frequency antigen-specific T cell population residing within the lungs.

著者スポットライト:Optimized Protocol for Detecting Antigen-Specific T cells in Mouse Lungs Using Tetramers(テトラマーを用いたマウス肺の抗原特異的T細胞検出のための最適化されたプロトコール)

We provide a detailed protocol for isolating and identifying rare antigen-specific T cell populations in mouse lungs through magnetic bead-based T cell enrichment and peptide:major histocompatibility complex (MHC) tetramers.

ペプチド:主要組織適合遺伝子複合体四量体を用いたマウス肺由来の希少抗原特異的T細胞の同定

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune ...

その場でMHC テトラマー染色と場所、豊富と組織における抗原特異的 cd8 陽性 T 細胞の表現型を決定するための定量解析

要約

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多重蛍光分析・数量化腫瘍 PD 1⁺ティム-3⁺ CD8 の⁺ T 細胞

ペプチドエピトープ特異的T細胞のMHCテトラマーベースの濃縮

抗原特異的CD4 + T細胞はMHCクラスIIテトラマーを用いての可視化

マウスにおける腫瘍浸潤CD8⁺ T細胞の動態を評価するための腫瘍移植

主要組織適合遺伝子複合体クラスII Dextramersを用いて脳および心臓において自己反応性CD4 T細胞のその場検出に

同時にウイルス特異的CD8 + T細胞やウイルス感染細胞を可視化するテクニックその場で

ナノ粒子ワクチン接種後の抗原特異的CD8 + T細胞応答の分析のための全動物イメージングとフローサイトメトリー技術

サル免疫不全ウイルス特異的CD8の分析

反ベクトルと反遺伝子特定 CD8 の同時定量⁺ T はマイクウイルスベクターを用いたワクチン後染色テトラマー MHC を介して細胞

ペプチド:主要組織適合遺伝子複合体四量体を用いたマウス肺由来の希少抗原特異的T細胞の同定

その場でMHC テトラマー染色と場所、豊富と組織における抗原特異的 cd8 陽性 T 細胞の表現型を決定するための定量解析

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多重蛍光分析・数量化腫瘍 PD 1+ティム-3+ CD8 の+ T 細胞

ペプチドエピトープ特異的T細胞のMHCテトラマーベースの濃縮

抗原特異的CD4 + T細胞はMHCクラスIIテトラマーを用いての可視化

マウスにおける腫瘍浸潤CD8+ T細胞の動態を評価するための腫瘍移植

主要組織適合遺伝子複合体クラスII Dextramersを用いて脳および心臓において自己反応性CD4 T細胞のその場検出に

同時にウイルス特異的CD8 + T細胞やウイルス感染細胞を可視化するテクニックその場で

ナノ粒子ワクチン接種後の抗原特異的CD8 + T細胞応答の分析のための全動物イメージングとフローサイトメトリー技術

サル免疫不全ウイルス特異的CD8の分析

反ベクトルと反遺伝子特定 CD8 の同時定量+ T はマイク ウイルスベクターを用いたワクチン後染色テトラマー MHC を介して細胞

ペプチド:主要組織適合遺伝子複合体四量体を用いたマウス肺由来の希少抗原特異的T細胞の同定

多重蛍光分析・数量化腫瘍 PD 1⁺ティム-3⁺ CD8 の⁺ T 細胞

マウスにおける腫瘍浸潤CD8⁺ T細胞の動態を評価するための腫瘍移植

反ベクトルと反遺伝子特定 CD8 の同時定量⁺ T はマイクウイルスベクターを用いたワクチン後染色テトラマー MHC を介して細胞