本研究は、国立の研究、開発および革新ハンガリー オフィス (ÁH にグラント 116912) 費用事務所に支えられ (食品と農業コスト アクション FA1205: AQUAGAMETE)、Stipendium Hungaricum 奨学金プログラム (ザンビアにグラント)、新ハンガリー国家卓越性また、博士課程フェローシップ (EK にグラント)。

ここで説明したすべてのメソッドは、ハンガリー語の動物福祉法によって承認されています。
1. 試薬の準備
<ol><li>貯蔵液<ol>
<li>1 M トレハロースを準備するには、それが完全に溶けるまでよく dH2O. ミックス 1 mL にトレハロース二水和物の 0.378 g を追加します。</li>
		<li>1 M ショ糖を準備するには、それが完全に溶けるまでよく dH2O. ミックス 1 mL の中にショ糖の 0.342 g を追加します。</li>
		<li>1 M HEPES を準備するには、それが完全に溶けるまでよく dH2O. ミックス 1 mL に HEPES の 0.238 g を追加します。</li>
		<li>100 mg を 5 mL の PBS に追加することによって 20 mg/mL コラゲナーゼ (290 U/mg) を準備します。それが溶けるまで徹底的にミックスします。0.2 μ m のフィルターを通して無菌フィルター。0.2 mL PCR に 50 μ L 分注チューブし、- 20 ° C で凍結</li>
		<li>15 mg/mL のトリプシンを準備 (~ 10000 U/mg) 75 mg を 5 mL の PBS に追加することによって。それが溶けるまで徹底的にミックスします。0.2 μ m のフィルターを通して無菌フィルター。0.2 mL PCR に 50 μ L 分注チューブし、- 20 ° C で凍結</li>
		<li>1 mg/ml DNase 私 (〜 3000 U/mg) 5 mg を 5 mL の PBS に追加することによって。それが溶けるまで徹底的にミックスします。0.2 μ m のフィルターを通して無菌フィルター。0.2 mL PCR に 50 μ L 分注チューブし、- 20 ° C で凍結</li>
		<li>0.4% トリパン ブルー色素を準備するには、10 mL の PBS にトリパン ブルー色素の 40 mg を追加します。0.2 μ m のフィルターを通して無菌フィルター。1.5 mL チューブに分注 1 mL。</li>
		<li>200 mg/L の MS を準備-222 (Tricaine メタン スルホン酸) それが完全に溶けるまでよく dH2o ・ ミックスの 1 L に MS 222 の 200 mg を追加します。さらに、バッファーの 7.0 の中性 pH に重炭酸ナトリウムで MS 222 ソリューション。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ガラス化のためのソリューション<ol>
<li>平衡ソリューション (ES) を準備: ES の 2 mL をメタノール (メタノール; 1.5 M), 121.5 μ L を混合することによって準備プロピレング リコール (PG; 1.5 M) の 220 μ L FBS (10%)、トレハロース ストック溶液 (0.1 M)、HEPES 原液 (25 mM) を 50 μ l 添加し、2 に L-15 の 1208.5 μ L の 200 μ L の 200 μ L mL のチューブ。</li>
		<li>ガラス固化ソリューション (VS) を準備: PG (3 M)、ジメチルスルホキシドの 426 μ L の 439 μ L を混合することによって対 2 mL を準備 (私2だから; 3 M)、200 μ L FBS (10%)、トレハロース原液 (0.1 M)、HEPES の 50 μ L を 200 μ l 添加のストック ソリューション (25 mM) とに L-15 の 685 μ L、2 mL 管。</li>
	</ol>
</li>
	<li>地球温暖化のためのソリューション<ol>
<li>地球温暖化の解決策 1 (WS1) の準備: FBS (10%)、スクロース原液 (3 M) の 450 μ L の 150 μ L を混合することによって 2 mL チューブに WS1 の 1.5 mL を準備および L-15 の 900 μ L。</li>
		<li>地球温暖化の解決策 2 (WS2) の準備: FBS (10%)、スクロース原液 (1 M) の 150 μ L の 150 μ L を混合することによって WS2 の 2 mL チューブ 1.5 mL を準備および L-15 の 1200 μ L。</li>
		<li>地球温暖化の解決策 3 (WS3) の準備: 混合 150 μ L FBS (10%) 2 mL チューブに WS2 の 1.5 mL を準備および L-15 の 1350 μ L。</li>
	</ol>
</li>
	<li>消化ソリューションを準備: の各サンプルは、コラゲナーゼ原液 (2 mg/mL) の 50 μ L、トリプシン原液 (1.5 mg/mL) の 50 μ L を混合することによって消化液の 500 μ L を準備、DNase の 10 μ L 私 (20 μ g/mL) と 2 mL の L-15 390 μ 管します。</li>
	<li>解剖用具を得る: はさみや刀、ピンセット、ピンセット、鍼治療の針。</li>
</ol>2. 精巣コレクション
<ol><li>200 mg/L の MS を含んでいる皿に配置することによって魚を安楽死させる-222 (pH = 7)。郭清を続行する前にエラが動いて停止した、その少なくとも 10 分が低酸素によって死を確認するその瞬間から渡されたことを確認します。</li>
	<li>ペーパー タオルを軽くたたいて魚を乾燥、解離性のマットに背側に置きます。<ol>
<li>まず簡単に郭清の骨盤と胸ひれを切った。</li>
		<li>水平方向に胸鰭の間魚の腹の皮膚を切り取るし、臀鰭まで皮膚と腹に沿って基になる筋肉をカットします。</li>
		<li>魚の体腔を開き、針を使って解剖マットに左と右の体壁を固定します。 注: 精巣がスイミング膀胱 (図 1) の両側に消化器官の上にあります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>汚染を防ぐためには、胃腸の器官を取り出して、軽く 1 つの側面にそれらをプッシュしていない反対側から精巣を削除します。精巣は、体壁に接続されているので慎重にそれらを削除し、接続の腹膜を刀でカットします。</li>
	<li>さらに、汚染を防ぐためにまず滅菌精巣 70% のエタノールの 2 s、およびその後の場所にそれらを置くことによって氷の上の 96 ウェル プレートの L-15 でそれら。 注: それが必要な場合、脂肪組織からは大きくてきれいな精巣血管は、実体顕微鏡下で正確に</li>
</ol>3 精巣組織の超高速冷却
<ol><li>サンプルの種類に応じて適切なラベル マーク針入力し、平衡 (ES) とガラス固化ソリューション (VS) を準備します。</li>
	<li>滅菌鍼治療の針に大きいのウェル プレート皿とピン 2、3 精巣 (以上針のサイズによって) に精巣を転送します。<ol>
<li>まずピンセット上に精巣を位置します。精巣の真ん中に針のポイントを置き、慎重にピンセットで精巣を引き上げてください。</li>
		<li>精巣を穿刺後ゆっくり引き上げます針の上部。精巣は互いから分離され、彼らがないから落ちるまたは滑っていることを確認します。</li>
		<li>ガラスまで L-15 と 2 mL チューブに固定された精巣では、針に満たされた場所 (25 ° C; にストレージ時間を超えない 1 h)。 注意: 針の睾丸が固定されるべき精巣が乾燥するを防ぐために高速。</li>
	</ol>
</li>
	<li>平衡のソリューションに精巣に針を転送し、25˚C で 5 分間インキュベートします。</li>
	<li>ガラス固化ソリューションに針を転送し、, 30 25˚C で s。</li>
	<li>ガラス固化ソリューションから針を削除します, 迅速かつ優しく滅菌ペーパー タオルで組織から残りの溶液を吸収します。精巣ペーパー タオルに付着または落下を避けるために注意を使用します。</li>
	<li>すぐに発泡スチロールの箱は、液体窒素に針を配置します。 注: は、すぐにティッシュの液体窒素の蒸気への露出を避けるためこの手順をしないでください。液体窒素の低ボリュームを使用すると、サンプルのクロスコンタミネーションを防ぐため。</li>
	<li>5-10 分のクローズド発泡スチロール ボックスで液体窒素に針をしてください。</li>
	<li>開設 4.5 mL cryotube と同じ箱にそのキャップを precool します。</li>
	<li>5-10 分後に液体窒素の表面の下の別の cryotube に各針を転送し、cryotube を閉じます。 注意: は、常に時 (絶縁手袋) などの防護服を使用して露出は重度の凍傷をもたらす液体窒素を使用します。</li>
	<li>金属の杖の上に cryotube を置き、できるだけ早く精子の容器にそれを配置します。キャニスター ストレージ内のサンプルを格納使用までデュワー。</li>
</ol>4. 地球温暖化の手順
<ol><li>それぞれの針を別々 に暖かい。25 ° C で、すべて地球温暖化ソリューションが必要</li>
	<li>金属の杖から cryotube を外し、発泡スチロールの箱に格納されている液体窒素に突入します。</li>
	<li>(鉗子を使用して) 液体窒素の蒸気で、cryotube を開き、液体窒素に針をリリースします。</li>
	<li>針を最初の温暖化のソリューションに非常に高速転送し、(25 ° C) で 1 分間インキュベートします。転送中に空気で地球温暖化を防ぐためにすぐに針を転送することを確認します。</li>
	<li>2 番目の地球温暖化ソリューションに針を転送し、(25 ° C) で 3 分間インキュベートします。</li>
	<li>3 地球温暖化ソリューションに針を転送し、(25 ° C) で 5 分間インキュベートします。</li>
	<li>下曲がりピンセットで内側にスライドさせる針から精巣をリリースします。10% を添加した L-15 の 250 μ L に満ちた個別井戸 (96 ウェル プレート) に個別にそれぞれの暖められた精巣 FBS。サンプルによると井戸が分類されることを確認します。ウェル プレートまですべてのサンプルが暖めている氷の上、さらに仕事までを保ちます。</li>
</ol>5. ティッシュの消化力
<ol><li>独立した 2 mL の管で各サンプルに対して解離液の 500 μ L を準備します。サンプルのコードによるとチューブにラベルを付けます。室温で 5 分間準備解離ソリューションを孵化させなさい。</li>
	<li>消化液に温めた組織を追加し、小さなハサミの少なくとも 30 の動きによって小さな断片にそれをカットします。</li>
	<li>25 ° C で 90 分間振動板の切断組織を孵化させなさい。</li>
	<li>FBS の L-15 と 100 μ L の 400 μ L を追加することによって消化力プロセスを停止 (10% FBS v/v)。簡単にソリューションを振るし、1 分室温で孵化させなさい。</li>
	<li>1.5 mL チューブに 50 μ m のフィルターを通して得られた解決策をフィルターします。チューブをそれに応じてラベルします。</li>
	<li>25 ° C で 10 分間 200 × g でフィルタ リング ソリューションを遠心します。</li>
	<li>慎重に上澄みを除去し、10% を添加した L15 の 20 μ L でペレットを再懸濁します FBS。手動でペレットを完全に溶解するまで管を振る。さらに使用するまで細胞懸濁液または 4 ° C で氷の上を保ちます。</li>
</ol>6. 生存率評価とセルを数える
<ol><li>細胞懸濁液と適切にラベル付けされた 0.2 mL PCR チューブの中 0.4% トリパン ブルー溶液 5 μ L ミックス 5 μ L。別のボリュームを使用している場合ことを確認希釈率 1:1 のまま。</li>
	<li>この懸濁液室温 (25 ° C) で 1 〜 3 分の間孵化させなさい。</li>
	<li>顕微鏡下で検定の各サンプルの実行可能性を確認してください。</li>
	<li>15 の分野で (トリパン ブルーによる無染色) 生細胞数をカウントします。20 μ m の細胞懸濁液内のセルの合計数を計算します。懸濁液は、すべてのダウン ストリーム アプリケーションの準備が整いました。 注意: より大きなボディサイズと他の種の手順を最適化するときは、同じ重みの精巣フラグメントを使用します。結果に個々 の変動を避けるためにすべての実験群の 1 人の個人から精巣を使用します。ゼブラフィッシュ、場合我々 を利用した事実を左と右の精巣が等しい (または非常に類似した) 生殖細胞13数を含める必要があります (代表の結果を参照してください)。左の精巣は右精巣凍結融解中コントロールとして保たれました。生存率の割合を求めた新鮮な精巣から分離した細胞の数と比較して凍結融解精巣から分離した細胞の数。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+the+germplasm+of+animals+used+in+biological+and+medical+research:+Importance,+impact,+status,+and+future+directions.">Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions.</a> Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).</li><li>Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+In+Vitro+Fertilization+at+the+Zebrafish+International+Resource+Center.">Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center.</a> Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).</li><li>Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+simplified+and+standardized+protocol+with+potential+for+high-throughput+for+sperm+cryopreservation+in+zebrafish+Danio+rerio.">Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio.</a> Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).</li><li>Morris, J. P., Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+sperm+cryopreservation+with+N,N-dimethylacetamide.">Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide.</a> Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).</li><li>Yoshizaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogonial+transplantation+in+fish:+A+novel+method+for+the+preservation+of+genetic+resources.">Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources.</a> Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).</li><li>Gao, D., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cryoinjury+in+living+cells.">Mechanisms of cryoinjury in living cells.</a> ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).</li><li>Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horv&#225;th, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress,+challenges+and+perspectives+on+fish+gamete+cryopreservation:+A+mini-review.">Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).</li><li>K&#225;sa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+sperm+vitrification+protocols+for+freshwater+fish+(Eurasian+perch,+Perca+fluviatilis)+and+marine+fish+(European+eel,+Anguilla+anguilla).">Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla).</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).</li><li>Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+channel+catfish+with+sperm+cryopreserved+by+rapid+non-equilibrium+cooling.">Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling.</a> Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).</li><li>Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+needle+immersed+vitrification:+A+practical+and+convenient+method+with+potential+advantages+in+mouse+and+human+ovarian+tissue+cryopreservation.">Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation.</a> Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).</li><li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Live+Offspring+from+Testicular+Tissue+Cryopreserved+by+Vitrification+Procedures+in+Japanese+Quail+(Coturnix+japonica).">Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica).</a> Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).</li><li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+needle-in-straw+vitrification+can+effectively+preserve+the+follicle+morphology,+viability,+and+vascularization+of+ovarian+tissue+in+Japanese+quail+(Coturnix+japonica).">Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica).</a> Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).</li><li>Lee, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+cryopreservation+of+spermatogonia+in+critically+endangered+Manchurian+trout+(Brachymystax+lenok).">Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok).</a> Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).</li><li>Marques, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+of+zebrafish+(Danio+rerio)+ovarian+follicles+after+vitrification+in+a+metal+container.">Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container.</a> Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).</li><li>Luji&#263;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+successful+vitrification+of+salmonid+ovarian+tissue.">First successful vitrification of salmonid ovarian tissue.</a> Cryobiology. 76, 154-157 (2017).</li><li>Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., Garc&#237;a-Xim&#233;nez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+on+cell+viability+of+three+zebrafish+testicular+cell+or+tissue+cryopreservation+methods.">Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods.</a> CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).</li><li>Marinovi&#263;, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosurvival+of+isolated+testicular+cells+and+testicular+tissue+of+tench+Tinca+tinca+and+goldfish+Carassius+auratus+following+slow-rate+freezing.">Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).</li><li>P&#353;eni&#269;ka, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+early+stage+Siberian+sturgeon+Acipenser+baerii+germ+cells,+comparison+of+whole+tissue+and+dissociated+cells.">Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells.</a> Cryobiology. 72, 119-122 (2016).</li><li>Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eggs+and+sperm+from+cryopreserved+whole+testes.">Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes.</a> Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

本研究の主な目的は、針を適応する鳥類と哺乳類10、11,12魚の精巣 (モデルとしてのゼブラフィッシュの凍結保存するために開発された超高速冷却手順を浸漬生物)。ゼブラフィッシュ遺伝子資源の凍結保存に関する従来の研究のほとんどは、ゼブラフィッシュ精子2,3,<sup c...

科学とバイオ テクノロジーの新しいトレンドは、マウスやショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ モデル有機体生物医学的でおよび他の科学の1として使用される他種の新しい突然変異系統の何千もの作成につながっています。さらに、新技術の開発し、利用可能になるが、突然変異系統の数は着実に2を増加します。これの繁殖コロニーを維持する一般的な慣行を超えて遺伝資源の安全なストレージの必要性に します。凍結保存を不特定期間の遺伝資源の安全な保管を可能にする方法としては繁殖期の延長は親魚、継続的なメンテナンスの必要性を回避して、それはより多くのコスト-のように多くの利点を提供していて、労働効率2。
過去数年間2,3,4中に開発された精子凍結保存のためのプロトコルは、ゼブラフィッシュ男性遺伝物質の正常なストレージのための機会を提供しています。しかし、卵や魚の胚の凍結保存は、まだ彼らの複雑な構造と卵黄素材の大量のためことはできません。最近では、始原生殖細胞 (PGCs) 精原幹細胞 (Ssc) の移植の実践は機能的な精子や卵子に移植5後開発することによってこの障壁をバイパスをご利用いただけます。したがって、Ssc の凍結保存には、希少で貴重な遺伝資源の保全の新たなフロンティアが提供しています。
でも、凍結は、多くの利点を提供しています、緩速凍結過程は細胞損傷の2につながる可能性がありますいくつかの条件を生成します。細胞内および細胞外凍結、脱水、凍結毒性が挙げられます。細胞内氷被害、細胞、細胞外の氷は細胞から緩速凍結中の水の拡散は脱水6につながる可能性がありますしながら細胞の機械的粉砕する可能性があります。最近では、魚の配偶子7,8,9の凍結保存で氷形成の負の影響を防止する手法としてガラスを適用されています。それは、内部および外部のメディアに氷7,10に 0.28-0.5% なし/ガラスの非晶質状態に超急速冷却法を提示します。精巣や卵巣組織のガラス化を成功が証明されて鳥と哺乳類10、11,12、こうして魚、同様の応用の可能性を開きます。
本研究では全体のゼブラフィッシュ精巣の凍結保存用浸漬針ガラス (NIV) の手順を提案する.ゼブラフィッシュ初期生殖細胞汚染も初期生殖細胞の比較的高い金額を他の細胞、特に精子の低い存在を生み出すため凍結のプロセスを分離するための信頼性の高い方法を紹介します。我々 の知る限り、これは魚の生殖腺組織およびゼブラフィッシュ生殖細胞の超急速冷却のため詳細な可視化プロトコルを示す最初の研究。さらに、メソッドの再現性、5 つの異なるゼブラフィッシュ系統に示されて: AB 野生型、キャスパー (ロイ-/-;真珠-/-)、ヒョウ (レオt1/t1)、ヴァーサ号 [Tg (vas::eGFP)] ウィルムス腫瘍 [Tg (wt1b::eGFP 1)] 形質転換線。

<table><tbody><tr><td>Leibovitz media (L-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>Supplemented with L-glutamine</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Acros Organics</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Acros Organics</td><td>99-20-7</td><td>Dihydrate</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Reanal</td><td>20740-0-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Propylene glycol</td><td>Reanal</td><td>08860-1-08-65</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Reanal</td><td>00190-1-01-65</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Gibco</td><td>9001-12-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Panreac AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Phospate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Tablets for preparation of 200 ml PBS solution</td></tr></tbody></table>

cryopreservation of zebrafish spermatogonia by whole testes needle immersed ultra-rapid cooling

科学とバイオ テクノロジーの現在の傾向は、何千ものそれによって繁殖コロニーを維持する一般的なプラクティスを超える遺伝資源の安全な保管のための新しい方法の必要性につながるモデル有機体内の新しい行の作成に します。本研究の主な目的は、針を合わせて全体のゼブラフィッシュ精巣を凍結保存するガラス (NIV) の手順を浸漬でした。初期段階全体精巣生殖細胞の凍結保存わたしを楽しめ、ゼブラフィッシュの貯蔵のため遺伝資源移植後彼らは雄性と雌性の配偶子に成熟することができます特に以来。精巣を摘出、2 凍害メディア (1.5 M メタノールと 1.5 M プロピレング リコール; 平衡ソリューションと 3 M ジメチルスルホキシドと 3 M プロピレング リコールを含むガラス固化ソリューション) で平衡鍼灸針の固定液体窒素に墜落しました。サンプルは、3 つの結果として地球温暖化ソリューションのシリーズで暖められました。この手法の主な利点 (1) 精子の不足は、暖められた精巣のため下流の操作が容易の消化後(2) 超急速冷却液体窒素したがって冷却と凍結保護剤、その毒性を低減の必要濃度の削減を最大化する組織の最適な露出を有効にします。(いくつか精巣の凍結保護剤と液体窒素への露出 3) 同期(4) の再現性は 5 つの異なるゼブラフィッシュ系統で 50% 以上の生存率を得ることによって示されます。

平均では、魚の大きさに応じて 40,000 および 200,000 の細胞間単一新鮮なゼブラフィッシュ精巣から分離された初期生殖細胞の数で変化。すべての 5 系統で新鮮なゼブラフィッシュ精巣を消化、初期生殖細胞細胞懸濁液 (図 2) で現在のセルだけがなかった。初期生殖細胞の横に多数の精子がも見つかりました。その一方で、凍結保存した精巣の消?...

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Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

全体の睾丸針によるゼブラフィッシュを精原細胞の凍結保存に超急速冷却浸漬

本研究の主な目的は、針を合わせて全体のゼブラフィッシュ精巣を凍結保存するガラス (NIV) の手順を浸漬でした。さらに、5 つの異なるゼブラフィッシュ系統における法の再現性がテストされました。

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

cryopreservation-zebrafish-spermatogonia-whole-testes-needle-immersed

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

8.3K ビュー.  Szent István University. 本研究の主な目的は、針を合わせて全体のゼブラフィッシュ精巣を凍結保存するガラス (NIV) の手順を浸漬でした。さらに、5 つの異なるゼブラフィッシュ系統における法の再現性がテストされました。

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Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

熱ショック2処理とゼブラフィッシュ胚の倍数性マニピュレーション

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

発生生物学

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

ゼブラフィッシュの精子細胞からのマイオサイト染色体の広がりの調製

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

遺伝学

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging model systems. CRISPR-Cas genome editing systems use a synthetic guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to specific genomic DNA loci, where the Cas endonuclease generates a double-strand break. The repair of double-strand breaks by intrinsic error-prone mechanisms leads to insertions and/or deletions, disrupting the locus. Alternatively, the inclusion of double-stranded DNA donors or single-stranded DNA oligonucleotides in this process can elicit the inclusion of precise genome edits ranging from single nucleotide polymorphisms to small immunological tags or even large fluorescent protein constructs. However, a major bottleneck in this procedure can be finding and isolating the desired edit in the germline. This protocol outlines a robust method for screening and isolating germline mutations at specific loci in Danio rerio (zebrafish); however, these principles may be adaptable in any model where in vivo sperm collection is possible.

CRISPR-Cas technologies have revolutionized the field of genome editing. However, finding and isolating the desired germline edit remains a major bottleneck. Therefore, this protocol describes a robust method for quickly screening F0 CRISPR-injected zebrafish sperm for germline edits using standard PCR, restriction digest, and gel electrophoresis techniques.

ゼブラフィッシュの生殖細胞系列編集の迅速な分離のための精子のスクリーニング

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

ゼブラフィッシュ精子の凍結保存用ハイスループット法とインビトロ受精

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

生物学

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from heterozygous females allow F1 mutagenized females to be screened directly for deleterious mutations in an accelerated forward genetic screen. Streisinger et al.1,2 described methods for making gynogenetic (homozygous) diploid zebrafish by activating zebrafish eggs with ultraviolet light-inactivated sperm and preventing either the second meiotic or the first zygotic cell division using physical treatments (heat or pressure) that deploymerize microtubules. The "early pressure" (EP) method blocks the meiosis II, which occurs shortly after fertilization. The EP method produces a high percentage of viable embryos that can develop to fertile adults of either sex. The method generates embryos that are homozygous at all loci except those that were separated from their centromere by recombination during meiosis I. Homozygous mutations are detected in EP clutches at between 50% for centromeric loci and less than 1% for telomeric loci. This method is reproduced verbatim from the Zebrafish Book3.

This is a method for generating gynogenetic diploid zebrafish embryos (embryos whose only genetic contribution comes from the mother) by blocking the second meiotic division immediately after fertilization with ultraviolet light-inactivated sperm. EP embryos are not fully homozygous due to recombination during the first meiotic division, however they are homozygous at all loci that have not been separated from their centromere by recombination.

初期の圧力による雌性発生二倍体のゼブラフィッシュを作成

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

ゼブラフィッシュの卵巣卵胞における濾胞細胞と卵母細胞の分離

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

<meta charset="utf8"></head><body>無細胞顆粒膜のステージIゼブラフィッシュ卵母細胞を得るための改良された手順

Rapid Isolation of Stage I Oocytes in Zebrafish Devoid of Granulosa Cells

The study of oocyte development holds significant implications in developmental biology. The zebrafish (Danio rerio) has been extensively used as a model organism to investigate early developmental processes from oocyte to embryo. In zebrafish, oocytes are surrounded by a single layer of somatic granulosa cells. However, separating granulosa cells from oocytes poses a challenge, as achieving pure oocytes is crucial for precise analysis. Although various methods have been proposed to isolate zebrafish oocytes at different developmental stages, current techniques fall short in removing granulosa cells completely, limiting the accuracy of genome analysis focused solely on oocytes. In this study, we successfully developed a rapid and efficient process for isolating pure stage I oocytes in zebrafish while eliminating granulosa cell contamination. This technique facilitates biochemical and molecular analysis, particularly in exploring epigenetic and genome structure aspects specific to oocytes. Notably, the method is user-friendly, minimizes oocyte damage, and provides a practical solution for subsequent research and analysis.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:純粋なゼブラフィッシュステージI卵子を単離するための強化された方法(英語)

This protocol describes a modified procedure for rapidly isolating clean stage I oocytes in zebrafish devoid of granulosa cells, thereby providing a convenient method for oocyte-specific research.

顆粒膜細胞を欠損したゼブラフィッシュにおけるI期卵子の迅速な単離

The study of oocyte development holds significant implications in developmental biology. The zebrafish (Danio rerio) has been extensively used as a model ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

半数ゼブラフィッシュ胚の生成により<em&gt;体外</em&gt;受精

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

全体の睾丸針によるゼブラフィッシュを精原細胞の凍結保存に超急速冷却浸漬

要約

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熱ショック2処理とゼブラフィッシュ胚の倍数性マニピュレーション

ゼブラフィッシュの精子細胞からのマイオサイト染色体の広がりの調製

ゼブラフィッシュの生殖細胞系列編集の迅速な分離のための精子のスクリーニング

ゼブラフィッシュ精子の凍結保存用ハイスループット法とインビトロ受精

初期の圧力による雌性発生二倍体のゼブラフィッシュを作成

ゼブラフィッシュの卵巣卵胞における濾胞細胞と卵母細胞の分離

顆粒膜細胞を欠損したゼブラフィッシュにおけるI期卵子の迅速な単離

顆粒膜細胞を欠損したゼブラフィッシュにおけるI期卵子の迅速な単離

顆粒膜細胞を欠損したゼブラフィッシュにおけるI期卵子の迅速な単離

半数ゼブラフィッシュ胚の生成により