Name: in vivo detection and analysis of rb protein sumoylation in human cells
Uploaded: 2017-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells at JoVE.com

本研究は、科学と技術委員会の上海 (許可番号 14411961800) 国家自然科学基金、中国の (許可番号 81300805) からの助成金によって支えられました。

1 G1 期における内因性 Rb sumo 化の検出 <ol><li>細胞培養と細胞周期同期。。
	<ol><li>ダルベッコを含んでいる成長媒体の維持 HEK293 細胞 &#39; s 修正イーグル培 (DMEM) 1% ペン連鎖球菌と 10% 牛胎児血清 (FBS) 37 ° C、5% CO 2 インキュベーターで</li>。
		<li>は、G0 段階で HEK293 細胞を同期します。
		<ol><li>15 cm で、検定と種子 ~1.5 x 10 7 細胞を用いた HEK293 細胞治療前に、24 h の 25 ml の培地で皿数。媒体および洗浄 70%-80%、吸引の合流点に達した後、セル 2 回 5 ml prewarmed リン酸緩衝生理食塩水 (PBS).</li>
			<li>25 mL 1% を含む DMEM を追加しペニシリン-ストレプトマイシンと 72 h 洗浄を 3 mL の氷冷 PBS を使用するプレートからの 37 ° C でセルを孵化させなさい。新しい 5 mL チューブにセルを転送します</li>。
			<li>フローサイトメトリー (ステップ 1.2) によって細胞周期解析細胞のごく一部の対象;、室温で 5 分間 200 × g で遠心分離によって細胞の残りの大半を収集し、分析まで超低温冷凍庫で保存Rb わかった</li>。
		</ol></li> <li>G1 期を取得する G0 同期プロセスの終わりに、セル、DMEM を削除し、HEK293 細胞が細胞周期を再入力できるように戻って新鮮な培を追加。さまざまな G1 段階で細胞を収集 (早い G1: 30 分まで。G1: 2 h) 細胞周期の解析、さらに相撲アッセイします</li>。
		<li>二重チミジン ブロック法を用いた S 相 HEK293 細胞を同期します。
		<ol><li>成長 HEK293 細胞を十分に洗うと 50% の confluency prewarmed PBS のセルです。18 h (最初のブロック) のための 2.5 mM のチミジン成長培を加えます</li>。
			<li>は、チミジンを含む培地を取り除き、prewarmed PBS で 2 回細胞を洗います。セルを解放する 14 時間、新鮮な成長媒体を追加します</li>。
			<li>ピペットで培地を除去し、細胞周期と Rb sumo 化の分析を行う前に別 18 h (第 2 ブロック) の 2.5 mM チミジンを添加した培を追加します</li>。
		</ol></li> <li>G2/M の同期、24 h の 25 mL の培地で 15 cm 皿プレート ~1.5 × 10 7 HEK293 細胞。媒体に追加ノコダゾール 400 ng/mL の最終濃度が得られるまで。最後に、Rb sumo 化と細胞周期の分析を実施する前に 16 時間細胞をインキュベートします</li>。
	</ol></li> <li>フローサイトメトリーを用いた細胞周期解析。
	<ol><li>、PBS に再同期 HEK293 を中断し、4 で 2 時間冷えた 70% エタノールを使用して細胞懸濁液を修正し、° C セルのクラスタ リングを最小限に抑えるの最終的な集中を取得し、冷えた 100% エタノールに細胞懸濁液を滴下し追加することに注意してください軽くボルテックス中 70% エタノール</li>。
		<li>は、500 × g で 5 分間細胞を遠心し、慎重に上澄みを廃棄し、PBS で 2 回細胞を洗浄します。遠心分離機の手順を繰り返します</li>。
		<li>追加 500 μ L の PBS 含む 50 μ G/ml 核酸染色 propidium ヨウ化、セルに 0.1% トリトン X-100 と 1 μ g/mL RNase A とよく混ぜます。37 で 15 分細胞をインキュベート ° C</li>
		<li>フローサイトメトリーによる解析まで 4 ° c のサンプルを格納します</li>。
	</ol></li> <li>Rb の内因性のタンパク質の免疫沈降。
	<ol><li>準備、HEK293 細胞溶解液。
		<ol><li>優しく再冷たい免疫検定法 (RIPA) 換散バッファー (表 1) の 1 mL の新鮮なを含んでいるそれらを停止することによって同期 HEK293 細胞追加 20 mM が isopeptidase 阻害剤 N-エチルマレイミド Lyse相撲プロテアーゼをブロックし、相撲の抱合体を安定させる</li>。
			さらに <li>Dounce 均質化、超音波または単に通過を 10 回 2 mL 注射器に付いている 21 G 針による氷の細胞をホモジナイズしてください。その後、5 分間氷の上細胞をインキュベート 
			注: 陰イオン洗剤ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) RIPA バッファーでは Rb タンパク質とその他の非共有結合相互作用から派生した非特異的相撲信号を除去できれば、Rb 相撲の後の決定のために重要非 Rb 相撲種</li>。
		</ol></li> <li>4 セル lysates 30 分 18,000 × g で遠心分離機 ° C が培養上清を新しい 1.5 mL マイクロ遠心チューブに転送します 。
		注: プロトコルはここで一時停止することができます。タンパク質は、少なくとも 6 ヶ月間-80 ° c 格納できます</li>。
		<li>新しいチューブと-80 で店に上述した上澄みのごく一部を保存後の西部のしみの各サンプルの入力コントロールを準備をする ° C</li>
		<li>上清にモノクローナル抗体の Rb 抗体と 50% 蛋白質 A/G-セファローズ スラリーの 20 μ L 1 μ g のマウスの非特異的免疫グロブリン G (IgG) の同じ種とアイソタイプを追加。その後、緩やかな回転で 4 ° C で 1 時間インキュベートします</li>。
		<li>4時 3 分 3,000 x g でサンプルを遠心分離機 ° c、ビーズを乱すことがなく培養上清を収集し、それらを新しい 1.5 mL マイクロ遠心チューブに転送します。各サンプルに 5 μ L Rb 一次抗体と 50% 蛋白質 A/G-セファローズ スラリーの 40 μ L を追加します。その後、緩やかな回転で 4 ° C で一晩インキュベートします</li>。
		<li>は、4 ° C で 3 分間 3,000 × g で遠心分離によってビーズを収集し、ピペットで上澄みを慎重に取り外します。ビーズの損失を避けるためには、ビーズのドライを吸い出してはいけない</li>。
		<li>1 mL RIPA バッファーにビードを 4 回洗浄しなさい。各時間、回転 4 ° C 15 分でそれらを収集でよくビーズ 4 ° C で 3 分間 3,000 x g で低速遠心分離によってチューブを混ぜるし、培養上清を破棄します</li>。
		<li>最終的な洗浄から培養上清を除去した後再ナトリウム dodecyl 硫酸塩ポリアクリルアミド ゲル電気泳動 (SDS-PAGE) 読み込みバッファー (表 1) x 30 μ L 1 でビーズを中断し、よく混ぜます。
		<ol><li>加温熱で 100 ° c 管ブロック 10 分遠心ビーズをペレットに 1 分間、12,000 × g でサンプル。慎重に、ビーズを乱すことがなく培養上清を収集し、1.5 mL のマイクロ遠心チューブにそれらを転送します</li>。
		</ol></li> <li>4-20% 勾配 SDS-PAGE による試料のゲルの分析および西部のしみまたは後で使用のための-20 ° C で保存します</li>。
	</ol></li></ol> 2。タグ付きの 6XHis sumo 化 Rb 外因性ひと細胞の解析 <ol><li>細胞培養とトランスフェクション。
	<ol><li>〜 6 種 × 10 6 HEK293 細胞 10 cm 皿し、75-85% コンフルエントの細胞を取得する正常な細胞培養条件下での培地に 24 時間孵化させなさい。トランスフェクション効率を促進する前に成長培地を削除し、prewarmed の減らされた血清中の 6 mL を追加 (材料の表 を参照) し、インキュベーターに料理を配置</li>。
		<li>、Rb の構成の sumo 化アッセイは、それぞれ 1.5 mL マイクロ遠心チューブに 500 μ L 減少血清培地で 6XHis タグ Rb Ubc9 WT、Rb Ubc9 C93S、Ubc9 WT Ubc9 C93S プラスミドの各 15 μ を追加します。
		<ol><li>野生型 Rb の相撲抱合とその sumo 化欠損株を分析、どちらか 6XHis タグ Rb WT や Rb K720R プラスミドの GFP SUMO1 と共に 10 μ g をミックス (10 μ g) 500 μ L に減少 1.5 mL マイクロ遠心分離機で血清中 13 を管します</li>。
		</ol></li> <li>一方、別々 のチューブで 50 μ L のトランスフェクション試薬を混ぜる (材料表 参照) 500 μ L に減少、血清中、5 分間室温でインキュベート</li>
		<li>完全に上記で説明した 2 つの個別のチューブを結合セルに試薬/プラスミド錯体 15 分追加、トランスフェクションの室温でインキュベートし続けて 8 の文化h 5% CO 2 と 37 ° C で</li>
		<li>成長媒体、低血清培地を交換し、トランスフェクション後 48 時間の通常の培養条件下で細胞をインキュベートします</li>。
	</ol></li> <li>タグ付きの 6XHis の Rb タンパク質の親和性のプルダウンをニッケルします。
	<ol><li>Transfected HEK293 細胞を溶解し、説明セクション 1.3.1 として総蛋白を抽出します</li>。
		<li>4 で 30 分のセル lysates 18,000 × g で遠心分離機 ° c 培養上清を収集し、クリーン チューブにそれらを転送します 。
		注: タンパク質を固定できるこの時点で-80 で 6 ヶ月以上 ° C</li>
		<li>上清を新しいチューブと-80 で店に上記のごく一部を保存後の西部のしみの各サンプルの入力コントロールを準備をする ° C</li>
		<li>洗浄 25 μ L 50% のニッケル ニトリロ三酸 (Ni 国税庁) アガロース ビーズ各サンプルに対して 1.5 mL マイクロ遠心チューブに 2 回 RIPA バッファーです。4 での 3 分間 3,000 × g で遠心分離してビーズを収集 ° C</li>
		<li>10 mM の最終的な集中を取得するには、各サンプルに追加 1 M イミダゾール。各サンプルを準備された Ni NTA アガロース ビーズを含むチューブに追加します</li>。
		<li>では、ビーズと緩やかな回転で 4 ° C で 2 h の lysates を孵化させなさい。4 ° C で 3 分間 3,000 x g でビーズをスピン、ピペッティングにより培養上清を慎重に取り外します。ビーズの損失を避けるためには、ビーズのドライを吸い出してはいけない</li>。
		<li>は、1 mL の 20 mM のイミダゾール (表 1) を含む洗浄バッファーでビーズを洗います。各時間、4 ° C で 3 分間 3,000 x g で回してビーズ 15 分収集のための 4 ° C で回転でよくチューブを混ぜるし、培養上清を破棄します</li>。
		<li>最終的な洗浄後各サンプルに 30 μ L の溶出バッファー含む 250 mM のイミダゾール (表 1) を追加し、ミックスにフリックします。その後、タンパク質を溶出に 4 ° C で 20 分間インキュベートします</li>。
		<li>は、6 × SDS ページ読み込みバッファー (表 1) と各サンプルをミックスします。次に、100 ° c で 10 分間熱ブロックでチューブをインキュベート</li>
		ビーズをペレットに 1 分間、12,000 x <li>遠心 g。慎重に、ビーズを乱すことがなく培養上清を収集し、サンプルを 1.5 ml マイクロ遠心チューブに転送します。サンプルをウエスタンブロット分析または後で使用するための-20 ° C で保存することができます</li>。
	</ol></li></ol> 3。西部のしみの <ol><li>、免疫沈降をロードまたは 4-20% 勾配の SDS ページのゲルの上に前ステップから得られた試料をプルダウンします。120 V、90 分のタンパク質を分離する電気泳動を実施します</li>。
	<li>が 300 で電気的ブロッティング法による蛋白質をゲルから (PVDF) ブロッティングに転送 4 ° c タンク転写法による 90 分の mA。室温で 1 時間 5% 無脂肪牛乳 (表 1) を含むブロック バッファーで PVDF 膜をブロックします</li>。
	<li>加温 3% ウシ血清アルブミン (BSA) (表 1) を含む抗体希釈バッファーで一次抗体と膜が 4 ° C で一晩します。一次抗体は、0.5 μ g/mL (反 SUMO1 抗体) の作業濃度または配分 (反 Rb と抗チューブリン抗体)、または 1:5,000 (抗 GFP と反彼の抗体) の希釈を使用します</li>。
	<li>洗う膜 3 x 10 分たびにトゥイーン (TBST) バッファー (表 1) をもつ含有トリス緩衝生理食塩水 x 1 を使ってします。種特定の西洋わさびペルオキシダーゼ HRP 標識二次抗体希釈 1:5,000 5% 無脂肪牛乳 (表 1) を含むブロック バッファー内で膜を孵化させなさい。膜 3 を洗って 10 分 1 x TBST バッファーを使用するたびに x.</li>
	<li>は、強化された化学発光 (ECL) 作業ソリューションと膜を孵化させなさい。プラスチック製のラップと膜をカバーし、信号の強さに応じて x 線フィルム公開します</li>。
</ol>

<ol>
	<li>Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+cycle+transcription+during+G1+and+S+phases.">Control of cell cycle transcription during G1 and S phases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).</li><li>Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G1+cell-cycle+control+and+cancer.">G1 cell-cycle control and cancer.</a> Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).</li><li>Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein+and+cell+cycle+control.">The retinoblastoma protein and cell cycle control.</a> Cell. 81 (3), 323-330 (1995).</li><li>Giacinti, C., Giordano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RB+and+cell+cycle+progression.">RB and cell cycle progression.</a> Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).</li><li>Burkhart, D. L., Sage, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mechanisms+of+tumour+suppression+by+the+retinoblastoma+gene.">Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene.</a> Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).</li><li>Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rb/chromatin+connection+and+epigenetic+control:+opinion.">The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion.</a> Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).</li><li>Hilgendorf, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein+induces+apoptosis+directly+at+the+mitochondria.">The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria.</a> Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).</li><li>Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+within+the+pRb+pathway:+is+there+a+code+of+conduct.">Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct.</a> Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).</li><li>Macdonald, J. I., Dick, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modifications+of+the+retinoblastoma+tumor+suppressor+protein+as+determinants+of+function.">Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function.</a> Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).</li><li>Ezhevsky, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypo-phosphorylation+of+the+retinoblastoma+protein+(pRb)+by+cyclin+D:Cdk4/6+complexes+results+in+active+pRb.">Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).</li><li>Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+oncoproteins+E1A+and+E7+and+cellular+LxCxE+proteins+repress+SUMO+modification+of+the+retinoblastoma+tumor+suppressor.">Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor.</a> Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+SUMO-2/3+induced+senescence+through+p53-+and+pRB-mediated+pathways.">Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways.</a> J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).</li><li>Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMOylation+of+Rb+enhances+its+binding+with+CDK2+and+phosphorylation+at+early+G1+phase.">SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase.</a> Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).</li><li>Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concepts+in+sumoylation:+a+decade+on.">Concepts in sumoylation: a decade on.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).</li><li>Flotho, A., Melchior, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation:+a+regulatory+protein+modification+in+health+and+disease.">Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease.</a> Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).</li><li>Eifler, K., Vertegaal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMOylation-Mediated+Regulation+of+Cell+Cycle+Progression+and+Cancer.">SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer.</a> Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).</li><li>Wilkinson, K. A., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms,+regulation+and+consequences+of+protein+SUMOylation.">Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation.</a> Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).</li><li>Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+and+ubiquitin+in+the+nucleus:+different+functions,+similar+mechanisms.">SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms.</a> Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).</li><li>Sharma, P., Kuehn, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SENP1-modulated+sumoylation+regulates+retinoblastoma+protein+(RB)+and+Lamin+A/C+interaction+and+stabilization.">SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization.</a> Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).</li><li>Jakobs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubc9+fusion-directed+SUMOylation+(UFDS):+a+method+to+analyze+function+of+protein+SUMOylation.">Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation.</a> Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).</li><li>Gareau, J. R., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUMO+pathway:+emerging+mechanisms+that+shape+specificity,+conjugation+and+recognition.">The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).</li><li>Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+E2-mediated+SUMO+conjugation+revealed+by+a+complex+between+ubiquitin-conjugating+enzyme+Ubc9+and+RanGAP1.">Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1.</a> Cell. 108 (3), 345-356 (2002).</li><li>Saitoh, H., Hinchey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+small+ubiquitin-related+protein+modifiers+SUMO-1+versus+SUMO-2/3.">Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3.</a> J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).</li><li>Ayaydin, F., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+in+vivo+dynamics+of+vertebrate+SUMO+paralogues.">Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

本稿では、検出し、人間の細胞の Rb 内因性 sumo 化を分析するためのプロトコルについて説明します。このメソッドは、グローバル相撲関連信号の任意の交替なしの内因性の Rb タンパク質に重点を完全に自然な生理学的な状況下で Rb SUMO 化を調査するための重要なツールです。
この目的を達成するため、留意することが重要です、: 1) 相撲ユビキチン化と比較して 4 つの?...

真核細胞の細胞周期の進行の正確な制御は、順序付けられた方法1,2で特定のイベントが起こることにより、タイトな規制のネットワークに基づいています。このネットワークの主要なプレーヤーの 1 つは、最初のクローンとして作られた腫瘍サプレッサー1,3(Rb) 網膜芽細胞腫タンパク質です。Rb タンパク質は、細胞周期の進行、特に S 相転移と腫瘍成長4,5に G0/G1 のための負の調節因子と考えられています。Rb 機能のエラーどちらかに直結する子供たちは、最も一般的な眼内悪性腫瘍、網膜芽細胞腫または癌5の他の多くのタイプの開発に貢献。また、Rb は、細胞の分化、クロマチン再構築、およびミトコンドリアを介したアポトーシス3,6,7を含む多くの携帯電話経路に関与しています。
ポスト翻訳の修正は、RB 関数8,9の調節に重要な役割を果たします。リン酸化はこのような 1 つの変更、それは通常 Rb 不活化につながります。Rb は、静止の G0 細胞低リン酸化レベルでアクティブ。G0/G1 期で細胞、Rb は順番にハイパー-リン酸化 Rb を不活性化し、細胞周期を抑制する能力を排除するサイクリン E/CDK2 とサイクリン D/CDK4/6 などのサイクリンとサイクリン依存性キナーゼ (Cdk) のシリーズで関連の遺伝子式4,10。Rb は、小さなユビキチン関連の修飾子 (相撲)11,12,13で変更でした。
相撲は、様々 な標的タンパク質に共有されているユビキチン様タンパク質です。それは細胞周期制御を含む多様な細胞プロセスのために重大、転写、タンパク質局在と劣化、トランスポート、および DNA 修復14,15,16,17,18.、相撲活用経路から成っている二量体相撲 E1 活性化酵素 SAE1/UBA2、単一の E2 抱合酵素 Ubc9、複数の E3 リガーゼ、相撲特定プロテアーゼ。一般的に、成熟したフォームを生成する生初期の相撲の蛋白質を処理しなければなりません。成熟した相撲は E1 ヘテロダイマーによって活性化し、E2 酵素 Ubc9 に転送します。最後に、相撲の C 末端のグリシンは、基板ターゲット リジンに共役したし、このプロセスは通常 E3 リガーゼによって促進されます。SUMO タンパク質は、特定のプロテアーゼによって変更された基板から削除できます。本稿の著者による前の調査では、Rb の sumo 化に対して、G1 期は細胞周期進行13に必要なプロセスにおけるハイパー リン酸化につながる CDK2、バインディングを増加することを明らかにしました。我々 はまた、Rb sumo 化の損失が減少した細胞の増殖を引き起こすことを示した。また、最近 Rb sumo 化を保護すること Rb タンパク質プロテアソーム売り上げ高からこうして細胞19Rb 蛋白のレベルを上げることが示された.したがって、sumo 化は、様々 な細胞プロセスの Rb 機能に重要な役割を果たしています。Rb sumo 化の生理学的な関連性と機能的な結果の研究をするひと細胞または忍耐強いティッシュで Rb の相撲状態を分析する手法を開発することが重要です。
Sumo 化リバーシブル、非常にダイナミックなプロセスであります。したがって、通常完全に内因性の条件下で相撲修正された蛋白質を検出することは困難です。内因性 Rb sumo 化を検出する手法を提案します。さらに、それは、その相撲欠損変異11および野生型 Rb の外因性の Rb sumo 化を検出する方法を示します。特に、ジェイコブスらは Ubc9 融合監督 sumo 化 (UFD)20によって指定された基質の SUMO 化を増加させる方法を説明します。この方法に基づき、この議定書は Rb の強制 sumo 化とその機能の結果を分析する方法をについて説明します。相撲基板の何百もを以前に記載されているより多くの推定される相撲基板が多くプロテオミクスに基づく試金から識別されている、このプロトコルはひと細胞のこれらの蛋白質の SUMO 化を分析する適用できます。

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>propidium iodide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>AMRESCO</td><td>694</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>N-Ethylmaleimide</td><td>Sigma</td><td>E3876&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>AMRESCO</td><td>M107</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Substitute (NP-40)</td><td>AMRESCO</td><td>M158</td><td></td></tr><tr><td>protease inhibitor</td><td>Roche</td><td>5892970001</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Immunoglobulin G (IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>Rb antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#9309</td><td></td></tr><tr><td>Protein A/G-Sepharose Beads</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2003</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine-2000&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads</td><td>Qiagen</td><td>30230</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel</td><td>BIO-RAD</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>AMRESCO</td><td>M147</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin antibody</td><td>Abmart</td><td>M30109</td><td></td></tr><tr><td>SUMO1 antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-2044</td><td></td></tr><tr><td>GFP antibody</td><td>Abmart</td><td>M20004</td><td></td></tr><tr><td>Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>715-035-150</td><td></td></tr><tr><td>enhanced chemiluminescence (ECL) Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo detection and analysis of rb protein sumoylation in human cells

タンパク質の翻訳後修飾は、細胞内シグナル伝達の適切な規則のために重要です。これらの変更の間で小さなユビキチン関連の修飾子 (相撲) は様々 な遺伝子の転写、DNA 修復、タンパク質などの細胞プロセスを調整するターゲットたんぱく質のリジン残基に共有結合で結合されているユビキチン様タンパク質相互作用と低下、細胞内輸送、およびシグナル伝達。タンパク質 sumo 化を検出する最も一般的な方法は、体外で生化学的反応は、シンプルで機械的に対処するために適しているを可能にする、細菌の遺伝子組換えの付けられた蛋白質の浄化、表現に基づいてください。質問。しかし、生体内でsumo 化のプロセスの複雑さのためそれは検出細胞、特に内因性条件下で sumo 化阻害を分析してより困難です。この論文の著者らによる最近の研究では、内因性網膜芽細胞腫 (Rb) 蛋白質、細胞周期の進行の負の調節に不可欠である腫瘍のサプレッサーでは、G1 初期の特に SUMOylated を明らかにしました。本稿では、検出とひと細胞の内因性と外因性の条件下で Rb sumo 化の分析のためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは多く他相撲ターゲット蛋白質、ヒトの細胞と同様に、Rb、SUMO 化の表現型および機能調査に適しています。

細胞周期の進行中に、sumo 化 Rb 内因性を検出するため本研究最初同期 HEK293 細胞細胞周期 (G0 初期 G1 G1、S、G2/M) の 5 つの段階で本論のプロトコル セクションで説明したよう。Propidium ヨウ化フロー フローサイトメトリー解析 (図 1) に続いて核酸染色を用いた同期の品質が確認されました。次に、セルは、収集、RIPA バッファーの変化によって分離...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells at JoVE.com

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

小さなユビキチン関連の修飾子 (相撲) ファミリー蛋白質は様々 な細胞プロセスを調整するターゲット蛋白質のリジン残基に抱合します。本稿では、rb タンパク質 sumo 化ひと細胞の内因性と外因性の条件下での検出のためのプロトコルについて説明します。

生体内でRb タンパク質 sumo 化ひと細胞の検出と解析

The post-translational modifications of proteins are critical for the proper regulation of intracellular signal transduction. Among these modifications, ...

in-vivo-detection-analysis-rb-protein-sumoylation-human

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

7.2K ビュー.  Eye and ENT Hospital of Fudan University. 小さなユビキチン関連の修飾子 (相撲) ファミリー蛋白質は様々 な細胞プロセスを調整するターゲット蛋白質のリジン残基に抱合します。本稿では、rb タンパク質 sumo 化ひと細胞の内因性と外因性の条件下での検出のためのプロトコルについて説明します。

ビデオ: In Vivo Detection and Analysis of Rb Protein SUMOylation in Human Cells

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

生化学

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. This method utilizes a recombinant modified SUMO-trapping protein fragment, kmUTAG, derived from the Ulp1 SUMO protease of the stress-tolerant budding yeast Kluyveromyces marxianus. We have adapted the properties of the kmUTAG for the purpose of studying sumoylation in a variety of model systems without the use of antibodies. For the study of SUMO, KmUTAG has several advantages when compared to antibody-based approaches. This stress-tolerant SUMO-trapping reagent is produced recombinantly, it recognizes native SUMO isoforms from many species, and unlike commercially available antibodies it shows reduced affinity for free, unconjugated SUMO. Representative results shown here include the localization of SUMO conjugates in mammalian tissue culture cells and nematode oocytes.

SUMO is an essential and highly conserved, small ubiquitin-like modifier protein. In this protocol we are describing the use of a stress-tolerant recombinant SUMO-trapping protein (kmUTAG) to visualize native, untagged SUMO conjugates and their localization in a variety of cell types.

蛍光相撲捕集タンパク質を用いた SUMO 修飾タンパク質の局在化

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in liver cancer, the modification by SUMO (Small Ubiquitin MOdifier) has been given the most attention. Isolation of endogenous SUMOylated proteins in vivo is challenging due to the presence of active SUMO-specific proteases. Initial studies of SUMOylation in vivo were based on the molecular detection of specific SUMOylated proteins (e.g., by western blot). However, in many cases, antibodies, generally made with non-modified recombinant protein, did not immunoprecipitate SUMOylated forms of the protein of interest.&#160;Nickel chromatography has been the other approach to study SUMOylation by capturing histidine-tagged versions of SUMO molecules. This approach is mainly used in cells stably expressing or transiently transfected with His-SUMO molecules. To overcome these limitations, SUMO-binding entities (SUBEs) were developed to isolate endogenous SUMOylated proteins. Herein, we describe all the steps required for the enrichment, isolation, and identification of SUMOylated substrates from human hepatoma cells and hepatic tissues from a liver cancer mouse model by using SUBEs. Firstly, we describe methods involved in the preparation and lysis of the human hepatoma cells and liver tumor tissue samples. Then, a thorough explanation of the preparation of SUBEs and controls is detailed along with the protocol for the protein pull-down assays. Finally, some examples are provided regarding the options available for the identification and characterization of the SUMOylated proteome, namely the use of western-blot analysis for the detection of a specific SUMOylated substrate from liver tumors or the use of proteomics by mass spectrometry for high-throughput characterization of the SUMOylated proteome and interactome in hepatoma cells.

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Here, we present a protocol to enrich, isolate, identify, and characterize proteins modified by SUMO in vivo both from human hepatoma cells and liver tumors obtained from mouse models of hepatocellular carcinoma by using SUMO-binding entities (SUBEs).

肝癌における相撲プロテオームの濃縮、単離、同定、特性評価のためのツールとしての相撲結合エンティティ(SES)

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

タンパク質のユビキチン化の検出

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

生物学

ユビキチン化、SUMO化、およびADPリボシル化DNA-タンパク質架橋の測定

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

著者スポットライト:DNAタンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

生体内でRb タンパク質 sumo 化ひと細胞の検出と解析

要約

さらに動画を探す

この動画の章

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

蛍光相撲捕集タンパク質を用いた SUMO 修飾タンパク質の局在化

肝癌における相撲プロテオームの濃縮、単離、同定、特性評価のためのツールとしての相撲結合エンティティ(SES)

ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

タンパク質のユビキチン化の検出

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

DNA-タンパク質架橋とその翻訳後修飾の定量的検出

レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

出芽酵母動原体タンパク質Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出を可能にするタンパク質の精製技術