この調査は、2つの国立衛生研究所（HL089447）（「肥満およびOSA：舌脂肪および代謝機能の重要性の理解」）およびHL094307（「肥満および舌脂肪の関係の理解」）によって支持された

動物被験者を含むすべての手順は、ペンシルバニア大学の機関動物管理および使用委員会（IACUC）（議定書番号805822）によって承認されている。記載された手順は終末であり、無菌状態または医薬グレードの製品の利用を必要としない。 1.外科的処置<img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56006/56006fig1.jpg" /> 図1：手術手順。 （A）手術計画の境界。赤い破線は、切開の面積を示す。 2本の黒い線は顎の位置を示し、下の黒い線は胸郭の位置を示す。青い線は舌骨を示しています。 （B）脂肪組織、舌下およびサブマックスの鈍的切開後の胃の腹部（矢印）の曝露<html>アリー腺。 （C）舌下神経を露出させるために胃の腹部の腹部の切除（破線の緑色の線）（白い矢印）。 （D）舌下神経（白矢印）は、周囲の筋膜から除去される。 （E）気管は周囲の平滑筋を静かに引き離して（緑色の矢印は力の方向を示す）、挿管準備のために持ち上げ（F）して気管を露出させる。星は、舌骨が舌骨に挿入されたことを示します。緑色の破線は、挿管のための切開部を示す。白い矢印は、挿入されたカニューレを所定の位置に固定するために準備されたゆるい結び目を示す。 （G）カニューレ挿入のための気管切開。 （H）気管カニューレを挿入し、正方形の結び目で所定の位置に固定する。 （I）舌への縫合糸の適用。target = &quot;_ blank&quot;&gt;この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 <ol><li> 麻酔と手術準備 <ol><li> 4％イソフルラン麻酔で誘導チャンバーにラットを置きます。 </li><li>動物の仰臥位を熱源に置き、1〜3％のイソフルランで麻酔を維持し、毎分70回以上の呼吸を確保する。 </li><li>エアークリッパーと脱毛クリームで頸部を剃る。脱毛クリームを使用するときは、毛皮が取り除かれるまで、コットンチップアプリケータでクリームを広げます。長時間の脱毛クリームへの暴露は、皮膚の刺激を引き起こす可能性があります。 </li><li>手術野を70％アルコールで洗浄する（ 図1A ）。 </li><li>最初の切開を続行する前に、動物の呼吸パターンと反射（つま先のピンチ反射がない）を確認してください。継続的な麻酔深度のモニタリングと評価は不可欠です脊髄呼吸数および10分ごとの反射の欠如）;手術中に麻酔の深い外科手術面の下に動物を置く必要があります。 </li></ol></li><li> 下肢神経識別 <ol><li> 図1Aの赤い点線で示すように、皮膚を切除して取り外すことにより、手術用はさみで手術野を開きます 。 </li><li>脂肪組織、舌下および顎下腺、ならびに気管を取り囲む筋層を通って鈍化させる。 注：解剖中に慎重にしてください。可能な限り鈍的な切開を使用し、首の血管を傷つけないように注意してください。 </li><li>気管の側方の胃の腹部（PD）を特定する（ 図 1B-白い矢印）。舌下神経はこの筋肉の下を走る（ 図1C-白い矢印）。電気焼灼器を用いて、PDプロキシを切除する（ 図 1C-破線）。 注：周囲の神経や組織が乾燥しないようにしてください。それを保護するために神経に鉱物油の滴を加えなさい。電極からの刺激の電界伝播による筋収縮を避けるために、神経周囲の可能性のある接触部位の筋肉組織を慎重に焼灼する。 </li><li>微細な鉗子のペアを使用して、周囲の筋膜から舌下神経を切開する。フックの助けを借りて、双極電極（ 図1D ）の接続のために少なくとも3mmの神経が利用可能であることを確認する。 </li><li>マイクロ止血鉗子を使用して、刺激の逆行伝搬を避けるために、可能な限り舌骨（ 図1D-白い矢印）から遠位に舌下神経を圧潰する。マイクロ止血鉗子で5秒間圧迫して神経を粉砕します。止血鉗子が神経をつかむと、簡単なt舌の底にある魔女が目に見えるはずです。 </li><li>もう一方の手順を繰り返します。 </li></ol></li><li> 気管挿管 <ol><li>周囲の平滑筋を鈍い切開によって静かに分離して気管を露出させる（ 図1E-緑色の矢印で示す）。 注意：控えめで、鈍的な切開を優先的に使用してください。カニューレの直径と気管の直径を比較する。カニューレは気管内に正確に収まるはずであり、ステップ1.3.2から1.3.5で説明されているように縫合された後、安定して挿入されたままでなければならない。 </li><li>静かに縫合糸鉗子のペアを使用して気管を持ち上げ、胸郭の近くに、その下に4から0の縫合を渡す。喉頭から6番目と7番目のリングの間に最初の緩い結び目を結ぶ（ 図1F-白い矢印）。この結び目はカニューレが挿入されると閉鎖され、カニューレは所定の位置に保持される。 </li><li>茎のスライド気管の下に移送ピペット（鉱油でピペットを潤滑して挿入を容易にする）を行い、カニューレ（IV 14 gx 3.25 &quot;カニューレ）の挿入を容易にする。 </li><li>喉頭から4番目と5番目のリングの間に小さな切開を切る（ 図1G-白い矢印）。最初の切開後、開口部は広がる傾向があるので、気管の完全切除を避けるために最初の切開を行う際には控えめである。 注：気管切開を行う前に、カニューレの準備が整っており、麻酔が行われていることを確認してください。 </li><li>カニューレを通して麻酔投与を開始し、約5リングの長さの気管内を穏やかに前進させて切開部に静かに挿入する。気密シールを作成するために、カニューレを縫合糸で固定します（ 図1H ）。 注：痛みを避けるために、ニックの入った気管に液体が入っていないことを確認してください。気管が切開されると、動物は室内の空気を呼吸します。したがって、麻酔の送達が維持されるようにカニューレを迅速に挿入することが重要である。動物を動かす場合は、気管内のカニューレの正確な位置を監視します。 </li><li>動物をノーズコーンから静かに取り出します。 注：イソフルランの代わりに注射可能な麻酔薬を使用すると、気管挿管の必要性を排除し、過剰な管から実験的作業空間を取り除くことによって手順を単純化することができる。 </li></ol></li><li> 舌の縫合 <ol><li> 20cmの長さの5/0縫合糸を浸す（我々は、シルク、黒の編組をPBSで推奨する）。 </li><li>ラットの口を開けたまま、舌の先端を縫合糸鉗子で静かに保持する。 </li><li>潜在的な組織を避けるために舌を生理食塩水で湿らせておくために注意を払って、舌の先端を通して縫合糸を内側に通す（ 図1I-白い矢印）損傷。 </li><li>約4cm幅のループを結ぶ（直径は、動物と力トランスデューサとの間の距離に基づいて変化し得る）。 注：挿入を容易にし、組織の不要な病変を避けるために、縫合糸と舌が濡れていることを確認してください。 </li></ol></li></ol> 2.実験的セットアップ<img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56006/56006fig2.jpg" /> 図2：動物の配置と保護。 （A）マウスを実験プラットフォーム上に置く。顎は固定され、垂直の張力（緑の矢印）の適用によって口が開いたままに維持される。縫合ループは、力トランスデューサ（白い矢印）に接続されています。 （B）電極が接続されている。 （C）マイクロマニピュレータに取り付けられた各電極は、安定して神経に接続されている。インレイは、tの終了を示す彼はフック電極。 （D）舌の最適な長さは、舌骨のレベルまでの挿入から舌の先端までのバーニアキャリパーで測定される。この画像では、明確にするために電極を除去した。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56006/56006fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> 注：実験中の動きを避けるために、以下の固定手段を使用して、動物の仰臥位を装置の加熱トレイに置く。 <ol><li>加熱されたプラットフォーム（ 図2A 、 2B ）に直接接続されたプラスチックでコーティングされた金属のツイストタイを使用して、ラットの鼻をトレイに固定します。 </li><li>垂直張力をかけることによって開けられたラットの口を維持する（9kgの試験モノフィラメントラインに結合された3ウェイスイベルを使用し、カメラスティックで所定の位置に保持する）（ 図2A-緑色の矢印）。 注：ラットを安定化させるための別のアプローチは、齧歯類の口渇きまたはそのカスタム修正を使用することです。測定の質に影響を与える可能性のある首の動きを避けるために、口が開いて安定して維持されることが不可欠です。 </li><li>縫合ループを力トランスデューサに接続します（ 図2A - 白い矢印）。 </li><li>外科用テープを使用して、ラットの四肢および腹部を固定し、刺激中の動きを制限する。 </li><li> 2つの刺激フック双極電極を解剖された舌下神経に、クラッシュ部位の近位に適用する（ 図2C ）。 <ol><li>プラスチック製のサポート（ここでは、2本の1mLの血清学的ピペットを一緒に使用しています）を使用して、互いに2mmの距離で一緒に保持された、外科用グレードの鋼製29ゲージ針電極の対から作られた刺激性の双極電極を使用してください。 </li><li>ニードル電極の先端をフック状に曲げる神経との安定した接触を形成するのに十分小さい（ 〜1mm直径）（ 図2C-インレイ）。 </li><li>各電極の2本のワイヤーをバナナジャック×BNCジャック付きの積み重ね可能なダブルバインディングポストに接続し、BNCスプリッターを使用してインサイチューマッスルテストシステム（表3）の刺激モジュールに接続します。 注記：動物が安定していること、および首と舌が力変換器のレバーに揃っていることを確認してください。呼吸数のモニタリングを続け、拘束具が呼吸を妨げないようにします。 </li></ol></li></ol> 3.最適長（L 0 ）および最大等配力決定<ol><li>舌の長さを徐々に調整し、最大の力が得られるまで等尺性の痙攣刺激を適用する。 <ol><li>等尺性収縮力（ 表1 ）が最大となる長さとしてL 0を定義し、その後の正規化について記録する力の測定は、すべての動物のために変わる。バーニアキャリパーを使用して、舌骨の高さ（ 図2D ）から舌の先端までの舌の長さを測定します。 注：電極の正しい位置は、神経との最適な接触を確保するために不可欠です。最適なポジショニングは、2つの神経の一方または両方を刺激するときに、同様の相加的な力を発揮すべきである。 </li></ol></li><li>実験を開始する前に、両方の電極を刺激装置に接続し、試験用破傷風刺激を投与する（ 表1 ）。この収縮の間に、動物が位置が安定していることを確認し、首筋の望ましくない目に見える収縮をチェックする。 </li><li>痙攣を20秒後に続いて破傷風を適用することによって等尺性力を測定する。刺激サイクルの間に4分間の回復を可能にするように刺激を3回反復する（サイクルは1つのツイッチを含み、e破傷風刺激）、最大の攣縮と破傷風力を記録する。 </li><li>収縮の間に数滴のPBSを塗布することにより、常に舌を濡らしてください。 注：頚部の筋肉が収縮する場合は、周囲の筋肉組織に触れないように慎重に電極の位置を変更し、必要に応じて電極と接触している組織を焼灼します。 </li></ol>粘弾性測定（リサージュ曲線） <ol><li>等尺性力測定後、舌を3〜5分間休ませる。リサージュ曲線をL 0から開始して実行します 。したがって、動物と力トランスデューサの位置は決して変更しないでください。 </li><li>舌下神経を刺激することなく、L 0の 5,10,15,20,25,30,35,40,50％の増加する変位（d）を有する受動的伸長（ 表2 ）のサイクルを適用する（振幅が高い場合、 higheとモードコントローラr逸脱値は305C-LRよりも大きい）。例えば、40％L 0の振幅は、舌の変形を+ 20％L 0から-20％L 0にもたらす。 <ol><li>サイクルごとに10回の繰り返しで固定2Hzのサイン周波数を使用し、サイクルごとに合計5秒間使用します。正弦周波数の変化は、過去にダイアフラム24のような組織で使用されており、実験プロトコルを変更するために採用することができた。 </li><li>各サイクルの間に30秒間おき、全工程中に舌が濡れるようにします。 注：手順中に舌を濡らし、PBSを数滴加えてください。伸びの間、特に変位が40％以上に達したときに、顎を保持する拘束具が安定して定位置に留まるようにしてください。 </li></ol></li><li>実験が終了した直後に、動物がまだ麻酔の深い手術面の下にある間に、認可されたIACUC動物プロットに従って動物を安楽死させるocol。さらなる処理（ すなわち、凍結切片または生化学分析のための保存）のために舌を解剖する。 </li></ol>

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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tongue+muscle+plasticity+following+hypoglossal+nerve+stimulation+in+aged+rats.">Tongue muscle plasticity following hypoglossal nerve stimulation in aged rats.</a> Muscle &amp; nerve. 47 (2), 230-240 (2013).</li><li>Brady, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AlphaB-crystallin+in+lens+development+and+muscle+integrity:+a+gene+knockout+approach.">AlphaB-crystallin in lens development and muscle integrity: a gene knockout approach.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (12), 2924-2934 (2001).</li><li>Spassov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+myosin+heavy+chain+isoforms+in+the+masticatory+muscles+of+dystrophin-deficient+mice.">Differential expression of myosin heavy chain isoforms in the masticatory muscles of dystrophin-deficient mice.</a> Eur J Orthod. , ciq113 (2010).</li><li>Lever, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Videofluoroscopic+Validation+of+a+Translational+Murine+Model+of+Presbyphagia.">Videofluoroscopic Validation of a Translational Murine Model of Presbyphagia.</a> Dysphagia. 30 (3), 328-342 (2015).</li><li>Gantois, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+D1+dopamine+receptor-expressing+cells+generates+mice+with+seizures,+dystonia,+hyperactivity,+and+impaired+oral+behavior.">Ablation of D1 dopamine receptor-expressing cells generates mice with seizures, dystonia, hyperactivity, and impaired oral behavior.</a> Proc Natl Acad Sci. 104 (10), 4182-4187 (2007).</li></ol>

著者は何も開示することはない。

舌代謝および/または組成、 例えば肥満の結果としての舌脂肪浸潤の変化は、本発明者らのプロトコルによって評価されるパラメータの定量化可能な変化を引き起こすと予測される。舌の力の定量化は大きな関心事である。何故ならば、突き出る活動と後退する活動との間の不均衡または全体的な舌の弱化は、上気道15の閉塞をもたらし得るからである。ラット<sup clas...

<html>舌は、咀嚼、嚥下、味覚センシング、および発言に不可欠なサポートを提供します。明確な神経支配および解剖学的/機能を有する外因性および内因性の筋肉の存在は、この筋肉質のハイドロスタットの特異性を説明する。最近の画像技術の進歩により、その複雑な解剖学的構造1のより詳細な図が提供されている1 。舌機能の低下、舌の萎縮、嚥下障害および言語障害は、パーキンソン2 、筋萎縮性側索硬化症（ALS） 3 、筋緊張性ジストロフィー（MD） 4および他のミオパチーのような筋障害状態の共通症状でもある。 一般的な疾患状態に関連する筋肉組成の変化は、舌の機械的特性および粘弾性特性に影響を及ぼす。例えば、舌力の機能解析は、老化に伴う収縮特性の変化を明らかにしているss = &quot;xref&quot;&gt; 5,6 、低酸素症7,8および肥満9,10 。筋ジストロフィーの場合、線維化の増加はより高い筋肉の剛性をもたらし、リサジューの変形プロトコルが適用されたときの変形に対する適合性が低下する。逆に、肥満患者に記載されているような筋肉脂肪含量の変化は、骨格筋13,14の代謝および機械的特性の両方を変化させ、変形に対する筋肉コンプライアンスを増加させると予測される。舌脂肪の増加はまた、部分上気道閉塞（無呼吸）の点まで舌体積を増加させることによって、ヒト17における閉塞性睡眠時無呼吸（OSA）の発症と相関する15,16 。シムヒトと同様に、舌脂肪の浸潤は肥満のZuckerラット10に記録されており、このモデルは脂肪の浸潤が舌の生理作用に及ぼす影響を研究する貴重なツールであることを示唆している。 舌の力を測定するには、舌下神経17,18を分離して両側に刺激するために繊細な外科的技術が必要である。このような技術は、ラット5,17,19,20、ウサギ21およびヒト22,23 において以前に記載されているが、研究者に視覚補助は限られている。その高度な技術的性質のために、詳細なプロトコルの利用可能性は、この技術のアクセス可能性および再現性を著しく改善する。実験的なパラダイムの目標は、病気ラットモデルの舌の強度と粘弾性を測定するための有効で信頼性の高い技術を習得します。これを達成するために、ラットを麻酔し、舌下神経を露出させ、気管にカニューレを挿入して動物の舌に自由に接近させる。次いで、縫合ループは、舌の先端を、力と長さの両方を制御することができる力トランスデューサに接続し、一方、2つの双極フック電極は、舌下神経を刺激して舌の収縮を誘発する。力測定が完了した後、一定の振幅（リサージュ曲線）、持続時間および周波数を有する正弦波プロトコルに従って、力変換器の長さ制御能力を用いて舌の長さを迅速に変化させ、その粘弾性11,24。このプロトコールは、解剖ステップ、実験動物の位置付けrm、電極の配置、および最後に力および粘弾性データの取得および分析に至る。

<table><tbody><tr><td>SurgiSuite (heated Surgical tray)</td><td>Kent Scientific</td><td>SurgiSuite-LG</td><td>Includes heated platform</td></tr><tr><td>LED Lighting and Magnification Kit</td><td>Kent Scientific</td><td>SURGI- 5003</td><td></td></tr><tr><td>RC&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Rodent Circuit Controller</td><td>VetEquip</td><td>922100</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butler Schein Animal Health Supply</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol Prep</td><td>Webcol</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>Cotton-tipped applicators</td><td>MediChoice</td><td>WOD1002</td><td></td></tr><tr><td>Hair clipper</td><td>Conair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hair remover lotion</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medical tape</td><td>Transpore</td><td>3M</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Corning</td><td>21-030-CM</td><td></td></tr><tr><td>Operating Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>503717-12</td><td></td></tr><tr><td>Hemostatic Forceps</td><td>Merit</td><td>97-458</td><td>Any tissue forceps can be used instead</td></tr><tr><td>Microdissecting Forceps, Angled, Serrated, 10.2 cm, SS</td><td>World Precision Instruments</td><td>504479</td><td></td></tr><tr><td>Suture Tying Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>18025-10</td><td></td></tr><tr><td>Blunt Micro Hook</td><td>Fine Science Tools</td><td>10062-12</td><td></td></tr><tr><td>Microhemostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>12075-14</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cautery</td><td>WPI</td><td>501292</td><td>Disposable cauteries are available at lower cost</td></tr><tr><td>IV 14g x 3.25&quot; cannula</td><td>BD</td><td>B-D382268H</td><td>For tracheal cannulation</td></tr><tr><td>Braided silk non-absorbable suture size 4-0</td><td>Harvard Apparatus</td><td>SP104</td><td>For stabilization of the tracheal cannula</td></tr><tr><td>Braided non-absorbable silk 5/0 suture</td><td>Surgik LC, USA</td><td>ESILRC15387550</td><td>For suturing the tongue</td></tr><tr><td>Plastic-coated metal twist-tie (or electrical wire)</td><td></td><td></td><td>For securing the rat&#039;s nose to the platform</td></tr><tr><td>Camera stick</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 way-swivel and Trilene 9 Kg test monofilament line</td><td>Berkley</td><td></td><td>For securing the jaw and maintaining the mouth open</td></tr><tr><td>Camera stick with adjustable angle</td><td></td><td></td><td>For supporting the 3 way-swivel and maintaining the mouth open.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt; Muscle Test System</td><td>Aurora Scientific</td><td>809C</td><td>This system is designed for mice and was modified by extending the platform. Alternatively the rat-specific 806D system can be used.</td></tr><tr><td>Dual-Mode Muscle lever (force transducer)</td><td>Aurora Scientific</td><td>305C-LR</td><td>309C offers higher excursion capabilities than 305C-LR. Link for more information and specifications: http://aurorascientific.com/products/muscle-physiology/dual-mode-muscle-levers/</td></tr><tr><td>Needle Electrodes (surgical steel, 29 gauge)</td><td>AD Instruments</td><td>MLA1204</td><td>300C is recommended for use in mice.</td></tr><tr><td>Magnetic Stands</td><td>World Precision Instruments</td><td>M10</td><td>Used for making the bipolar stimulating hook electrodes</td></tr><tr><td>Kite Manual Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>KITE-R and KITE-L</td><td>Require a steel plate</td></tr><tr><td>Stackable Double Binding Post with Banana Jack x BNC Jack</td><td>McMaster Carr</td><td>6704K13</td><td></td></tr><tr><td>Carbon fiber composites digital caliper</td><td>VWR</td><td>36934-152</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo evaluation of the mechanical and viscoelastic properties of the rat tongue

舌は、ほとんどの脊椎動物の口の床に高度に神経支配され、血管新生された筋肉静止画である。主な機能には、咀嚼と嚥下のサポート、味覚と音韻のサポートが含まれます。したがって、舌の強度および体積は、脊椎動物が摂食、伝達および呼吸などの基本的な活動を達成する能力に影響を及ぼす可能性がある。睡眠時無呼吸のヒト患者は、舌を大きくし、筋緊張の低下および筋内脂肪の増加を特徴とし、磁気共鳴映像法（MRI）によって視覚化および定量化することができる。舌の力発生および粘弾性を測定する能力は、画像化データと相関する機能的情報を得るための重要なツールを構成する。ここでは、麻酔下のZuckerラットにおける舌下神経の電気刺激による舌力産生の測定技術および粘弾性特性の決定技術を紹介するf受動的なリサージュ力/変形曲線を適用して舌を形成する。

<img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56006/56006fig3.jpg" /> 図3：代表的な結果。 （A）成功した攣縮と破傷風の跡の例。対応する刺激は、赤い痕跡によって表される。 （B）極大収縮（青色痕跡）および頚部筋肉の間接刺激による舌の破裂収縮の失敗の例。両方の状態は、刺激電極の位置を変えることによって、または電...

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In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

我々は、舌の筋緊張および粘弾性を決定するための麻酔したラットモデルにおける外科的処置を記載する。この手順は、舌下神経の特異的刺激、および受動的リサージュ力/変形曲線の筋肉への適用を含む。

ラット舌の機械的および粘弾性的特性のインビボ評価

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

in-vivo-evaluation-mechanical-viscoelastic-properties-rat

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

8.7K ビュー.  University of Pennsylvania. 我々は、舌の筋緊張および粘弾性を決定するための麻酔したラットモデルにおける外科的処置を記載する。この手順は、舌下神経の特異的刺激、および受動的リサージュ力/変形曲線の筋肉への適用を含む。 

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Meal Duration as a Measure of Orofacial Nociceptive Responses in Rodents

A lengthening in meal duration can be used to measure an increase in orofacial mechanical hyperalgesia having similarities to the guarding behavior of humans with orofacial pain. To measure meal duration unrestrained rats are continuously kept in sound attenuated, computerized feeding modules for days to weeks to record feeding behavior. These sound-attenuated chambers are equipped with chow pellet dispensers. The dispenser has a pellet trough with a photobeam placed at the bottom of the trough and when a rodent removes a pellet from the feeder trough this beam is no longer blocked, signaling the computer to drop another pellet. The computer records the date and time when the pellets were taken from the trough and from this data the experimenter can calculate the meal parameters. When calculating meal parameters a meal was defined based on previous work and was set at 10 min (in other words when the animal does not eat for 10 min that would be the end of the animal&#39;s meal) also the minimum meal size was set at 3 pellets. The meal duration, meal number, food intake, meal size and inter-meal interval can then be calculated by the software for any time period that the operator desires. Of the feeding parameters that can be calculated meal duration has been shown to be a continuous noninvasive biological marker of orofacial nociception in male rats and mice and female rats. Meal duration measurements are quantitative, require no training or animal manipulation, require cortical participation, and do not compete with other experimentally induced behaviors. These factors distinguish this assay from other operant or reflex methods for recording orofacial nociception.

A lengthening in meal duration represents orofacial nociceptive behavior in rodents similar to the guarding behavior of humans with orofacial pain. Eating is a behavior that requires no training or animal manipulation, requires cortical participation, and is not competing with other experimentally induced behaviors, distinguishing this assay from alternative reflex or operant measurements.

げっ歯類におけるオロ顔面ノシチブ応答の尺度としての食事期間

A lengthening in meal duration can be used to measure an increase in orofacial mechanical hyperalgesia having similarities to the guarding behavior of ...

行動学

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a high resolution X-ray microscope, thus enabling visualization of internal structural elements under simulated physiological loads and wet conditions. Experimental specimens will include intact bone-periodontal ligament (PDL)-tooth fibrous joints. Results will illustrate three important features of the protocol as they can be applied to organ level biomechanics: 1) reactionary force vs. displacement: tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics: geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. from concentric to eccentric loads. Efficacy of the proposed protocol will be evaluated by coupling mechanical testing readouts to 3D morphometrics and overall biomechanics of the joint. In addition, this technique will emphasize on the need to equilibrate experimental conditions, specifically reactionary loads prior to acquiring tomograms of fibrous joints. It should be noted that the proposed protocol is limited to testing specimens under ex vivo conditions, and that use of contrast agents to visualize soft tissue mechanical response could lead to erroneous conclusions about tissue and organ-level biomechanics.

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In this study, the use of an in situ loading device coupled with micro-X-ray computed tomography for fibrous joint biomechanics will be discussed. Experimental readouts identifiable with an overall change in joint biomechanics will include: 1) reactionary force vs. displacement, i.e. tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics, i.e.&#160;geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. concentric or eccentric loads.

その場圧縮負荷と骨歯根膜歯繊維状合同の相関的非侵襲的イメージングで

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a ...

生物工学

Assessment of Midline Lingual Point-Pressure Somatosensation Using Von Frey Hair Monofilaments

Detection and discrimination threshold estimates for oral point pressure are assessed using Von Frey Hair monofilaments. Consistent with previously published protocols, threshold estimates are determined using a two-interval forced choice (2-IFC) paradigm with a three down/one up approach. Detection threshold estimates determine the mean force in which a participant can identify the presence of pressure. During the detection threshold procedure, the participant is instructed to choose which of two sequentially presented observation intervals contained the tactile test stimulus. If the participant performs three correct detections in a row (i.e., 3 &#39;hits&#39;), the researcher decreases the stimulus to the next lower target force level. With one incorrect detection (a &#39;miss&#39;), the researcher increases the force delivered to the next higher level. This threshold estimation approach is known as a 3-down/1-up adaptive staircase. Reponses are recorded on a paper ballot, and a participant&#39;s estimated threshold is defined as the geometric mean of five reversals. During the discrimination threshold procedure, the participant is asked to make a choice between two serially presented stimuli as to which is the &#34;harder&#34; or &#34;stronger&#34; pressure. The same scoring of &#39;hits&#39;, &#39;misses&#39;, and stopping points are used. Detection and discrimination testing for oral point pressure at tongue midline takes approximately 20 min to complete. Using these commercially-available clinical tools, individual touch sensation profiles for the midline tongue can be achieved in a relatively time and cost effective means.

This work describes a standard method to assess tactile sensation at the midline of the tongue tip. Using Von Frey Hair (VFH) monofilaments, this protocol provides estimates of detection and discrimination threshold estimates for oral point pressure (OPP).

フォン・フレイヘアモノフィラメントを用いた正中リンガルポイント血圧間感覚の評価

Detection and discrimination threshold estimates for oral point pressure are assessed using Von Frey Hair monofilaments. Consistent with previously ...

Measuring Changes in Tactile Sensitivity in the Hind Paw of Mice Using an Electronic von Frey Apparatus

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain perception in rodents. Withdrawal thresholds can be measured first at baseline and then following drug, venom, injury, allergen,&#160;or otherwise evoked inflammation by applying an accurate force on very specific areas of the skin. An electronic von Frey apparatus allows precise assessment of mouse hind paw withdrawal thresholds that are not limited by the available filament sizes in contrast to classical von Frey measurements. The ease and rapidity of measurements allow for incorporation of assessment of tactile sensitivity outcomes in diverse models of rapid-onset inflammatory and neuropathic pain as multiple measurements can be taken within a short time period. Experimental measurements for individual rodent subjects can be internally controlled against individual baseline responses and exclusion criteria easily established to standardize baseline responses within and across experimental groups. Thus, measurements using an electronic von Frey apparatus represent a useful modification of the well-established classical von Frey filament-based assays for rodent mechanical allodynia that may also be applied to other nonhuman mammalian models.

Electronic von Frey measurements are an effective and improved alternative to classical von Frey filaments, as they allow rapid and precise measurement of changes in rodent mechanical withdrawal thresholds to continuously applied pressure stimuli before and after an inflammatory event.

Measuring inflammation-induced changes in thresholds of hind paw withdrawal from mechanical pressure is a useful technique to assess changes in pain ...

神経科学

Assessment of Spatial Lingual Tactile Sensitivity using a Gratings Orientation Test

Individual thresholds by R-index estimates are calculated using a gratings orientation test (6 different tools of increasing grating size from 0.20-1.25 mm) to assess spatial lingual tactile sensitivity. During the experiment, the subjects are blindfolded and asked to specify the orientation of the grating (either horizontal or vertical) placed on the tongue. R-index is based on Signal Detection Theory (SDT), and it is an estimated probability of correctly identifying a target stimulus (the signal, e.g., the correct orientation) compared to an alternative stimulus (the noise, e.g., the incorrect orientation). Once the R-index values for each subject and each tool dimension are calculated, it is possible to derive the individual threshold by interpolating the two R-indices immediately below and above the established cut-off (typically 75%) based on one-sided R-index critical values. This procedure can be helpful in the medical field to study the association between oral tactile sensitivity, speech clarity, and swallowing disorders, as well as in sensory and consumer studies to explore individual variation in texture perception, food preferences, and eating behavior.

This work illustrates a standard procedure and threshold determination by the R-index to assess spatial lingual tactile sensitivity using a gratings orientation test.

格子方位検定による空間言語触覚感度の評価

Individual thresholds by R-index estimates are calculated using a gratings orientation test (6 different tools of increasing grating size from 0.20-1.25 ...

Assessment of Nerve Injury-Induced Mechanical Hypersensitivity in Rats Using an Orofacial Operant Pain Assay

Pain has sensory and affective components. Unlike traditional, reflex-based pain assays, operant pain assays can produce more clinically relevant results by addressing the cognitive and motivational aspects of pain in rodents. This paper presents a protocol for assessing mechanical hypersensitivity following chronic constriction injury of the infraorbital nerves (CCI-ION) in rats using an orofacial operant pain system. Before CCI-ION surgery, rats were trained in an orofacial pain assessment device (OPAD) to drink sweetened condensed milk while making facial contact with the metal spiked bars and lick-tube.
In this assay, rats can choose between receiving milk as a positive reinforcer or escaping an aversive mechanical stimulus that is produced by a vertical row of small pyramid-shaped spikes on each side of the reward access hole. Following 2 weeks of training in the OPAD and before the CCI-ION surgery, baseline mechanical sensitivity data were recorded for 5 days for each rat during a 10 min testing session. During a session, the operant system automatically records the number of reward bottle activations (licks) and facial contacts, contact duration, and latency to the first lick, among other measures.
Following baseline measurements, rats underwent either CCI-ION or sham surgery. In this protocol, mechanical hypersensitivity was quantified by measuring the number of licks, latency to the first lick, the number of contacts, and the ratio of licks to facial contacts (L/F). The data showed that CCI-ION resulted in a significant decrease in the number of licks and the L/F ratio and an increase in the latency to the first lick, indicating mechanical hypersensitivity. These data support the use of operant-based pain assays to assess mechanical pain sensitivity in preclinical pain research.

This protocol describes the assessment of mechanical hypersensitivity in a rat model of neuropathic orofacial pain using an operant-based orofacial pain assessment device.

口腔顔面オペラント疼痛アッセイを用いたラットにおける神経損傷誘発性機械的過敏症の評価

Pain has sensory and affective components. Unlike traditional, reflex-based pain assays, operant pain assays can produce more clinically relevant results ...

Cell Dissociation from the Tongue Epithelium and Mesenchyme/Connective Tissue of Embryonic-Day 12.5 and 8-Week-Old Mice

Cell dissociation has been an essential procedure for studies at the individual-cell level and/or at a cell-population level (e.g.,&#160;single cell RNA sequencing and primary cell culture). Yielding viable, healthy cells in large quantities is critical, and the optimal conditions to do so are tissue dependent. Cell populations in the tongue epithelium and underlying mesenchyme/connective tissue are heterogeneous and tissue structures vary in different regions and at different developmental stages. We have tested protocols for isolating cells from the mouse tongue epithelium and mesenchyme/connective tissue in the early developmental [embryonic day 12.5 (E12.5)] and young adult (8-week) stages. A clean separation between the epithelium and underlying mesenchyme/connective tissue was easy to accomplish. However, to further process and isolate cells, yielding viable healthy cells in large quantities, and careful selection of enzymatic digestion buffer, incubation time, and centrifugation speed and time are critical. Incubation of separated epithelium or underlying mesenchyme/connective tissue in 0.25% Trypsin-EDTA for 30 min at 37 &#176;C, followed by centrifugation at 200 x g for 8 min resulted in a high yield of cells at a high viability rate (&#62;90%) regardless of the mouse stages and tongue regions. Moreover, we found that both dissociated epithelial and mesenchymal/connective tissue cells from embryonic and adult tongues could survive in the cell culture-based medium for at least 3 h without a significant decrease of cell viability. The protocols will be useful for studies that require the preparation of isolated cells from mouse tongues at early developmental (E12.5) and young adult (8-week) stages requiring cell dissociation from different tissue compartments.

We have developed a generalized protocol to dissociate a large quantity of high-quality single cells from the epithelium and mesenchyme/connective tissue of embryonic and adult mouse tongues.

12.5日目および8週齢マウスの舌上皮・間分性/結合組織からの細胞解離

Cell dissociation has been an essential procedure for studies at the individual-cell level and/or at a cell-population level (e.g.,&#160;single cell RNA ...

発生生物学

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working with those tissues is challenging because they are very fragile, and until now there was no rigorously detailed protocol for their isolation.
Faced with these challenges, we have developed methods and instruments to facilitate manipulation of RTTs and control tissue viability, sterility and integrity. This article describes the experimental procedures used to prepare RTTs for biomechanical and mechanobiological studies. Our work is divided into four main steps: extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.
At each step, all procedures, materials and manipulations are presented in detail so that they can be easily reproduced. Moreover, the specific instruments developed are presented: a manipulation plate used to segregate RTTs, an optic micrometer to position the tissue during the cross-sectional area measurement and an anchoring system to attach the RTTs onto a bioreactor.
Finally, we describe the results obtained after multiple tests to validate our methods. The viability, sterility and integrity evaluations demonstrate that our procedures are sufficiently rigorous for manipulations of fragile tissues such as rat tail tendons.

This article describes the experimental procedures used to prepare rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies. Several features of the main steps in preparation are demonstrated, beginning with extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.

生体力学とMechanobiological研究ラット尾腱の準備

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

生物学

Viscoelastic Characterization of Soft Tissue-Mimicking Gelatin Phantoms using Indentation and Magnetic Resonance Elastography

Characterization of biomechanical properties of soft biological tissues is important to understand the tissue mechanics and explore the biomechanics-related mechanisms of disease, injury, and development. The mechanical testing method is the most straightforward way for tissue characterization and is considered as verification for in vivo measurement. Among the many ex vivo mechanical testing techniques, the indentation test provides a reliable way, especially for samples that are small, hard to fix, and viscoelastic such as brain tissue. Magnetic resonance elastography (MRE) is a clinically used method to measure the biomechanical properties of soft tissues. Based on shear wave propagation in soft tissues recorded using MRE, viscoelastic properties of soft tissues can be estimated in vivo based on wave equation. Here, the viscoelastic properties of gelatin phantoms with two different concentrations were measured by MRE and indentation. The protocols of phantom fabrication, testing, and modulus estimation have been presented.

This article presents a demonstration and summary of protocols of making gelatin phantoms that mimic soft tissues, and the corresponding viscoelastic characterization using indentation and magnetic resonance elastography.

インデンテーションと磁気共鳴エラストグラフィを用いた軟組織模倣ゼラチンファントムの粘弾性特性評価

Characterization of biomechanical properties of soft biological tissues is important to understand the tissue mechanics and explore the ...

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in the taste sensory organ. By integrating microfluidics into the intravital tongue imaging window, the &#181;Tongue provides reliable functional images of taste cells in vivo under controlled exposure to multiple tastants. In this paper, a detailed step-by-step procedure to utilize the &#181;Tongue system is presented. There are five subsections: preparing of tastant solutions, setting up of a microfluidic module, sample mounting, acquiring functional image data, and data analysis. Some tips and techniques to solve the practical issues that may arise when using the &#181;Tongue are also presented.