著者らは、低酸素室装置を提供してくれたNai-Sum Wong博士と技術サポートのためのAlice Luiさんに感謝したいと思います。

動物を含むすべての処置は、実験動物のケアおよび使用のためのNIHガイドに厳密に準拠して実施され、香港大学の医学のLi Ka Shing教授のための生きた動物の使用に関する委員会によって承認された。インフォームドコンセントを得た後、健康なドナーの腸骨稜からヒト骨髄サンプルを得た。議定書は、香港大学の制度審査委員会の承認を受けています。 1.ラットMSC培養液の調製<ol><li> 大腿骨からのMSCの収穫 <ol><li>使用前に少なくとも2時間、180°Cですべての切開ツール（ すなわち、はさみ、鋭い切開はさみ、および歯を切った鉗子）をオートクレーブする。 </li><li> 15％ウシ胎仔血清（FBS）およびペニシリン/ストレプトマイシン（P / S、1％v / v）を補充した最小限の必須培地α修飾（αMEM）を含むMSC増殖培地を調製する。）。 </li><li>ペントバルビタールの過剰投与（240mg / kg体重、腹腔内）により、若い雄Sprague Dawleyラット（体重200〜250g）を犠牲にする。 注：異なるラットの骨髄サンプルは別々に処理する必要があります。 </li><li>犠牲動物を仰臥位に置く。腹部と下肢を70％エタノールで完全にきれいにする。 </li><li>細かい切開はさみと鉗子を使用して、内側の太ももの上の皮膚と皮下組織を削除します。大腿筋が露出するまで、大腿筋を円周方向に外します。膝と股関節が見えるまで、この近位および遠位に継続する。大腿骨を股関節と膝関節に通し、鋭利な先端を切って切り取ってください。 注：この段階で大腿骨を切開して骨髄腔を露出させないでください。インタクトな大腿骨を層流組織培養フードに移し、さらなる処理を行う。 </li><li>骨幹端部を通って大腿骨の遠位端および近位端を横断するために、尖った切断されたはさみを使用する。 </li><li> 70μmセルストレーナーを50mLコニカルチューブの上に置きます。露出した大腿管にリン酸緩衝生理食塩水（PBS、10mM Na 2 HPO 4 、pH7.4）を含む21G、10mLシリンジを挿入し、洗浄を繰り返すことによって円錐管に骨髄内容物を洗い流す。 注：各大腿骨を洗い流すために約20mLのPBSを使用する。洗い流された内容物の色が血液で汚染されて濁っている場合、より大きな容積を使用することができる。 </li><li> 480 xgで5分間遠心分離して細胞を集める。上清を捨てる。細胞ペレットを10mLのMSC増殖培地に再懸濁する。 10cmの組織培養皿に細胞をプレートする。組織培養皿を細胞インキュベーター（37℃、5％CO 2 ）に入れる。メッキの最初の日を0日目として記録する。 注：遠心を含むすべてのステップで、ブレーキを最大減速に設定します。 </li></ol></li><li> MSCコロニーの設立と拡大 注：このプロトコルr骨髄腔内からMSCを選択するための手段として、組織培養プラスチック粘着性を欠く。骨髄の内容物を組織培養プラスチックに2日間付着させる。 <ol><li> 2日目に、10mLのPBSで培養プレートを3回すすぎ、非接着細胞を除去する。すすいだ後、PBSを10 mLのMSC増殖培地に交換する。細胞をPBSで洗浄し、3日ごとにMSC増殖培地を補充する。 注：MSCコロニーは、6-7日目に見えるはずです（ 図2A ）。 </li><li>増殖培地を除去し、細胞をPBSですすぐことにより、10日目までに細胞を通過させる。組換え酵素細胞解離試薬1.5mLを添加し、37℃で5分間インキュベートする。反応を中和するために3mLのMSC増殖培地を添加する。 250×gで5分間遠心分離して分離した細胞を集める。 </li><li> PBSで適切に希釈した後、血球計を用いてペレット内の細胞を定量する。 </li><li> 40,000細胞/ cm 2の密度で継代した細胞をMSC増殖培地中の10cm培養プレートに継代した。 注：ラットのMSCは継代の2日以内に80〜90％の合流に達するはずである（ 図2B ）。細胞は、最大8継代について、工程1.2.2に記載されているように継代することができる。 MSCは、免疫細胞化学および三分化分化能力を特徴とすることができる（ 図3 ） 12 。第3および第8継代の間のMSC培養物のみが、その後の低酸素プレコンディショニングおよび神経前駆細胞濃縮の対象となる。より大きい継代数のMSCは、平らな形態をとっており（ 図2C ）、十分な数の神経前駆細胞を産生しない。これらの培養物は捨てるべきです。 </li></ol></li></ol>ヒトBMSC培養物の調製<ol><li> 1mLのヒト骨髄を9mLのMSC増殖培地で希釈し、細胞を10cmの組織培養皿上に置いた。細胞培養器（37℃、5％CO 2 ）で培養物を維持する。 </li><li> 2日後に培地を除去し、10mLのPBSで培養液を3回穏やかにすすいで非接着細胞を除去する。最後のすすぎ後、PBSを除去し、10mLのMSC増殖培地と交換する。 PBSすすぎ後の培養3日ごとに増殖培地を補充する。 注：MSCコロニーは、6-7日目まで可視でなければなりません。コロニーの数は被験者によって異なる場合があります。 </li><li>ステップ1.2.2に記載されているように、10日目に細胞を通過させる。 PBSで適切に希釈した後、血球計を用いてペレット内の細胞を定量する。継代した細胞をMSC増殖培地中の10cm培養プレート上に40,000細胞/ cm 2の密度で播種する。 注：ヒトMSC（ 図2D ）は、ラットMSCと同様の形態を示し、同様に、継代の2日以内に80〜90％の合流に達するはずである。彼らは奇妙でなければならない免疫細胞化学および三重化分化のためのそれらの能力によって凍結される12 。ラットのMSCと同様に、第3および第8継代間のヒトMSCは、その後の低酸素プレコンディショニングおよび神経前駆細胞濃縮に供される。 </li></ol> 3.低酸素プレコンディショニング<ol><li>リングクランプを外した後、低酸素チャンバーの部品（ベース、フタ、トレイ）を分解し、70％エタノールで個々の部品をきれいに拭きます。チャンバ構成要素を、層流組織培養フード内に置き、UV光下で15分間滅菌する。 </li><li>低酸素プレコンディショニングの前に、培地を除去し、10mLのPBSでラットおよびヒトMSC培養物（セクション1および2）をリンスする。 PBSを、25mMのHEPESを補充した10mLのMSC増殖培地で置換する。 注：10cm皿上で培養されたMSCは、低酸素プレコンディショニングの対象となる前に80〜90％のコンフルエントに達しているはずです。 </li><li>カウルを置く低酸素室の中で皿を作る。チャンバーのコンポーネントを再構成し、リングクランプを締めます。 99％N 2 /1％O 2のガス混合物を10L /分の流速で5分間チャンバ内に流す。 </li><li>低酸素室の接続端をシールして、ガス漏れがないことを確認します。チャンバーを細胞インキュベーター（37℃、5％CO 2 ）の中に16時間置く。 </li><li>低酸素プレコンディショニングが完了したら、その後の神経前駆細胞濃縮培養に備えて培養液をチャンバーから取り出す。 </li></ol> 4.神経前駆細胞濃縮培養<ol><li> B27（2％v / v）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF、20 ng / mL）、上皮成長因子（EGF、BGF）を補充したダルベッコ変法イーグル培地/ハム栄養混合物F12（DMEM / F12） 20 ng / mL）、およびP / S（1％v / v）であった。 </li><li>ステップ1.2.2に記載されているように、低酸素プレコンディショニングラット/ヒトMSCを分離する。250×gで5分間遠心分離して分離した細胞を集める。 PBSで適切に希釈した後、血球計を用いてペレット内の細胞を定量する。 </li><li> 6,000細胞/ cm 2の密度で、神経前駆細胞および細胞を低付着性の6ウェルプレートに再懸濁する。培養物を細胞インキュベーター（37℃、5％CO 2 ）に12日間置く。 3日ごとに神経前駆細胞の75％を補充する。 注：サイズの大きい非接着性細胞クラスターは、6-7日目まで観察されるべきである。 10〜12日目までに、直径が100μm以上のニューロスフェアを観察することができます（ 図4 ）。低酸素プレコンディショニングMSCは正常酸素条件下で培養されたMSCと比較してより多くのニューロスフェアを生じるはずである9 。 </li><li> 10日目のピペットに吸引し、15 mLコニカルチューブに移すことにより、12日目に神経球を収集する。神経球を250xgで5分間遠心分離する。 注：ニューロスフェアは、ネスチンおよびGFAPなどの神経前駆マーカーについて12日目に特徴付けられた。 </li></ol> 5. DRGニューロンと共培養による運命決定シュワン細胞の作製<ol><li> 精製ラットDRGニューロンの調製 <ol><li>使用前に少なくとも2時間、180°Cですべての解剖器具（ すなわち、解剖はさみ、鉗子、2つの顕微解剖鉗子、およびマイクロダイシングハサミ）をオートクレーブする。 </li><li>ポリ-D-リシン（PDL、PBS中10μg/ mL）を含む6ウェル組織培養プレートを4℃で一晩コートする。 PDLを除去し、1ウェルあたり1.5mLのPBSですすぐ。 </li><li>プレートをラミニン（PBS中10μg/ mL）で37℃で2時間コーティングすることにより続行する。 1ウェルあたり1.5mLのPBSでプレートをすすぐ。 </li><li> B27（2％v / v）、L-グルタミン（1％v / v）、神経成長因子（NGF、20ng / mL）およびP / S（1％v / v）を補充した神経基底培地からなるDRGニューロン維持培地を調製する。 ％v / v）。 </li><li>B27（2％v / v）、L-グルタミン（1％）、NGF（20ng / mL）、P / S（1％）、フルオロデオキシウリジン（FDU、10）を補充した神経基底培地からなるDRGニューロン精製培地を調製する。 μg/ mL）、およびウリジン（10μg/ mL）である。 </li><li>妊娠中のラットを第14-15妊娠期にペントバルビタール過剰投与（240mg / kg体重、腹腔内）で屠殺する。 </li><li>犠牲動物を仰臥位に置く。 70％エタノールで腹部を完全にきれいにする。 </li><li>細かい切開はさみと鉗子を使用して、動物の下腹壁を縦に切る。解剖はさみを使用して子宮を特定し、除去する。子宮の壁を切断して胚を露出させ、抽出する。 PBSで満たされた滅菌10cm培養皿に胚を移す。培養皿を氷上に置きます。 </li><li>解剖用の胚をPBS（室温）で満たした滅菌10 cm培養皿に移し、解剖顕微鏡の下に置く。胚を伏せやすい位置に置いてください。 NOTE：白っぽい脊髄および付着したDRGは、その半透明な皮膚を介して、胚の背側に見える。 </li><li>脊髄のいずれかの側に沿ってmicrodissecting鉗子を挿入し、周囲の軟部組織から脊髄を分離し始めるために鈍的な解剖を使用してください。頚部の開口部と尻尾のスタブに沿ってマイクロ鉗子を使用して動物から脊髄を切断します。周囲の柔らかい組織からそれを解放するためにコードの腹側の面にさらに鈍的な解剖を行います。 </li><li>解放された脊髄の背側の面に残っている柔らかい組織を除去するためにマイクロダイシング鉗子を使用してください。 注：この段階では、脊髄、神経根、および付着したDRGのみが残るはずです。 </li><li> microdissecting鉗子を使用して、それらの接続神経根から個々のDRGを切り離します。 PBSを含む1.5mLの滅菌遠心分離管にDRGを移すために、1mL先端に取り付けられたピペットペンを使用する。 注：各1.5 mLチューブについて、最大100のDRGを収容できます。 </li><li> 5分間250xgでDRGを遠心分離し、組換え酵素細胞解離試薬（200μL/チューブ）にそれらを再懸濁する。 10分間インキュベートする（37℃、5％CO 2 ）。 250×gで5分間DRGを遠心分離し、上清を除去し、DRGニューロン維持培地に再懸濁する。 200μLピペットチップを用いて穏やかに粉砕することによりペレットを解離させる。適切な希釈後、血球計を用いてペレット内の細胞を定量する。 </li><li> 1ウェル当たり1.5mLのDRGニューロン維持培地中のPDL /ラミニンでコーティングした6ウェルプレートに5,000細胞/ cm 2の密度で細胞を播種する。培養2日後、DRGニューロン維持培地を除去し、PBSですすぎ、DRGニューロン精製培地で置き換える。 注：精製サイクルごとに、DRG培養物を精製培地で2日間処理し、続いてメンテナンス培地で1日間インキュベートする。 3-4回の精製サイクルの後、remすべての内因性グリアの楕円形が予想される7 。これには約14日かかります。精製された培養物は、ニューロンマーカーTUJ1に対して陽性であり、S100β発現には存在しない（ 図5 ）。 </li></ol></li><li> シュワン細胞様細胞の生成 <ol><li> β-ヘレグリン（100ng / mL）、bFGF（10ng / mL）、血小板由来成長因子（PDGF-AA、5ng / mL）、FBS（10％）、及びα-D-セレクチンを補充したαMEMからなるグリア誘導培地を調製する。 P / S（1％v / v）。 </li><li> 1ウェル当たり1.5mLのグリア誘導培地中、5〜10球/ cm 2の密度で、PDL /ラミニンでコーティングした6ウェルプレート中のセクション4で調製したニューロスフェアをプレートする。 PBSで細胞をすすいだ後、グリア誘導培地を2日ごとに交換する。 注：播種されたニューロスフェアからの細胞は、2日目までに外向きに移動することが見られる。7日目までに、移動性細胞はテーパ状の外観を有し、シュワン細胞に対する免疫陽性を示すはずであるマーカーp75ニューロトロフィン受容体（p75）およびS100β7。これらのセルはSCLCと呼ばれます。 </li></ol></li><li> SCLCとDRGニューロンとの共培養 <ol><li> DRGニューロン維持培地（ステップ5.1.4）およびグリア誘導培地（ステップ5.2.1）からなる共培養培地を1：1の体積対体積比で調製する。 </li><li> FBS（5％）、β-ヘレグリン（10ng / mL）およびP / S（1％v / v）を添加したDMEM / F12からなるシュワン細胞維持培地を調製する。 </li><li> 7日目のSCLCから培地を除去し、PBSですすぎ、37℃で5分間、組換え酵素細胞解離試薬0.5 mL /ウェルと共にインキュベートする。共培養培地中にSCLCを再懸濁する。 </li><li>適切な希釈後、血球計を用いて細胞を定量する。 </li><li> SCLCを精製されたDRGニューロン培養上に1,000細胞/ cm 2の密度でシードする。共培養を14日間維持し、培地交換は2日ごとに行う。 注：共培養の間、SCLCsは、成熟シュワン細胞の典型的な紡錘体様形態を獲得した（ 図6 ）。これらの細胞は、成長因子の回収後に表現型を維持し、 インビトロおよびインビボで軸索をミエリン化することができる7,10。シュワン細胞マーカー（ すなわち、 p75およびS100β）の陽性は、免疫蛍光によってモニターされるべきである。 </li><li>共培養が完了すると、ステップ1.2.2に記載されている通り、運命決定されたシュワン細胞を通過させる。 1ウェルあたり0.5 mLの解離試薬を使用する。適切な希釈後、血球計を用いて細胞を定量する。 </li><li>運命決定されたシュワン細胞をシュワン細胞維持培地に10,000細胞/ cm 2の密度で再懸濁する。免疫蛍光のために細胞をPDL /ラミニンでコートした6ウェルプレートに植えます。 注：共培養には必然的に線維芽細胞を採取したMSCが含まれている細胞運命7 。これらの細胞は、同時培養の完了時に運命決定シュワン細胞と一緒に継代される。この線維芽細胞の上に横たわるシュワン細胞は、他の場所で記載されているように、PBSの「コールドジェット」（4℃）ですすぎ洗いした後、容易に剥がすことができる。運命決定されたシュワン細胞は、維持培地中で1ヶ月間増殖させることができる。 </li></ol></li></ol>

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この原稿のすべての著者は、宣言するための開示がありません。

低酸素プレコンディショニングおよびニューロスフェア培養を介して神経前駆細胞を濃縮する前に、MSCの「幹細胞」を保存することが不可欠です。我々の経験から、多分化能MSCは、それらの細長い線維芽様の形態によって確実に同定され得る。対照的に、顕著な細胞骨格ストレスファイバーを有するより平らな四角形形態を採用したMSCは、容易に神経細胞運命を採用せず、廃棄すべきである?...

神経前駆細胞およびそれらの誘導体の移植は、外傷性神経損傷1,2および神経変性3,4の後の治療戦略として有望であることを示している。臨床応用の前に、i）幹/前駆細胞の自己由来源にアクセスして拡大する方法、およびii）それらを関連する成熟細胞型に導く手段を確実にすることが不可欠である3 。脊髄損傷に対する細胞療法への関心は、成体組織からの神経前駆細胞の堅牢な自己由来の細胞供給源を模索するようになった。 MSCの亜集団は、神経堤に由来し、骨髄腔から容易にアクセス可能である。これらの細胞は、ニューロンおよびグリアを生成し得る神経前駆細胞である。脳虚血の動物モデルは、低酸素症がprolを促進することを実証する<html>脳内の神経前駆細胞の発情と多分化能6 。これは、骨髄由来神経前駆細胞を拡張する手段として低酸素プレコンディショニングを利用するための基礎となった。 損傷した脊髄へのシュワン細胞の移植は、再生を促進する2 。 SCLCは、グリオジェニック因子（ すなわち、 β-ヘレグリン、bFGFおよびPDGF-AA）を補充することによってMSCから生成され得るが、表現型の不安定性を示す。成長因子の回収時に、線維芽細胞様表現型7に戻る 。表現型の不安定性は、異常な分化および発癌のリスクのために、細胞移植において望ましくない。シュワン細胞前駆体は、胚末梢神経8内の軸索束と関連しているので、我々は、精製胚DRGニューロン7を共培養SCLCに導き、ass = &quot;xref&quot;&gt; 9。成熟シュワン細胞は運命決定されており、in vitro 7,9およびin vivo 10で機能を示す 。 MSCからの神経前駆細胞の濃縮に関する我々のプロトコールは、単純かつ効率的であり、その後のアッセイのための細胞数の増加をもたらす。共培養プラットフォームを介した運命決定シュワン細胞の誘導は、グリア分化の研究、および潜在的な臨床適用のための安定かつ機能的なシュワン細胞の生成を可能にする。

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;MEM</td><td>Sigmaaldrich</td><td>M4526</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermofisher scientific</td><td>12400-024</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Thermofisher scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biosera</td><td>FB-1280/500</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher scientific</td><td>17504-001</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor (EGF)</td><td>Thermofisher scientific</td><td>PHG0313</td><td></td></tr><tr><td>Basic fibroblast growth factor (bFGF)&amp;nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-18B/100UG</td><td></td></tr><tr><td>Nerve growth factor (NGF)&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>NC011</td><td></td></tr><tr><td>Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA)</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td></td></tr><tr><td>Heregulin beta-3, EGF domain (&amp;beta;-Her)</td><td>Millipore</td><td>01-201</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigmaaldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluro-2&#039; - deoxyuridine (FDU)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine (PDL)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>P7886-1G</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermofisher scientific</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermofisher scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / streptomycin (P/S)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>10 cm plate for adherent culture</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Used for selection of MSCs by tissue culture adherence</td></tr><tr><td>6-well plate for adherent culture</td><td>TPP</td><td>92006</td><td>Used for expansion of MSCs following passaging</td></tr><tr><td>UltraLow 6-well plate for non-adherent culture</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>Used for neural progenitor enrichment</td></tr><tr><td>anti-human CD90(Thy-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>555593</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD73</td><td>BD Biosciences</td><td>550256</td><td></td></tr><tr><td>anti-human/rat STRO-1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB1038</td><td></td></tr><tr><td>anti-human nestin</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>555480</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat CD90(Thy-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>554895</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat CD73</td><td>BD Biosciences</td><td>551123</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat nestin</td><td>BD Biosciences</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>554875</td><td></td></tr><tr><td>Anti-S100&amp;beta;</td><td>Dako</td><td>Z031101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p75</td><td>Millipore</td><td>MAB5386</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFAP</td><td>Sigmaaldrich</td><td>G3893</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1)</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human nuclei</td><td>Millipore</td><td>MAB1281</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxia chamber</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer</td><td>Sigmaaldrich</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

hypoxic preconditioning of marrow-derived progenitor cells as a source for the generation of mature schwann cells

この原稿は、骨髄間質細胞（MSC）集団から神経前駆細胞を濃縮し、その後それらを成熟シュワン細胞運命に導く手段を記載している。我々はラットおよびヒトのMSCに一時的な低酸素状態（16時間酸素1％）を与え、続いて表皮成長因子（EGF）/塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）補充を伴う低付着層上のニューロスフェアとしての拡大を行った。ニューロスフェアをポリ-D-リシン/ラミニン被覆組織培養プラスチック上に播種し、β-ヘレグリン、bFGFおよび血小板由来増殖因子（PDGF）を含有する膠原性カクテルで培養してシュワン細胞様細胞（SCLC）を生成させた。 SCLCは、E14-15妊娠Sprague Dawleyラットから得られた精製背側根神経節（DRG）ニューロンを用いて、共培養によるコミットメントを2週間行った。成熟シュワン細胞は、S100β/ p75発現の持続性を示し、ミエリンセグメントを形成することができる。このようにして生成された細胞は、脊髄損傷後の自己細胞移植における応用、ならびに疾患モデリングに有用である。

我々のプロトコルの重要なステージの概要を図1に示します。要約すると、ラットおよびヒトMSCは、組織培養プラスチックの接着によって選択される。拡張されたMSCは、低酸素状態で前処理され、次いで、ニューロスフェア形成条件に供される。ニューロスフェアをプレートし、SCLCに分化させる。 SCLCは、精製されたDRGニューロンと共培養され、...

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Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

骨髄内には、神経ポテンシャルを有する骨髄間質細胞（MSC）が存在する。我々のプロトコルは、低酸素プレコンディショニングを介してこの細胞集団を濃縮し、その後それらを成熟シュワン細胞にするよう指示する。

成熟シュワン細胞の発生源としての骨髄由来前駆細胞の低酸素プレコンディショニング

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

hypoxic-preconditioning-marrow-derived-progenitor-cells-as-source-for

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.2K ビュー.  The University of Hong Kong. 骨髄内には、神経ポテンシャルを有する骨髄間質細胞（MSC）が存在する。我々のプロトコルは、低酸素プレコンディショニングを介してこの細胞集団を濃縮し、その後それらを成熟シュワン細胞にするよう指示する。 

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Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors within the oligodendrocytic cell lineage. Recently, these cells have been studied as potential source for restorative therapies in white matter diseases. Periventricular leukomalacia (PVL) is the leading cause of non-genetic white matter disease in childhood and affects up to 50% of extremely premature infants. The data suggest a heightened susceptibility of the developing brain to hypoxia-ischemia, oxidative stress and excitotoxicity that selectively targets nascent white matter. Glial restricted precursors (GRP), oligodendrocyte progenitor cells (OPC) and immature oligodendrocytes (preOL) seem to be key players in the development of PVL and are the subject of continuing studies. Furthermore, previous studies have identified a subset of CNS tissue that has increased susceptibility to glutamate excitotoxicity as well as a developmental pattern to this susceptibility. Our laboratory is currently investigating the role of oligodendrocyte progenitors in PVL and use cells at the GRP stage of development. We utilize these derived GRP cells in several experimental paradigms to test their response to select stresses consistent with PVL. GRP cells can be manipulated in vitro into OPCs and preOL for transplantation experiments with mouse PVL models and in vitro models of PVL-like insults including hypoxia-ischemia. By using cultured cells and in vitro studies there would be reduced variability between experiments which facilitates interpretation of the data. Cultured cells also allows for enrichment of the GRP population while minimizing the impact of contaminating cells of non-GRP phenotype.

This protocol outlines the derivation of Glial Restricted Precursors from fetal spinal cords and maintained in vitro either for transplantation or for the study of oligodendrocytic lineage.

E13マウスからグリア制限前駆体の導出

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

神経科学

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

大量の骨髄前駆細胞と新規セルソーティング戦略を使用してマウスの骨髄から樹状細胞前駆体の生成

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

免疫・感染学

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

寡能性と系列拘束されたマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の分離と同定

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs constitute a minute cell population of pluripotent cells capable of generating all blood cell lineages for a life-time1. The molecular dissection of HSCs homeostasis in the bone marrow has important implications in hematopoiesis, oncology and regenerative medicine. We describe the labeling protocol with fluorescent antibodies and the electronic gating procedure in flow cytometry to score hematopoietic progenitor subsets and HSCs distribution in individual mice (Fig. 1). In addition, we describe a method to extensively enrich hematopoietic progenitors as well as long-term (LT) and short term (ST) reconstituting HSCs from pooled bone marrow cell suspensions by magnetic enrichment of cells expressing c-Kit. The resulting cell preparation can be used to sort selected subsets for in vitro and in vivo functional studies (Fig. 2).
Both trabecular osteoblasts2,3 and sinusoidal endothelium4 constitute functional niches supporting HSCs in the bone marrow. Several mechanisms in the osteoblastic niche, including a subset of N-cadherin+ osteoblasts3 and interaction of the receptor tyrosine kinase Tie2 expressed in HSCs with its ligand angiopoietin-15 concur in determining HSCs quiescence. "Hibernation" in the bone marrow is crucial to protect HSCs from replication and eventual exhaustion upon excessive cycling activity6. Exogenous stimuli acting on cells of the innate immune system such as Toll-like receptor ligands7 and interferon-&alpha;6 can also induce proliferation and differentiation of HSCs into lineage committed progenitors. Recently, a population of dormant mouse HSCs within the lin- c-Kit+ Sca-1+ CD150+ CD48- CD34- population has been described8. Sorting of cells based on CD34 expression from the hematopoietic progenitors-enriched cell suspension as described here allows the isolation of both quiescent self-renewing LT-HSCs and ST-HSCs9. A similar procedure based on depletion of lineage positive cells and sorting of LT-HSC with CD48 and Flk2 antibodies has been previously described10. In the present report we provide a protocol for the phenotypic characterization and ex vivo cell cycle analysis of hematopoietic progenitors, which can be useful for monitoring hematopoiesis in different physiological and pathological conditions. Moreover, we describe a FACS sorting procedure for HSCs, which can be used to define factors and mechanisms regulating their self-renewal, expansion and differentiation in cell biology and signal transduction assays as well as for transplantation.

A method to analyse the distribution of bone marrow hematopoietic progenitors in flow cytometry as well as to efficiently isolate highly purified hematopoietic stem cells (HSCs) is described. The isolation procedure is essentially based on magnetic enrichment of c-Kit+ cells and cell sorting to purify HSCs for cellular and molecular studies.

マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

生物学

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

シュワン細胞表現型仕様を評価するための細胞外マトリックス微小環境の調製

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...

生物工学

Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Mutations in driver genes, that confer cellular fitness, can lead to the development of expanding HSPC clones that increasingly give rise to progeny leukocytes harboring the somatic mutation. Because clonal hematopoiesis has been associated with heart disease, stroke, and mortality, the development of experimental systems that model these processes is key to understanding the mechanisms that underly this new risk factor. Bone marrow transplantation procedures involving myeloablative conditioning in mice, such as total-body irradiation (TBI), are commonly employed to study the role of immune cells in cardiovascular diseases. However, simultaneous damage to the bone marrow niche and other sites of interest, such as the heart and brain, is unavoidable with these procedures. Thus, our lab has developed two alternative methods to minimize or avoid possible side effects caused by TBI: 1) bone marrow transplantation with irradiation shielding and 2) adoptive BMT to non-conditioned mice. In shielded organs, the local environment is preserved allowing for the analysis of clonal hematopoiesis while the function of resident immune cells is unperturbed. In contrast, the adoptive BMT to non-conditioned mice has the additional advantage that both the local environments of the organs and the hematopoietic niche are preserved. Here, we compare three different hematopoietic cell reconstitution approaches and discuss their strengths and limitations for studies of clonal hematopoiesis in cardiovascular disease.

We describe three methods of bone marrow transplantation (BMT): BMT with total-body irradiation, BMT with shielded irradiation, and BMT method with no pre-conditioning (adoptive BMT) for the study of clonal hematopoiesis in mouse models.

クローン造造を研究するマウスにおける骨髄移植手順

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

<meta charset="utf8"></head><body>放射線照射マウスにおける効果的な造血幹細胞移植のための骨オルガノイド由来細胞

In Vivo Osteo-organoid Approach for Harvesting Therapeutic Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) requires a sufficient number of therapeutic hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). To identify an adequate source of HSPCs, we developed an in vivo osteo-organoid by implanting scaffolds loaded with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) into an internal muscle pouch near the femur in mice. After 12 weeks of implantation, we retrieved the in vivo osteo-organoids and conducted flow cytometry analysis on HPSCs, revealing a significant presence of HSPC subsets within the in vivo osteo-organoids.
We then established a sublethal model of hematopoietic/immune system injury in mice through radiation and performed hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) by injecting the extracted osteo-organoid-derived cells into the peripheral blood of radiated mice. The effect of hematopoietic recovery was evaluated through hematological, peripheral blood chimerism, and solid organ chimerism analyses. The results confirmed that in vivo osteo-organoid-derived cells can rapidly and efficiently reconstruct damaged peripheral and solid immune organs in irradiated mice. This approach holds potential as an alternative source of HSPCs for HSCT, offering benefits to a larger number of patients.

<meta charset="utf8"></head><body>治療用造血幹細胞/前駆細胞を回収するためのin vivoオステオオルガノイドアプローチ

Here, we established in vivo osteo-organoids triggered by bone morphogenetic protein-2-loaded gelatin scaffolds to harvest therapeutic hematopoietic stem/progenitor cells for the reconstruction of a damaged hematopoietic and immune system. Overall, this approach can provide a promising cell source for cell therapies.

治療用造血幹細胞/前駆細胞を回収するためのin vivoオステオオルガノイドアプローチ

Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) requires a sufficient number of therapeutic hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). To identify an ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it contributes to disease development and progression, particularly in the gray matter of the brain, remains largely unknown. The dysfunction of oligodendrocyte lineage cells is hallmarked by deficiencies in myelination and impaired self-renewal of oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These two defects are caused at least in part by the disruption of interactions between neuron and oligodendrocytes along the buildup of pathology. OPCs give rise to myelinating oligodendrocytes during CNS development. In the mature brain cortex, OPCs are the major proliferative cells (comprising ~5% of total brain cells) and control new myelin formation in a neural activity-dependent manner. Such neuron-to-oligodendrocyte communications are significantly understudied, especially in the context of neurodegenerative conditions such as AD, due to the lack of appropriate tools. In recent years, our group and others have made significant progress to improve currently available protocols to generate functional neurons and oligodendrocytes individually from human pluripotent stem cells. In this manuscript, we describe our optimized procedures, including the establishment of a co-culture system to model the neuron-oligodendrocyte connections. Our illustrative results suggest an unexpected contribution from OPCs/oligodendrocytes to the brain amyloidosis and synapse integrity and highlight the utility of this methodology for AD research. This reductionist approach is a powerful tool to dissect the specific hetero-cellular interactions out of the inherent complexity inside the brain. The protocols we describe here are expected to facilitate future studies on oligodendroglial defects in the pathogenesis of neurodegeneration.

The neuron-glial interactions in neurodegeneration are not well understood due to inadequate tools and methods. Here, we describe optimized protocols to obtain induced neurons, oligodendrocyte precursor cells, and oligodendrocytes from human pluripotent stem cells and provide examples of the values of these methods in understanding cell-type-specific contributions in Alzheimer&#8217;s disease.

多能性幹細胞からのヒト神経細胞および希突起膠細胞の作製によるニューロン-希突起膠細胞相互作用のモデル化

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...

成熟シュワン細胞の発生源としての骨髄由来前駆細胞の低酸素プレコンディショニング

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E13マウスからグリア制限前駆体の導出

大量の骨髄前駆細胞と新規セルソーティング戦略を使用してマウスの骨髄から樹状細胞前駆体の生成

寡能性と系列拘束されたマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の分離と同定

マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

シュワン細胞表現型仕様を評価するための細胞外マトリックス微小環境の調製

クローン造造を研究するマウスにおける骨髄移植手順

治療用造血幹細胞/前駆細胞を回収するためのin vivoオステオオルガノイドアプローチ

治療用造血幹細胞/前駆細胞を回収するためのin vivoオステオオルガノイドアプローチ

治療用造血幹細胞/前駆細胞を回収するためのin vivoオステオオルガノイドアプローチ

多能性幹細胞からのヒト神経細胞および希突起膠細胞の作製によるニューロン-希突起膠細胞相互作用のモデル化