Name: analysis of protein-protein interactions and co-localization between components of gap, tight, and adherens junctions in murine mammary glands
Uploaded: 2017-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands at JoVE.com

IPは、カナダ自然科学・工学研究協議会（NSERC＃418233-2012）の資金提供を受けています。ケベック・サンテ（FRQS）、ケベック乳がん財団のキャリア賞、カナダ財団のイノベーション・グラントのリーダー・ファンド・グラントなどがあります。 EDはFondationの大学のArmand-Frappierから奨学金を受けました。

この研究で使用された全ての動物プロトコールは、University Animal Care Committee（INRS-Institut Armand-Frappier、Laval、Canada）によって承認された。 1.タンパク質共局在の同定<ol><li> 組織から顕微鏡スライドまで 注記：組織や切片はドライアイスで取り扱う必要があります。 <ol><li>動物から乳腺を摘出する（この手順の完全な説明については、Plante らを参照のこと） 14 。 </li><li>切除した組織をドライアイス上の凍結/マウント培地に包埋する。腺を覆うのに十分な培地を加える。培地が凝固したら、組織を冷凍庫に移し、後で使用するために-80℃で保存する。 </li><li>凍結ミクロトームを-35℃以下に設定して、組織を7-10μmの厚さの切片に切断し、顕微鏡スライド上に置く。 注：可能であれば、各スライドに2つのセクションを配置してください。左のセクションは抗体の特異性および組織の自己蛍光を確認するための通常の制御、右側は抗体で標識される。 </li><li>後で使用するためにセクションを-80°Cに保ちます。 </li></ol></li><li> Co-IF染色 <ol><li>冷凍庫から適切な顕微鏡スライドを回収し、室温（RT）でホルムアルデヒド4％中に15分間浸漬することにより、セクションを直ちに固定する。 </li><li>次に、スライドをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に室温で浸します。次のステップに進むまで、RTでPBS中にスライドを放置する。 </li><li>市販の疎水性バリアーまたは撥水ラボペン（ 表の表を参照 ）を使用してスライドの各セクションを囲みます。組織に触れないように注意してください。直ちに、PBSの滴を組織に加え、手順の残りの間、湿った組織学的チャンバー内にスライドを置く。 注記：組織切片は湿ったままでなければなりません。オルタナティブ蓋が付いた箱を使用し、底に濡れた紙タオルを置きます。 </li><li> 3％ウシ血清アルブミン（BSA） - トリス緩衝生理食塩水（TBS）-0.1％ポリソルベート20（材料の表参照）の100-200μLで各組織切片をRTで30分間ブロックする。サンプルがブロッキングしている間に、抗体をTBS-0.1％ポリソルベート20で希釈することにより、一次および二次抗体溶液を調製する。 注：抗体に必要な濃度は製造業者によって提供される。実施例については、 表 1および2ならびにDianati et al。を参照のこと。 9 。ほとんどのフルオロフォア結合抗体を使用する場合、暗所で作業する必要はありませんが、抗体溶液や染色組織を強い光にさらさないようにしてください。 </li><li>吸引によってブロッキング溶液を除去し、希釈した一次抗体100〜200μL中の切片をRTで60分間インキュベートする。代替4℃で一晩、一次抗体と共にインキュベートする。 </li><li>一次抗体溶液を吸引により除去し、切片をTBS-0.1％ポリソルベート20250-500μLで5分間洗浄する。吸引によって洗浄液を除去し、洗浄を2回繰り返す。 </li><li>洗浄液を吸引して除去し、切片を適切なフルオロフォア結合二次抗体100〜200μLと共に室温で60分間インキュベートする。 </li><li>二次抗体溶液を吸引除去し、TBS-0.1％ポリソルベート20250-500μLで切片を5分間洗浄する。洗浄溶液を除去し、2回繰り返す。 </li><li>目的の次のタンパク質に一次抗体と二次抗体の適切な組み合わせを使用して、ステップ2.5-2.8を繰り返します。 </li><li>洗浄液を吸引除去し、TBS-0.1％ポリソルベート20中の1mg / mLの4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を100-200μLで5分間インキュベートすることにより核染色を行う。RT。 </li><li>吸引によりDAPI溶液を除去し、水溶性で非蛍光性のマウント媒体（ 表の表を参照 ）およびカバーガラスを用いてスライドをマウントする。一度に1つのスライドを進めます。 注：核染色を5分間以上インキュベートしても、染色の強度は変わりません。あるいは、すべてのスライド上のDAPI溶液を除去し、スライドをマウントしながらPBSで組織をインキュベートする。 </li><li>少なくとも8時間4℃の冷蔵庫に平らにスライドを置きます。蛍光顕微鏡イメージングに進みます（ 図1と図2を参照）。 </li></ol></li><li> 顕微鏡イメージング <ol><li>特定の波長でフルオロフォアを励起するのに必要な様々なレーザーを備えた共焦点顕微鏡を使用して、フルオロフォア結合二次抗体を視覚化する。 注：ダクトおよび肺胞を視覚化するためには、0.95の開口数を有する40倍の対物レンズが提案される。 explpleを図1に示します。 </li><li> 1つの波長で画像をスキャンすることにより、各タンパク質の局在を個々に確認する。 注：この段階では、接合タンパク質の局在を批判的に分析することが重要です。ジャンクショナルネクサスを形成することができるためには、これらのタンパク質は原形質膜に局在していなければならない。 </li><li>異なる波長でレーザーでスキャンされた画像をマージすることにより、タンパク質の共局在を決定する。 注：タンパク質共局在は、同じ場所で2つ以上のフルオロフォアが放出されることに起因する色の変化によって視覚化することができ、適切なソフトウェア（ 図1および図2 ;参考文献9も参照）を用いて測定することができる。 </li></ol></li></ol> 2. PPIの勉強注：腹部乳腺は、胸部腺が胸部と密接に関連しているため、PPIを研究するために使用する必要があります筋肉。 （この手順の完全な説明については、Plante et al 。を参照してください） 14乳腺を摘出し、後で使用するために-80℃に保ちます。 <ol><li> ライセートの調製 <ol><li>次のステップに進む前に、秤量紙と2 mLのマイクロ遠心チューブをドライアイスに置き、あらかじめ冷却してください。 </li><li> -80℃から乳腺組織を取り出し、ドライアイス上に保ちます。 </li><li>あらかじめ冷却した秤量紙上で組織の重量を測り、組織を2 mLのマイクロ遠心チューブ（ドライアイスで処理）に移す。サンプルあたり50〜100mgの組織を使用する。ステップ2.1.5まで組織をドライアイス上に保つ。 </li><li> NaF、NaVO 3 、およびプロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤を補充したトリプル界面活性剤溶解バッファーの必要量を、次の式を使用して表の表に示すように調製する 。マウス：必要な緩衝液（μL）=マウス組織重量（mg）×3;ラット：必須緩衝液（μL）=ラット組織重量（mg）×5。 </li><li>必要量の氷冷溶解緩衝液（ステップ2.1.4で計算）を組織を含む2mLチューブに加える。 注記：ステップ2.1.5-2.1.6では、一度に1本のチューブで作業を進めます。 </li><li>組織粉砕機で連続ホモジナイゼーションを用いて30〜40秒間組織をホモジナイズする;常にチューブを氷上に置いてください。組織ホモジナイザーを中速に調整し、グラインダーをチューブ内で静かに上下に動かします。 </li><li>他のチューブでステップ1.6と1.7を繰り返します。 </li><li>溶解物を氷上で10〜30分間インキュベートする。 </li><li> 4℃で10分間170 xgでチューブを遠心分離する。 </li><li>一方、各サンプルについて6〜10個のマイクロ遠心チューブ（0.6 mL）を特定し、氷上に保ちます。 </li><li>遠心分離が完了したら、チューブを点検する。それらが、脂肪、透明、黄色〜ピンクの溶解物（発育段階に依存する）およびペレットの最上層を含有することを確認する。 </li><li>脂質層に穴を作る200μLのピペットチップを用いて液相にアクセスする。チップを交換し、ペレットを乱すことなく、または脂質層を吸引することなく溶解物を収集する。ライセートを氷上で予め標識したチューブに分注し（ステップ2.1.11）、-80℃で保存します。 </li><li>アリコートを使用して、適切な市販キット（ 表の表を参照 ）を使用してタンパク質濃度を定量する。 </li></ol></li><li> 間接免疫沈降 <ol><li>氷上で、前に調製した総乳腺溶解物の2つのアリコートを解凍する。 注：1つのアリコートは標的タンパク質のIPに使用され、もう1つはネガティブコントロールとして使用されます。 </li><li> 500-1,000μgのライセートを集め、PBSで希釈して各1.5 mLチューブで200μLの最終容量に達する。 注記：使用するライセートの量は、目的のタンパク質の存在量および抗体の効率に依存します（ 図3のanの例、および材料の表 ）。各標的に対して最適化するために、異なる量の溶解産物（ すなわち 、500,750、および1,000μg）および抗体（ すなわち 、5,10、および20μg）を使用すべきである。次の手順（2.2.3-2.3.7.4）を実行します。 </li><li>目的の抗原に対する抗体をライセートの最初のチューブに加え、氷上に保ちます。 注記：必要な金額は、通常、各社が提供する指示書に示されています（材料表を参照 ）。 </li><li> 2番目のチューブでは、2.2.3で使用した抗体と同じ濃度のアイソタイプIgGコントロールを加えてネガティブコントロールを調製します。 </li><li>チューブを4℃で一晩、チューブローラーミキサーで低速でインキュベートする。 </li><li>翌日、50μLの磁気ビーズを新たな1.5mLチューブに加えて予備洗浄します。 <ol><li>抗体に対する相対的親和性に基づいてプロテインAまたはプロテインG磁気ビーズを選択してください。 </li&gt; <li>凝集ビーズの使用を避けることが重要です。ビーズ懸濁液を均一に再懸濁させてチューブに加える前に、ビーズ懸濁液を静かに混合する。 </li></ol></li><li>ビーズを入れたチューブを磁気スタンドに置き、ビーズを磁石に移動させます。 200μLピペットを使用してビーズから保存バッファーを取り出します。 </li><li> 500μLのPBS-0.1％ポリソルベート20を加えてビーズを洗浄し、10秒間チューブを激しくボルテックスする。 </li><li>チューブを磁気スタンドに戻し、ビーズを磁石に移動させます。 </li><li>過剰の洗浄バッファーをピペットで200μLピペットで取り除きます。 </li><li>ステップ2.2.5の反応複合体（ライセート - 抗体）をビーズに加え、ローラーミキサーでRTで90分間インキュベートする。 </li><li>チューブを磁気スタンドに置き、ビーズを磁石に移動させます。 200μLピペットを使用して、ライセートを吸引して廃棄し、チューブを氷上に置きます。 </li><li>ビーズを洗う500μLのPBSを添加し、チューブを磁気スタンド上に置き、200μLのピペットを用いて液体を除去することによって調製した。この洗浄ステップを繰り返します。洗浄工程中はボルテックスを避け、サンプルを氷上に置いてください。 </li><li>ボルテックスせずにPBS-0.1％ポリソルベート20でビーズを1回洗浄し、200μLピペットチップを使用して最後の洗浄バッファーを捨てる。 </li><li>溶出するために、20μLの0.2M酸性グリシン（pH = 2.5）をチューブに加え、ローラーミキサーで7分間振盪する。 </li><li>数秒間高速で遠心分離し（急速回転）、上清を新鮮な氷冷したチューブに集める。 </li><li>各チューブについてステップ2.2.14と2.2.15を繰り返します。 注：最終容量は40μLになります。 </li><li>ステップ2.2.16の40μL溶出サンプルに10μLの4倍Laemmliバッファーを加えます。 注：酸性のpHのため、色は黄色に変わります。 </li><li>直ちに、ステップ2.2.18からの溶出したサンプルに1Mトリス（pH = 8）を一度に1滴ずつその色まで加える青色に変わります。次のチューブに進んでください。 </li><li>ステップ2.2.18のサンプルを70-90℃で10分間煮沸する。すぐにゲル電気泳動に進む。あるいは、サンプルを-80℃の冷凍庫に移してローディングする。 </li></ol></li><li> 下流適用：ゲル電気泳動、続いてウエスタンブロット <ol><li> SDS-PAGEアクリルアミドゲル（1.5 mm厚）を標準手順に従って分離して積み重ねる準備をする15 。 注：ゲルの選択（8-15％アクリルアミド、グラジエント：材料の表を参照 ）は、沈殿するタンパク質の分子サイズと解析される可能性のある結合パートナーの分子サイズに基づいて決定する必要があります。これらのタンパク質は、適切な免疫検出を可能にするために互いに解決されなければならない。 </li><li>氷上で免疫沈降（IP）溶出サンプル（ステップ2.2.20）を解凍する。 </li><li>同じサンプルからタンパク質溶解物を調製する（上記IP手順に使用）。 50を使用総溶解物μgを添加し、4X Laemmliサンプル緩衝液を添加する。試料を70〜90℃で5分間煮沸し、氷上に置く。 注：これらのサンプルは溶出されたIPサンプルの横にロードされ、全ライセート中の沈殿したタンパク質の存在を実証します。 </li><li>ステップ2.3.3から調製した溶解物およびステップ2.2.20からの沈殿したサンプルをアクリルアミドゲルに並べて入れ、ランニングバッファー（10xランニングバッファー：トリス30.3g、グリシン144.1g、および10 gのSDSを1Lの蒸留水に溶解したもの）を100Vで約95分間、または移動しているタンパク質の端部がゲルの底に達するまで攪拌する。 </li><li>標準プロトコール9,15を使用してニトロセルロースまたはPVDF膜にゲルを移す。 </li><li>膜を5％乾燥ミルク-TTBS（20mMトリス、500mM NaCl、および0.05％ポリソルベート20）中、低速でロッカー上で1時間ブロックする。 </li><li>降水量が成功したかどうかを確認する無邪気な。 <ol><li>沈降したタンパク質に対する第1抗体を用いて膜をプローブし、5％ドライミルク-TTBSで希釈し、製造元が推奨する濃度で4℃で一晩、ゆっくり撹拌しながらロッキングプラットフォーム上でプローブする。 注： 推奨事項については表の表を参照してください。 </li><li>翌日、高撹拌のロッキングプラットフォーム上でTTBSを用いてそれぞれ5分間3回膜を洗浄する。 </li><li> TTBSで希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）と結合した適切な二次抗体中の膜を、室温で1時間、ゆっくり攪拌しながらロッキングプラットフォーム上でインキュベートする。 注：あるいは、シグナルを検出するための適切な装置が利用可能であれば、蛍光色素と結合した二次抗体を使用することができます。 </li><li>高撹拌のロッキングプラットフォーム上でTTBSを用いてそれぞれ5分間3〜6回洗浄する。メンブレンを市販のa抗体とインキュベートすることによって二次抗体のシグナルを分析する。使用可能なルミノール溶液（材料の表を参照 ）を使用し、製造元の指示に従ってください。化学発光イメージングシステムを使用してシグナルを検出します（ 表の表を参照 ）。 注：ウェスタンブロット分析に関する詳細なプロトコールについては、参考文献16を参照してください。 </li></ol></li><li>相互作用するタンパク質を同定するために、同じブロット上の適切な抗体を用いて2.3.7.1〜2.3.7.4のステップを実行する。 注：タンパク質が相互作用している場合、結合パートナーは標的タンパク質と免疫共沈降し、ウェスタンブロッティングによって検出可能となります。タンパク質の分子量がゲルおよび膜上で十分に分離するのに十分に異なる限り、他のタンパク質が同じタンパク質複合体に存在するかどうかを決定するために、より多くの抗体を用いてステップ2.3.8を繰り返すことができる。 </li><li>同定された結合パートナーがアーチファクトではないことを確認するために、相反的IPを実施すべきである。 注：これは、ステップ2.2.1〜2.2.20を同じ溶解物で行うが、ステップ3.8で同定した結合パートナーの1つを沈殿させる。次いで、目的の第1のタンパク質に対する一次抗体を用いて、ステップ3.1〜3.8を繰り返す。 </li></ol></li></ol>

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著者は宣言することは何もない。

接合部を介する細胞間相互作用は、乳腺などの多くの器官の適切な機能および発達のために必要とされる。研究により、接合タンパク質は相互の機能および安定性を調節し、細胞膜10にお互いをつなぎ合わせることによってシグナル伝達を活性化することが示されている。現在の原稿で提示されたプロトコールは、正常なマウス腺の発生中のジャンクショナルタンパク質の?...

乳腺の成長と発達は、主に出生後に起こる。この臓器は、哺乳動物の生殖生涯を通して常にそれ自体を改造する1 。成体乳腺上皮は内腔上皮細胞の内層と基底細胞の外層（主に筋上皮細胞から構成され、基底膜2で囲まれている）からなる。乳腺の構造と発達に関する良いレビューのために、読者はSternlicht 1を参照することができます。腺1、3、4、5、6の正常な発達および機能のためには、ギャップ（GJ）、タイト（TJ）およびアフェレン（AJ）ジャンクションを介した細胞 - 細胞相互作用が必要である。マウス乳腺におけるこれらの接合部の主成分は、Cx26、Cx30、Cx32、およびCx43（GJ）である。 Claudin-1、-3、-4、-7およびZO-1（TJ）; E-カドヘリン、P-カドヘリンおよびβ-カテニン（AJ） 7,8 。これらの異なる接合タンパク質の発現レベルは、乳腺発達中に段階依存的に変化し、異なる細胞 - 細胞相互作用要件を示唆している9 。 GJ、TJ、およびAJは、構造的および機能的に連結され、隣接する細胞の隣接する部位に他の構造または調節タンパク質をつなぎ合わせることにより、接合的連結体10を生成する。結合接合の組成は、根底にある細胞骨格との架橋、ならびにネクサスの透過性および安定性に影響を及ぼし得、その結果、腺8,9,10,11の機能に影響を及ぼし得る。接合部接合部に存在するか、または相互に相互作用する細胞間接合部の成分は、乳がん発達の最近の発達段階を、共免疫蛍光（co-IF）および同時免疫沈降（co-IP） 9を用いて最近解析した。他の技術はタンパク質間の機能的関連性の評価を可能にするが、これらの方法はこの原稿には示されていない。 タンパク質は機能するだけで単独で作用するため、シグナル伝達や生化学カスケードなどのタンパク質 - タンパク質相互作用（PPI）の研究は多くの研究者にとって不可欠であり、タンパク質の機能に関する重要な情報を提供することができます。 Co-IFおよび顕微鏡分析は、同じ細胞下の空間を共有するいくつかのタンパク質を評価するのに役立ちます。しかしながら、標的の数は、異なる動物において惹起されなければならない抗体によって、および異なる波長レーザーを備える共焦点顕微鏡および多重化のためのスペクトル検出器にアクセスすることによって制限される。 Co-IPは、親和性の高い物理的相互作用を確認または明らかにするタンパク質複合体内に存在する2つ以上のタンパク質を含む。タンパク質の局在化および相互作用を同時に検出することができる蛍光共鳴エネルギー移動（FRET） 12および近接ライゲーションアッセイ（PLA） 13などの新規技術の開発にもかかわらず、co-IPは、間の相互作用を研究するための適切かつ手頃な技術である内在性タンパク質。 この原稿で説明されている段階的方法は、乳腺の内在性PPIを研究する際に避けるために、タンパク質の局在化およびPPIの研究を容易にし、落とし穴を指摘するでしょう。この方法論は、各技術に必要な組織の異なる保存手順の提示から始まる。第1部では、i）乳腺の切片化、ii）co-IF法を用いた異なるタンパク質の二重標識または三重標識、およびiii）タンパク質の局在化。パート2は、内因性タンパク質を沈降させ、その相互作用タンパク質をi）溶解産物調製、ii）間接タンパク質免疫沈降、およびiii）SDS-PAGEおよびウェスタンブロットによる結合パートナー同定の3つのステップで同定する方法を示す。このプロトコールの各ステップは、げっ歯類の乳腺組織に対して最適化され、高品質で特異的かつ再現性のある結果を生じる。このプロトコールは、他の組織または細胞系におけるPPI研究の出発点として使用することもできる。

<table><tbody><tr><td>Mice strain and stage</td><td>St. Constant, Quebec, Canada</td><td></td><td>C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS 10x (stock)</td><td></td><td></td><td>1) Dissolve 80 g NaCl (F.W.: 58.44), 2 g KCl (F.W. 74.55), 26.8 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (F.W. 268.07) and 2.4 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (F.W.:136.09) in 800 mL distilled water;&lt;br/&gt; 2) Adjust the PH to 7.4;&lt;br/&gt; 3) Add water to reach to the 1 L final volume.</td></tr><tr><td>TBS 10x (stock)</td><td></td><td></td><td>1) Dissolve 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl in 800 mL distilled water;&lt;br/&gt;2) Adjust the pH to 7.5;&lt;br /&gt;3) Add water to reach to the 1 L final volume.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Part 1: Immunofluorescence&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Freezing media</td><td>VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada</td><td>95067-840</td><td>VMR frozen sections compound&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Mississauga, ON, Canada</td><td>956640</td><td>Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz</td></tr><tr><td>Blades</td><td>C.L. Sturkey, Inc. Les Produits&amp;nbsp;Scientifiques&amp;nbsp;ESBE&amp;nbsp;St-Laurent, QC, Canada</td><td>BLM1001C</td><td>High profile gold coated blades</td></tr><tr><td>Pap pen</td><td>Cedarlane, Burlington, ON, Canada</td><td>8899</td><td>Super PAP Pen, Thermo fisher scientific</td></tr><tr><td>Microscopic slides</td><td>Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada</td><td>12-550-15</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;Superfrost Plus Microscope Slides</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada</td><td>FOR201.1</td><td>Forlmadehyde</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blocking solution</td><td></td><td></td><td>3% BSA in TBS</td></tr><tr><td>Wash solution</td><td></td><td></td><td>TBS-Tween 20 0.1%</td></tr><tr><td>Polysorbate 20</td><td>Oakville, ON, Canada</td><td>P 9416</td><td>Tween 20, Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Mounting media</td><td>Cedarlane, Burlington, ON</td><td>17984-25(EM)</td><td>Fluoromount-G</td></tr><tr><td>First &amp;amp; secondary antibodies</td><td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td><td>See Comments</td><td>E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>First &amp;amp; secondary antibodies&amp;nbsp;</td><td>Life technologies, Waltham, MA, USA &amp;amp; Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td><td>See Comments</td><td>Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>First &amp;amp; secondary antibodies&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada&amp;nbsp;</td><td>See Comments</td><td>&amp;beta;-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)</td></tr><tr><td>First &amp;amp; secondary antibodies&amp;nbsp;</td><td>Life technologies, Waltham, MA, USA &amp;amp; Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td><td>See Comments</td><td>Connexin26&amp;nbsp; (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nuclei stain</td><td>Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada</td><td>D1306</td><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS</td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Nikon Canada, Mississauga, On, Canada</td><td></td><td>Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Software of IF images analysis</td><td>Nikon Canada, Mississauga, On, Canada</td><td></td><td>NIS-elements software (version 4)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Part 2: Immunoprecipitation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Triple-detergent Lysis buffer (100&amp;nbsp;mL) pH=8.0</td><td></td><td></td><td>1) Mix 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150&amp;nbsp;mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80 mL distilled H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.&lt;br/&gt; 2) Adjust the pH to 8.0 with HCl 6&amp;nbsp;N (~0.5&amp;nbsp;mL).&lt;br/&gt; 3) Adjust the volume to 100&amp;nbsp;mL. Keep it in fridge.&lt;br/&gt; At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer:&lt;br/&gt; Sodium Fluoride (stock) solution 1.25&amp;nbsp;M (F.W.: 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1&amp;nbsp;M (F.W.: 183.9)</td></tr><tr><td>Protease/phosphatase inhibitor</td><td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td><td>78441</td><td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)</td></tr><tr><td>Protein dosage</td><td>Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA</td><td>23225</td><td>Pierce BCA protein assay kit&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tissue grinder</td><td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td><td>FTH-115</td><td>Power 125, Model FTH-115</td></tr><tr><td>Magnetic beads and stand</td><td>Millipore, Etobicoke, ON, Canada</td><td></td><td>PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)</td></tr><tr><td>Wash solution for IP</td><td></td><td></td><td>PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step</td></tr><tr><td>Primary antibodies for immunoprecipitation</td><td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td><td>See Comments</td><td>IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 &amp;micro;L/200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Primary antibodies for immunoprecipitation</td><td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td><td>See Comments</td><td>IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 &amp;micro;L/200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Primary antibodies for immunoprecipitation</td><td>Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada</td><td>See Comments</td><td>Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4&amp;nbsp;&amp;micro;L/200&amp;nbsp;&amp;micro;L</td></tr><tr><td>Primary antibodies for immunoprecipitation</td><td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA</td><td>See Comments</td><td>E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 &amp;micro;L/200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Laemmli buffer&amp;nbsp;</td><td>BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada</td><td>1610747</td><td>4x Laemmli Sample Buffer (Add &amp;beta;-mercaptoethanol following manufacturer recommendation)</td></tr><tr><td>Acidic glycine&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td><td>PB381-5</td><td>0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tris&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific, Burlington, ON</td><td>BP152-1</td><td>1 M (pH=8)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SDS-PAGE acrylamide gels&amp;nbsp;</td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td><td>1610180 -5</td><td>TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%)</td></tr><tr><td>Running buffer 10x&amp;nbsp;</td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td><td>1704272</td><td>Tris 30.3&amp;nbsp;g/glycine 144.1&amp;nbsp;g /SDS 10&amp;nbsp;g in 1 L distilled water</td></tr><tr><td>Membranes</td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td><td>1704272</td><td>PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit</td></tr><tr><td>Transfer method</td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td><td>1704155</td><td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td></tr><tr><td>Dry Milk</td><td>Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada</td><td></td><td>Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation</td></tr><tr><td>Blocking solution for blots</td><td></td><td></td><td>5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1%</td></tr><tr><td>Washing solutions for blots</td><td></td><td></td><td>TBS-Tween 20 0.1%</td></tr><tr><td>Primary and secondary antibodies for blots (10&amp;nbsp;mL)</td><td>Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario &amp;amp; Abcam, Toronto, ON, Canada</td><td>See Comments</td><td>Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td></tr><tr><td>Primary and secondary antibodies for blots (10&amp;nbsp;mL)</td><td>Cell Signaling, Beverly, MA, USA &amp;amp; Abcam, Toronto, ON, Canada</td><td>See Comments</td><td>E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td></tr><tr><td>Primary and secondary antibodies for blots (10&amp;nbsp;mL)</td><td>Life technologies, Waltham, MA, USA &amp;amp; Abcam, Toronto, ON, Canada</td><td>See Comments</td><td>Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td></tr><tr><td>Primary and secondary antibodies for blots (10&amp;nbsp;mL)</td><td>Life technologies, Waltham, MA, USA &amp;amp; Abcam, Toronto, ON, Canada</td><td>See Comments</td><td>Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)</td></tr><tr><td>Luminol solution for signal detection on blots</td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td><td>1705061</td><td>Clarity Western ECL Blotting Substrate</td></tr><tr><td>Imaging blots</td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td><td>1708280</td><td>ChemiDoc MP imaging system</td></tr><tr><td>Analayzing blots</td><td>BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada</td><td></td><td>ImageLab 5.2 software&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

analysis of protein-protein interactions and co-localization between components of gap, tight, and adherens junctions in murine mammary glands

細胞 - 細胞相互作用は、組織の完全性および乳腺の異なる区画間の障壁を保存する中枢的役割を果たす。これらの相互作用は、隣接する細胞間の連結を形成する結合タンパク質によって提供される。接合タンパク質の位置の誤った局在化およびそれらの結合パートナーとの物理的関連の低下は、機能の喪失をもたらし、その結果、器官の機能不全をもたらし得る。したがって、正常および疾患関連組織におけるタンパク質局在化およびタンパク質 - タンパク質相互作用（PPI）の同定は、発症状態の疾患または変化の進行につながる新しい証拠およびメカニズムを見出すために不可欠である。この原稿は、マウス乳腺におけるPPIを評価するための2段階の方法を提示している。プロトコルセクション1では、目的のタンパク質に対して生じた抗体、続いて蛍光色素で標識された二次抗体を用いて共免疫蛍光（co-IF）を行う方法が記載されている。 co-IF allタンパク質の接近を実証するために、物理的な相互作用を研究することが可能です。したがって、共免疫沈降（co-IP）のための詳細なプロトコールがプロトコールセクション2に提供される。この方法は、これらの相互作用が直接的であるか間接的であるかを確認することなく、タンパク質間の物理的相互作用を決定するために使用される。ここ数年、co-IFおよびco-IP技術は、細胞間接合のある種の成分が共に局在化し、相互作用し、乳腺発達中に変化する段階依存的接合結合を生じることを実証している。

GJ、AJ、およびTJ成分が乳腺で相互作用できるかどうかを判定するために、最初にco-IFアッセイを行った。 GJタンパク質であるCJ26とAJタンパク質であるβ-カテニンを特異的抗体でプローブし、それぞれフルオロフォア接合マウス647（緑色、疑似色）およびヤギ568（赤色）抗体を用いて明らかにした（ 図1BおよびC ） 。データは、泌乳日7日目（L7...

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Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

細胞間接合部は、乳腺段階特異的機能および発達のための必要条件である。この写本は、タンパク質 - タンパク質相互作用（PPI）の研究およびマウス乳腺を用いた共局在のための詳細なプロトコールを提供する。これらの技術は、異なる発達段階での細胞間接合間の物理的関連の動態の調査を可能にする。

マウス乳腺のギャップ、タイトおよびアデュランス接合部の成分間のタンパク質 - タンパク質相互作用および共局在の分析

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...

analysis-protein-protein-interactions-co-localization-between

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K ビュー.  INRS, Institut Armand-Frappier. 細胞間接合部は、乳腺段階特異的機能および発達のための必要条件である。この写本は、タンパク質 - タンパク質相互作用（PPI）の研究およびマウス乳腺を用いた共局在のための詳細なプロトコールを提供する。これらの技術は、異なる発達段階での細胞間接合間の物理的関連の動態の調査を可能にする。 

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Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction of differentiation of two mouse breast epithelial cell lines, HC11 and EpH4, and their use to study complementary stages of mammary gland development and neoplastic transformation.
The HC11 mouse breast epithelial cell line originated from the mammary gland of a pregnant Balb/c mouse. It differentiates when grown to confluence attached to a plastic Petri dish surface in medium containing fetal calf serum and Hydrocortisone, Insulin and Prolactin (HIP medium). Under these conditions, HC11 cells produce the milk proteins &#946;-casein and whey acidic protein (WAP), similar to lactating mammary epithelial cells, and form rudimentary mammary gland-like structures termed &#34;domes&#34;.
The EpH4 cell line was derived from spontaneously immortalized mouse mammary gland epithelial cells isolated from a pregnant Balb/c mouse. Unlike HC11, EpH4 cells can fully differentiate into spheroids (also called mammospheres) when cultured under three-dimensional (3D) growth conditions in HIP medium. Cells are trypsinized, suspended in a 20% matrix consisting of a mixture of extracellular matrix proteins produced by Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma cells, plated on top of a layer of concentrated matrix coating a plastic Petri dish or multiwell plate, and covered with a layer of 10% matrix-containing HIP medium. Under these conditions, EpH4 cells form hollow spheroids that exhibit apical-basal polarity, a hollow lumen, and produce &#946;-casein and WAP.
Using these techniques, our results demonstrated that the intensity of the cadherin/Rac signal is critical for the differentiation of HC11 cells. While Rac1 is necessary for differentiation and low levels of activated RacV12 increase differentiation, high RacV12 levels block differentiation while inducing neoplasia. In contrast, EpH4 cells represent an earlier stage in mammary epithelial differentiation, which is inhibited by even low levels of RacV12.

We describe techniques for differentiation induction of two breast epithelial lines, HC11 and EpH4. While both require fetal calf serum, insulin, and prolactin to produce milk proteins, EpH4 cells can fully differentiate into mammospheres in three-dimensional culture. These complementary models are useful for signal transduction studies of differentiation and neoplasia.

マウス乳房上皮HC11細胞とEpH4細胞の分化

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

がん研究

Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The effects these exposures have on mammary gland development are typically evaluated using either basic dimensional measurements or by scoring morphological characteristics. However, the broad range of methods for interpreting developmental changes could lead to inconsistent translations across laboratories. A common method of assessment is needed so that proper interpretations can be formed from data being compared across studies. The present study describes the application of the Sholl analysis method to quantify mammary gland branching characteristics. The Sholl method was originally developed for use in quantifying neuronal dendritic patterns. By using ImageJ, an open-source image analysis software package, and a plugin developed for this analysis, the mammary gland branching density and the complexity of a mammary gland from a peripubertal female rat were determined. The methods described here will enable the use of the Sholl analysis as an effective tool for quantifying an important characteristic of mammary gland development.

Mammary gland development in the rodent has typically been evaluated using descriptive assessments or by measuring basic physical attributes. Branching density is an indicator of mammary development that is difficult to quantify objectively. This protocol describes a reliable method for the quantitative assessment of mammary gland branching characteristics.

ショール分析法を用いたラット乳腺全身の分枝密度の定量

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The ...

発生生物学

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

細胞外マトリックス内に埋め込まれたエンジニアリング三次元上皮組織

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

生物工学

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

微小トリプシン法によるモザイク乳腺オルガノイドの生成

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

マウスモデルにおける乳腺の発達と機能の評価

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

生物学

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can also be used to investigate and validate novel techniques and algorithms in volumetric medical imaging and therapies. Creating 3D high-resolution atlases of different organs1,2,3 is another application of histology volume reconstruction. This provides a resource for investigating tissue structures and the spatial relationship between various cellular features. We present an image registration approach for histology volume reconstruction, which uses a set of optical blockface images. The reconstructed histology volume represents a reliable shape of the processed specimen with no propagated post-processing registration error. The Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections of two mouse mammary glands were registered to their corresponding blockface images using boundary points extracted from the edges of the specimen in histology and blockface images. The accuracy of the registration was visually evaluated. The alignment of the macrostructures of the mammary glands was also visually assessed at high resolution.
This study delineates the different steps of this image registration pipeline, ranging from excision of the mammary gland through to 3D histology volume reconstruction. While 2D histology images reveal the structural differences between pairs of sections, 3D histology volume provides the ability to visualize the differences in shape and volume of the mammary glands.

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

3次元組織学ボリュームとマウス乳腺研究への応用再建

Histology volume reconstruction facilitates the study of 3D shape and volume change of an organ at the level of macrostructures made up of cells. It can ...

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. A variety of molecules, such as peptides or oligonucleotides can be introduced into essentially 100% of the cells in a non-traumatic manner.&#160; Here, we describe how it can be used to study intercellular, gap junctional communication. Lucifer yellow penetrates into the cells when an electric pulse, applied to the conductive surface on which they are growing, causes pores to form through the cell membrane. This is electroporation. Cells growing on the nonconductive&#160;glass surface immediately adjacent to the electroporated region do not take up Lucifer yellow by electroporation but do acquire the fluorescent dye as it is passed to them via gap junctions that link them to the electroporated cells. The results of the transfer of dye from cell to cell can be observed microscopically under fluorescence illumination. This technique allows for precise quantitation of gap junctional communication. In addition, it can be used for the introduction of peptides or other non-permeant molecules, and the transfer of small electroporated peptides via gap junctions to inhibit the signal in the adjacent, non-electroporated cells is a powerful demonstration of signal inhibition.

This presentation demonstrates a method whereby electroporation of adherent, cultured cells is used for the study of intercellular, junctional communication, while the cells grow on a slide coated with conductive and transparent indium-tin oxide.

ギャップ結合審査のための機能アッセイ;インジウム - スズ酸化物に対する接着した細胞のエレクトロポレーション

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

マウス乳腺の凍結切片の間接免疫

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

そのままに、全体のマウス乳腺の腺の形態と細胞外マトリックス式の分析のための分離

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in combination with skin flap surgery or implantation of imaging windows has been used to study the dynamics of the healthy mammary gland at different developmental stages. Most mammary imaging technologies are limited to a time frame of hours to days, whereas the majority of mammary gland remodeling processes occur in time frames of days to weeks. To study mammary gland remodeling, methods that allow optical access to the tissue of interest for extended time frames are required. Here, an improved version of the titanium mammary imaging window with a replaceable lid (R.MIW) is described that allows high-resolution imaging of the mammary gland with a cellular resolution for up to several weeks. Importantly, the R.MIW provides tissue access over the entire duration of the intravital imaging experiment and could therefore be used for local tissue manipulation, labeling, drug administration, or image-guided microdissection. Taken together, the R.MIW enables high-resolution characterization of the cellular dynamics during mammary gland development, homeostasis, and disease.

This protocol describes a novel mammary imaging window with a replaceable lid (R.MIW). Intravital microscopy after implantation of the R.MIW allows for longitudinal and multi-day imaging of the healthy and diseased mammary gland with a cellular resolution during the different developmental stages.

交換可能な蓋付き乳房イメージングウィンドウを使用した縦方向のバイタル内顕微鏡

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in ...