Name: four-color fluorescence immunohistochemistry of t-cell subpopulations in archival formalin-fixed, paraffin-embedded human oropharyngeal squamous cell carcinoma samples
Uploaded: 2017-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinom

Simone Puntは、オランダ癌協会の助成金UL2010-4801の支援を受けました。我々は、このJoVEプロトコルが基づいている元の論文の共著者すべてに感謝したいと思います：Emilie A. Dronkers、Marij JP Welters、Renske Goedemans、SenadaKoljenović、Elisabeth Bloemena、Peter JF Snijders、Arko Gorter、Sjoerd vanバーグ。

患者サンプルは、オランダの生物医学社会連合（www.federa.org）のヒト組織の適切な二次的使用のための行動規範に記載された医学的倫理ガイドラインに従って取り扱われた。 1.スライドの準備<ol><li>切除された材料を使用する医療倫理委員会の許可を得た後、病理部門から切除された組織材料（あらゆる種類の組織）を入手する。 注：現在の実験では、前治療（n = 162） 13として選択された1970年から2011年の間、オランダのライデン大学メディカルセンターで診断された原発性口腔咽頭腫瘍から前処置腫瘍サンプルを得た。組織の大きさは、腫瘍内部の4つの顕微鏡画像を確実に採取するのに十分な量の腫瘍組織の必要性によってのみ制限されていた。 </li><li>最低12時間、4％緩衝化ホルマリン中で組織を固定する。 agの組織を脱水するエタノールを放出した。それをキシレンで洗浄し、パラフィンワックスに自動ティッシュプロセッサーを用いて包埋する。 </li><li> ミクロトームを用いてガラススライド上に4μm厚のホルマリン固定、パラフィン包埋（FFPE）組織切片を切断する。標準手順を使用して組織ブロックをマイクロトーンティッシュホルダーに置きます。 <ol><li>組織のリボンを切断し、45℃の脱イオン水を入れた水浴の表面に置きます。免疫組織化学的染色に適したスライドを使用して、セクションのすぐ下の水にスライドを置くことによってセクションを釣り上げる。慎重にスライドを斜め上に動かし、セクションを水中から取り出してスライドに貼り付けます。 </li></ol></li><li>スライドを一晩37℃で乾燥させる。 </li><li> FFPEスライドを新鮮な100％キシレンに完全に浸すことにより脱パラフィンし、それぞれ5分間3回。新鮮な100％エタノール、70％エタノール、および50％エタノールで2回それぞれ5分間浸漬することにより、スライドを再水和する。。 </li></ol> 2.抗原検索を実行する<ol><li>スライドを脱イオン水で5分間洗浄する。 </li><li>マイクロ波を用いてトリス - エチレンジアミン四酢酸（EDTA）緩衝液（10mM Tris + 1mM EDTA、pH9.0）を沸騰温度まで予熱する。予熱されたEDTAバッファー中にスライドを浸し、この温度で10分間マイクロ波でバッファーを保持することによって抗原回収を行う。 注：900 Wのパワーを持つあらゆる電子レンジを使用できます。 </li><li>スライドを2時間緩衝液中で冷却させる。 </li></ol> 3.組織スライドを染色する<ol><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でスライドを2回それぞれ5分間洗浄する。 </li><li>疎水性ペンで組織の周りに円を描き、希釈された抗体がスライドからこぼれるのを防ぎます。もう一度PBSで洗浄する。これはオプションです。 </li><li> 1％w / vウシ血清aで希釈した一次抗体（抗CD3 1:50、抗FoxP3 1：200および抗IL-17 1:50）で組織をインキュベートする。PBS中、室温で一晩インキュベートした。 注：1スライドあたりのボリュームは、組織のサイズに依存しますが、通常は50〜150μLです。 CD3、CD8、およびFoxP3抗体（ すなわち、ウサギIgアイソタイプ対照抗体、マウスIgG1アイソタイプ対照抗体およびヤギ抗体と同じ希釈でネガティブコントロールスライドに対する未知の特異性を有する同じアイソタイプクラスの抗体で一次抗体を置換するIgGアイソタイプ対照抗体）。 </li><li>スライドを5分間PBSで3回洗浄する。 </li><li> 一次抗体種および/またはアイソタイプ（ すなわち、ロバ抗ヤギIgG Alexa 488、ロバ抗ウサギIgG A546およびロバ抗マウスA647の1：200）を標的とする蛍光標識された二次抗体の組合せで組織をインキュベートする。 1％BSA含有PBS中、室温で1時間インキュベートする。 注：1スライドあたりのボリュームは、組織のサイズに依存しますが、通常50〜150μLです。 <ol><li>後二次抗体を添加し、暗箱に保管するか、ボックスをアルミ箔で包むことにより、スライドを可能な限り光から保護する。 </li></ol></li></ol> 4.マウントおよび対比組織スライド<ol><li>スライドを5分間PBSで3回洗浄する。 </li><li>核対比染色剤（ 例えば、 DAPI）を含有する水性防フェード装着培地を用いてスライドをマウントする。できるだけ早く（2週間以内に）蛍光顕微鏡を用いてスライドを分析する。分析するまで4℃で暗所にスライドを保存する。 </li></ol> 5.染色された組織スライドを分析する<ol><li> 20〜25倍の対物レンズを備えた蛍光顕微鏡を用いて各スライドの4つの画像を取得する。スライドに含まれる全腫瘍領域のランダムな場所で画像を撮影し、腫瘍の代表的な部分をキャプチャします。 注：250倍の標準倍率を使用する必要があります。任意の蛍光o使用される蛍光色素を視覚化するのに必要なフィルターおよびレーザーを備えていれば、レーザー走査顕微鏡を使用することができる。 <ol><li> Alexa 488の視覚化のために、励起最大値490、最大発光量525を使用します。 Alexa 546の視覚化のために、励起最大値は556、発光最大値は573である。 Alexa 647の可視化のために、励起最大値650および発光最大値665を使用する。 DAPIの視覚化のために、励起最大値を358、発光最大値を461とする。 </li><li>イメージをイメージファイル（ すなわち、 jpegおよびtiff）として、ユーザが利用可能なソフトウェアに保存する。 </li></ol></li><li> 病理学者に相談した後、腫瘍上皮細胞と間質細胞の核および細胞の形状に基づいて、腫瘍上皮と腫瘍間質領域とを区別する。 <ol><li>総間質の表面積を決定するには、（腫瘍細胞ではなく）間質細胞が占めるすべての領域の周りに線を引いて、顕微鏡の製造元が提供する画像分析ソフトウェアを使用して表面積を測定する。 <ol><li>画像の下にある「オーバーレイ」タブをクリックします。 「閉じたポリライン」シェイプを選択し、それをクリックします。腫瘍の上皮と間質の境界を境に、最初の点に再び到達するまでその領域をクリックします。これは、その領域の尺度となります。 注：形状が閉じられると、数は、選択された画像（A = X 2ミクロン）の表面領域を取り囲む形状の横に表示されます。 </li></ol></li><li>この表面積を総画像表面積（画像特性で提供される）から差し引いて、上皮表面積を計算する。提供された領域のサイズを記録し、それを上皮表面領域から差し引くことによって、血管、壊死および自家蛍光領域を取り除く。 </li><li>すべての表面積の数値をスプレッドシートファイルに保存して平均表面積を計算し、1スライドあたりの細胞数。 </li><li>画像解析ソフトウェアを使用して、4つのチャンネルすべての蛍光をチェックすることにより、細胞が単一陽性か、二重陽性か、または三重陽性かを決定する。 <ol><li> ImageJを使用して、各画像の一重、二重および三重陽性細胞を数えます。 <ol><li> ImageJをダウンロードしてください。 &quot;ファイル&quot;と &quot;開く&quot;をクリックして画像を開き、分析する画像を選択します。 「ポイントツール」（4行の真ん中の赤い四角形）を右クリックし、「マルチポイントツール」を選択します。 「マルチポイントツール」をダブルクリックして、各セルタイプごとに異なるカウンター番号を選択して、画像内の異なるセルタイプの数を数えます。 注：1つ、2つ、または3つの蛍光色の存在によって識別されるように、それぞれの異なる細胞タイプのすべての細胞を数えます。この核対比染色はすべての細胞に存在し、腫瘍細胞を免疫細胞と区別するために使用されるため、DAPIを除外する。各セルタイプがカウントされます別のカウンター番号を使用します。毎回異なるカウンター番号を選択することによって、腫瘍上皮および間質領域で別々に各細胞型の細胞数を数えます。血管や大部分の自家蛍光領域内の細胞は計数しないでください。 </li><li>スプレッドシートファイルに各画像の各カウンタービンで分析されたセルの数を記録します。 </li><li>分析された腫瘍上皮および腫瘍間質の総表面積にわたって各細胞型の総細胞数を割る。 </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 6.統計分析注：すべての統計分析は、データの品質を保証するために統計学者と協議する必要があります。一般的な統計については、任意の医療統計ガイド14を使用してください。 <ol><li>スピアマンのランク相関rho検定を用いて細胞頻度間の相関関係を試験する。 </li><li>陽性細胞数の統計的差異を試験するWilcoxon Mann-Whitney検定を使用して、患者群間で評価した。 </li><li> Kaplan-Meier曲線生成および対数較正を用いて、細胞数と無病生存率（ すなわち、診断から死亡または疾患の局所再発または遠隔再発までの時間）の相関を試験する。ランク分析15 。 </li><li> Cox比例ハザード回帰分析を使用して多変量解析を実行します。 </li></ol>

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著者は商業的または財務的に利益相反を宣言していません。

記載されたプロトコールについて、最も重要な工程の1つは、使用される一次抗体の正確な希釈を決定することである。これらの特異的なAlexa標識抗体の製造元が推奨するように、標識二次抗体の希釈度は1：200であった。一次抗体の希釈は、好ましくは意図された組織型の2つの異なる試料（この場合はOPSCC）を用いて連続希釈によって決定されるべきである。最適な作業希釈は、バックグラウ...

口腔咽頭扁平上皮癌（OPSCC）は、口腔咽頭に由来する扁平上皮細胞癌の異種群である。 OPSCCの危険因子は、ヒトパピローマウイルス（HPV）感染症とアルコールとタバコの使用1、2が挙げられます。免疫反応の役割とこれを臨床現場でどのように使用するかは、まだ検討され始めています。腫瘍微小環境は、癌部位に引き付けられる免疫細胞によって浸潤される。 OPSCC患​​者3では、高いCD8 +細胞傷害性T細胞頻度が改善された生存と相関しているが、TregおよびTh17細胞を含む他のT細胞サブセットの役割は依然として不明である4 。 Th1およびTh17細胞は、腫瘍細胞を標的とする免疫応答を助長すると考えられているが、Tregsは、他のT細胞の活性を抑制する能力に関してよく知られている5 。しかしながら、Tregsは、異なる腫瘍のタイプ6における好都合な反応および好ましくない反応の両方と相関することが見出されている6 。血液中に存在する全ての免疫細胞が腫瘍に同程度まで浸潤するわけではないので、局所腫瘍微小環境を研究することは、腫瘍に対して指向される免疫応答の最も信頼できる尺度を提供する。この研究の目的は、免疫細胞の数とタイプと臨床結果との間の相関関係を決定することである。我々は、ヒトOPSCCにおける種々のT細胞亜集団の数および局在を分析するために、4色蛍光IHCイメージングを使用した。 我々は、分化経路がTh17細胞と密接に関連しているトータルTリンパ球（CD3 + ）、Th17細胞、および免疫抑制性FoxP3 + Tregsに焦点を当てた。 Th17細胞は、CD3とIL-17との組み合わせによって特徴付けられる。サイトカインIL-17はまた、非T細胞によって産生され得る7 。我々は、イントラ - エピトープの分布を決定したヘリカルおよび間質性T細胞、Tregs、Th17、およびIL-17 +非T細胞を、OPSCC症例の大規模シリーズで分析し、患者の生存との相関を分析した。多色蛍光IHCを使用して、CD3、Foxp3、およびIL-17の発現を、DAPI対比染色剤と組み合わせて同定した。このアッセイは、腫瘍細胞（DAPI核染色を使用）および浸潤T細胞集団（異なるマーカーの組み合わせを使用する）の両方の容易かつ明確な同定を可能にした。試料の調製および染色の後、蛍光顕微鏡および画像化ソフトウェアを使用して、使用される異なる蛍光色を分離し、腫瘍上皮および腫瘍関連間質の両方に存在する細胞の数および型を決定した。 免疫細胞集団を定量化および表現する別のアッセイは、フローサイトメトリー分析、または腫瘍または末梢サンプル（ すなわち血液または腹水）の飛行時間（CyTOF）分析によるサイトメトリーである。これを使用する異なる細胞型の局在化および相対的分布に関するすべての情報が失われる。末梢サンプルの使用および分析はまた、どの細胞が腫瘍微小環境に浸潤できるかについての情報を提供しない。血液および腹水免疫細胞の分析は、腫瘍組織8,9の免疫細胞浸潤の表現型および頻度を反映しないことが示されています。 もう一つの選択肢は、明視野顕微鏡の使用である。蛍光イメージングに対するこの技術の利点は、組織自己蛍光がないことである。いくつかの試料はより多くの自家蛍光、特に赤血球を含有するが、好中球顆粒球を含む他の細胞型も含まれるが、これらの領域はほとんどすべての試料の分析において容易に除去することができる。免疫蛍光法は、標的蛍光体のパネルを使用することにより、1つの試料中の複数のマーカーを分析する利点を提供するnt個の波長を有する。これは、特定の抗原についての十分な数の標識および市販の抗体アイソタイプの欠如のために、明視野顕微鏡法については現在同じ程度には不可能である。 ここで説明した多色蛍光IHC技術は、例えば、ヒト白血球抗原（HLA）とPD-L1 10、11などの異なる免疫細胞集団、ならびに腫瘍細胞発現分子を研究する癌の種類及び抗体の組合せさまざまに使用されています12 。このプロトコールは、多くの異なるタイプのサンプルおよび抗体を用いて確立され、検証されている。

<table><tbody><tr><td>Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor</td><td>Milestone and Histostar</td><td></td><td>Automated tissue processor</td></tr><tr><td>Histostar</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Tissue block embedding machine</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>milliQ water</td><td>Elaga Purelab Chorus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraffin wax/Paraclean</td><td>Klinipath</td><td>5079A</td><td></td></tr><tr><td>Microtome tissue holder</td><td>Leica</td><td>RM225</td><td></td></tr><tr><td>Flex IHC side</td><td>Dako</td><td></td><td>Tissue slide</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merk-Milipore</td><td>1,083,821,000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Baker</td><td>1073</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Bio-Rad</td><td>BUF036A</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-CD3</td><td>Abcam</td><td>ab828</td><td>Titrate required antibody dilution</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 anti-FoxP3</td><td>Abcam</td><td>ab20034</td><td>Titrate required antibody dilution</td></tr><tr><td>Goat IgG anti-IL-17</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF-317-NA</td><td>Titrate required antibody dilution</td></tr><tr><td>Rabbit Ig isotype control antibody</td><td>Abcam</td><td>ab27472</td><td>Use at same final concentration as anti-CD3</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 isotype control antibody</td><td>Abcam</td><td>ab91353</td><td>Use at same final concentration as anti-FoxP3</td></tr><tr><td>Goat IgG isotype control antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-6202</td><td>Use at same final concentration as anti-IL-17</td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit IgG A546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10040</td><td>Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS</td></tr><tr><td>Donkey anti-mouse-A647</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A31571</td><td>Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS</td></tr><tr><td>Donkey anti-goat IgG A488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11055</td><td>Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS</td></tr><tr><td>VectaShield containing DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>LSM700 confocal laser scanning microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective</td><td>Zeiss</td><td>420852-9972-720</td><td></td></tr><tr><td>LSM Zen Software</td><td>Zeiss</td><td>version 2009</td><td></td></tr><tr><td>LSM Image Browser</td><td>Zeiss</td><td>version 4.2.0.121</td><td>Available to download at www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html.</td></tr><tr><td>SPSS</td><td>IBM Corp.</td><td>version 20.0</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>version 1.50i</td><td>Available to download at http://rsb.info.nih.gov/ij.</td></tr></tbody></table>

four-color fluorescence immunohistochemistry of t-cell subpopulations in archival formalin-fixed, paraffin-embedded human oropharyngeal squamous cell carcinoma samples

4色蛍光免疫組織化学（IHC）技術は、それらの相対的分布および組織におけるそれらの局在を考慮に入れながら、目的の細胞集団を定量する方法である。この技術は、様々な腫瘍型の免疫浸潤を研究するために広く適用されている。腫瘍微小環境は、腫瘍部位に引き付けられる免疫細胞によって浸潤される。異なる免疫細胞集団は、腫瘍微小環境において異なる役割を果たすこと、および疾患の転帰に異なる影響を有することが見出されている。この原稿では、口腔咽頭扁平上皮癌（OPSCC）上の多パラメータ蛍光IHCの使用を例として説明します。この技術は、他の組織サンプルおよび目的の細胞型に拡張することができる。提示された研究では、大きなOPSCCコホート（n = 162）の上皮内および間質コンパートメントを分析した。我々は、全Tリンパ球（CD3 + ）、免疫抑制性調節間質から腫瘍上皮を区別するために核対比染色を用いて、T細胞（Tregs; すなわち FoxP3 + ）およびTヘルパー17（Th17）細胞（ すなわち、 IL-17 + CD3 +腫瘍内IL-17 +非T細胞の数が少ない患者において、多数のT細胞が無病生存期間の改善と相関することが見出された。これは、IL-17 +非T細胞がOPSCCにおける貧弱な免疫応答と相関し得ることを示唆し、これはIL-17と癌患者における生存率の間の相関と一致する。現在、7つまでの異なる蛍光色素を用いて新規なマルチパラメータ蛍光IHC技術が開発されており、腫瘍微小環境における免疫細胞のより正確な特徴付けおよび局在化が可能になる。

前述したように選択された1970年から2011年の間にライデン大学医療センター、ライデン、オランダで診断原発口腔咽頭腫瘍から得られたFFPE前処理腫瘍サンプルのシリーズ、（N = 162）は、13に記載のプロトコルを用いて染色しました。各スライドの1から4つのランダム画像を分析した（ 図1 ）。いくつかの自家蛍光細胞が示され?...

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Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

多パラメータ蛍光免疫組織化学を用いて、腫瘍微小環境における免疫細胞集団の数、相対分布、および局在を評価することができる。この文献は、口腔咽頭癌におけるT細胞亜集団を分析するためのこの技術の使用を記載している。

ホルマリン固定パラフィン包埋ヒト卵黄扁平上皮癌試料におけるT細胞亜集団の四色蛍光免疫組織化学

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

four-color-fluorescence-immunohistochemistry-t-cell-subpopulations

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.6K ビュー.  Leiden University Medical Center. 多パラメータ蛍光免疫組織化学を用いて、腫瘍微小環境における免疫細胞集団の数、相対分布、および局在を評価することができる。この文献は、口腔咽頭癌におけるT細胞亜集団を分析するためのこの技術の使用を記載している。 

ビデオ: Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

口腔扁平上皮癌の同所性マウスモデルにおける腫瘍細胞の浸潤の多光子イメージング

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

医学

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of areas of distinct differentiation into recognized histological subtypes, or different pathological grade, often there are more subtle differences in phenotype which defy accurate classification (Figure 1). Ultimately, since morphology is dictated by the underlying molecular phenotype, areas with visible differences are likely to be accompanied by differences in the expression of proteins which orchestrate cellular function and behavior, and therefore, appearance. The significance of visible and invisible (molecular) heterogeneity for prognosis is unknown, but recent evidence suggests that, at least at the genetic level, heterogeneity exists in the primary tumor1,2, and some of these sub-clones give rise to metastatic (and therefore lethal) disease. 
Moreover, some proteins are measured as biomarkers because they are the targets of therapy (for instance ER and HER2 for tamoxifen and trastuzumab (Herceptin), respectively). If these proteins show variable expression within a tumor then therapeutic responses may also be variable. The widely used histopathologic scoring schemes for immunohistochemistry either ignore, or numerically homogenize the quantification of protein expression. Similarly, in destructive techniques, where the tumor samples are homogenized (such as gene expression profiling), quantitative information can be elucidated, but spatial information is lost. Genetic heterogeneity mapping approaches in pancreatic cancer have relied either on generation of a single cell suspension3, or on macrodissection4. A recent study has used quantum dots in order to map morphologic and molecular heterogeneity in prostate cancer tissue5, providing proof of principle that morphology and molecular mapping is feasible, but falling short of quantifying the heterogeneity. Since immunohistochemistry is, at best, only semi-quantitative and subject to intra- and inter-observer bias, more sensitive and quantitative methodologies are required in order to accurately map and quantify tissue heterogeneity in situ.
We have developed and applied an experimental and statistical methodology in order to systematically quantify the heterogeneity of protein expression in whole tissue sections of tumors, based on the Automated QUantitative Analysis (AQUA) system6. Tissue sections are labeled with specific antibodies directed against cytokeratins and targets of interest, coupled to fluorophore-labeled secondary antibodies. Slides are imaged using a whole-slide fluorescence scanner. Images are subdivided into hundreds to thousands of tiles, and each tile is then assigned an AQUA score which is a measure of protein concentration within the epithelial (tumor) component of the tissue. Heatmaps are generated to represent tissue expression of the proteins and a heterogeneity score assigned, using a statistical measure of heterogeneity originally used in ecology, based on the Simpson's biodiversity index7.
To date there have been no attempts to systematically map and quantify this variability in tandem with protein expression, in histological preparations. Here, we illustrate the first use of the method applied to ER and HER2 biomarker expression in ovarian cancer. Using this method paves the way for analyzing heterogeneity as an independent variable in studies of biomarker expression in translational studies, in order to establish the significance of heterogeneity in prognosis and prediction of responses to therapy.

Here we describe a method to quantify molecular heterogeneity in histological sections of tumor material using quantitative immunofluorescence, image analysis, and a statistical measure of heterogeneity. The method is intended for use in clinical biomarker development and analysis.

定量的免疫蛍光法を用いて腫瘍におけるタンパク質発現の不均一性のマッピング

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of tissue samples from formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsies has become a key tool for understanding the complexity of tumor immunology and discovering novel predictive biomarkers for cancer immunotherapy. Immunoprofiling analysis of tissues requires the evaluation of combined markers, including inflammatory cell subpopulations and immune checkpoints, in the tumor microenvironment. The advent of novel multiplex immunohistochemical methods allows for a more efficient multiparametric analysis of single tissue sections than does standard monoplex immunohistochemistry (IHC). One commercially available multiplex immunofluorescence (IF) method is based on tyramide-signal amplification and, combined with multispectral microscopic analysis, allows for a better signal separation of diverse markers in tissue. This methodology is compatible with the use of unconjugated primary antibodies that have been optimized for standard IHC on FFPE tissue samples. Herein we describe in detail an automated protocol that allows multiplex IF labeling of carcinoma tissue samples with a six-marker multiplex antibody panel comprising PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67, and AE1/AE3 cytokeratins with 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole as a nuclear cell counterstain. The multiplex panel protocol is optimized in an automated IHC stainer for a staining time that is shorter than that of the manual protocol and can be directly applied and adapted by any laboratory investigator for immuno-oncology studies on human FFPE tissue samples. Also described are several controls and tools, including a drop-control method for fine quality control of a new multiplex IF panel, that are useful for the optimization and validation of the technique.

A detailed protocol for a six-marker multiplex immunofluorescence panel is optimized and performed, using an automated stainer for more consistent results and a shorter procedure time. This approach can be directly adapted by any laboratory for immuno-oncology studies.

ホルマリン固定癌組織標本の腫瘍免疫研究の自動多重蛍光パネル

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of ...

がん研究

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated with a better outcome than alcohol- and tobacco-related OPSCC. Chromogenic in situ hybridization (CISH) of HPV viral RNA could allow the semiquantitative evaluation of viral transcripts of the oncogenic proteins E6 and E7 and an in situ visualization with a good spatial resolution. This technique allows the diagnosis of an active infection with the visualization of HPV transcription in the tumoral HPV-infected cells. An advantage of this technique is the avoidance of contamination from nonneoplastic HPV-infected cells adjacent to the tumor. Overall, its good diagnosis performances have it considered to be the gold standard for active HPV infection identification. Since E6 and E7 viral protein interaction with cell proteins pRb and p53 is mandatory for cell transformation, HPV RNA CISH is functionally relevant and acutely reflects active oncogenic HPV infection. This technique is clinically relevant as well since &#34;low&#34; or &#34;high&#34; HPV transcription levels helped the identification of two prognosis groups among HPV-related p16-positive head and neck cancer patients. Here we present the protocol for manual HPV RNA CISH performed on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) slides with a kit obtained from the manufacturer. Instead of chromogenic revelation, RNA in situ hybridization may also be performed with fluorescent revelation (RNA FISH). It may also be combined with conventional immunostaining.

Human papillomavirus (HPV) RNA chromogenic in situ hybridization is considered to be one of the gold standards for active human papillomavirus infection detection within tumors. It allows the visualization of HPV E6-E7 mRNA expression with localization and semiquantitative evaluation of its signal.

発色性の発色性ハイブリダイゼーションは、HPV関連の頭頸部癌診断のためのツールを提供する

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...

遺伝学

Expanding the Comprehension of the Tumor Microenvironment using Mass Spectrometry Imaging of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Samples

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the tumor immune landscape. Although standard immunohistochemistry is suitable for studying tissue architecture, it is limited to the analysis of a small number of markers. Conversely, techniques such as flow cytometry can evaluate multiple markers simultaneously, although information about tissue morphology is lost. In recent years, multiplexed strategies that integrate phenotypic and spatial analysis have emerged as comprehensive approaches to the characterization of the tumor immune landscape. Herein, we discuss an innovative technology combining metal-labeled antibodies and secondary ion mass spectrometry focusing on the technical steps in assay development and optimization, tissue preparation, and image acquisition and processing. Before staining, a metal-labeled antibody panel must be developed and optimized. This hi-plex image system supports up to 40 metal-tagged antibodies in a single tissue section. Of note, the risk of signal interference increases with the number of markers included in the panel. After panel design, particular attention should be given to the metal isotope assignment to the antibody to minimize this interference. Preliminary panel testing is performed using a small subset of antibodies and subsequent testing of the entire panel in control tissues. Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections are obtained and mounted on gold-coated slides and further stained. The staining takes 2 days and closely resembles standard immunohistochemical staining. Once samples are stained, they are placed in the image acquisition instrument. Fields of view are selected, and images are acquired, uploaded, and stored. The final stage is image preparation for the filtering and removal of interference using the system&#39;s image processing software. A disadvantage of this platform is the lack of analytical software. However, the images generated are supported by different computational pathology software.

In the era of cancer immunotherapy, interest in elucidating tumor microenvironment dynamics has increased strikingly. This protocol details a mass spectrometry imaging technique with respect to its staining and imaging steps, which allow for highly multiplexed spatial analysis.

ホルマリン固定およびパラフィン包埋組織サンプルの質量分析イメージングを用いた腫瘍微小環境の理解を広げる

Advances in immune-based therapies have revolutionized cancer treatment and research. This has triggered growing demand for the characterization of the ...

肺扁平上皮癌におけるmIHCを用いた腫瘍微小環境の解読

Multiplex Immunohistochemistry Staining for Paraffin-embedded Lung Cancer Tissue

Lung cancer is the leading cause of malignant tumor-related morbidity and mortality all over the world, and the complex tumor microenvironment has been considered the leading cause of death in lung cancer patients. The complexity of the tumor microenvironment requires effective methods to understand cell-to-cell relationships in tumor tissues. The multiplex immunohistochemistry (mIHC) technique has become a key tool for inferring the relationship between the expression of proteins upstream and downstream of signaling pathways in tumor tissues and developing clinical diagnoses and treatment plans. mIHC is a multi-label immunofluorescence staining method based on Tyramine Signal Amplification (TSA) technology, which can simultaneously detect multiple target molecules on the same tissue section sample to achieve different protein co-expression and co-localization analysis. In this experimental protocol, paraffin-embedded tissue sections of lung squamous carcinoma of clinical origin were subjected to multiplex immunohistochemical staining. By optimizing the experimental protocol, multiplex immunohistochemical staining of labeled target cells and proteins was achieved, solving the problem of autofluorescence and channel crosstalk in lung tissues. In addition, multiplex immunohistochemical staining is widely used in the experimental validation of tumor-related, high-throughput sequencing, including single-cell sequencing, proteomics, and tissue space sequencing, providing intuitive and visual pathology validation results.

著者スポットライト:肺がんサンプルにおける多色蛍光局在の強化(英語)

This experimental protocol describes and optimizes a multiplex immunohistochemistry (IHC) staining method, mainly by optimizing single-channel antibody incubation conditions and adjusting the settings of antibodies and channels to solve the problems of autofluorescence and channel crosstalk in lung cancer tissues of clinical origin.

パラフィン包埋肺癌組織のマルチプレックス免疫組織化学染色

Lung cancer is the leading cause of malignant tumor-related morbidity and mortality all over the world, and the complex tumor microenvironment has been ...

がん組織における免疫細胞マーカーのin situ免疫組織化学的検出

Multiplex Cyclic Fluorescent Immunohistochemistry

The tumor microenvironment involves interactions between host cells, tumor cells, immune cells, stromal cells, and vasculature. Characterizing and spatially organizing immune cell subsets and target proteins are crucial for prognostic and therapeutic purposes. This has led to the development of multiplexed immunohistochemistry staining methods. Multiplex fluorescence immunohistochemistry allows the simultaneous detection of multiple markers, facilitating a comprehensive understanding of cell function and intercellular interactions. In this paper, we describe a workflow for the multiplex cyclic fluorescent immunohistochemistry assay and its application in the quantification analysis of lymphocyte subsets. The multiplex cyclic fluorescent immunohistochemistry staining follows similar steps and reagents as standard immunohistochemistry, involving antigen retrieval, cyclic antibody incubation, and staining on a formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue slide. During the antigen-antibody reaction, a mixture of antibodies from different species is prepared. Conditions, such as antigen retrieval time and antibody concentration, are optimized and validated to increase the signal-to-noise ratio. This technique is reproducible and serves as a valuable tool for immunotherapy research and clinical applications.

著者スポットライト:蛍光免疫組織化学を用いたがん組織における免疫細胞浸潤の効率的な検出(英語)

Multiplex cyclic immunohistochemistry allows in situ detection of multiple markers simultaneously using repeated antigen-antibody incubation, image scanning, and image alignment and integration. Here, we present the operating protocol for identifying immune cell substrates with this technology in lung cancer and paired brain metastasis samples.

ホルマリン固定パラフィン包埋ヒト卵黄扁平上皮癌試料におけるT細胞亜集団の四色蛍光免疫組織化学

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口腔扁平上皮癌の同所性マウスモデルにおける腫瘍細胞の浸潤の多光子イメージング

定量的免疫蛍光法を用いて腫瘍におけるタンパク質発現の不均一性のマッピング

ホルマリン固定癌組織標本の腫瘍免疫研究の自動多重蛍光パネル

発色性の発色性ハイブリダイゼーションは、HPV関連の頭頸部癌診断のためのツールを提供する

ホルマリン固定およびパラフィン包埋組織サンプルの質量分析イメージングを用いた腫瘍微小環境の理解を広げる

パラフィン包埋肺癌組織のマルチプレックス免疫組織化学染色

パラフィン包埋肺癌組織のマルチプレックス免疫組織化学染色

パラフィン包埋肺癌組織のマルチプレックス免疫組織化学染色

マルチプレックスサイクリック蛍光免疫組織化学

マルチプレックスサイクリック蛍光免疫組織化学