ブリティッシュ・コロンビア大学のGeoffrey Wasteneys教授に、シードを表現するRFP-TUB6と匿名の校閲者の助けに感謝します。ヒュー・ディキンソン教授には、機械的なサポートとしてのセルロースフィルムの使用と、写真撮影のためのジョン・ベイカーの使用について警告してくれたことに感謝します。この研究は、BBSRCの研究助成金BB / G013993 / 1とBB / D004055 / 1のIM、およびBBSRC博士号訓練賞とClarendon Scholarship of CK

1.チャンバーの作成<ol><li>ガラスカッターを使用して、厚さ1 mmの顕微鏡スライドの端から3 mm幅のストリップを切断します。シアノアクリレート超接着剤または両面テープを使用して、これらのガラスストリップを第2の顕微鏡スライド（ 図1A ）の幅にわたって約45mm離して接着します。 1つのチャンバーに1つのスライドが必要です。さらに、寒天スラブを入れるための追加のスライドも必要です（スライド1枚で2〜3寒天スラブが得られます）。スライドを再利用できます。 </li><li> ガラスストリップの間に、ガス透過性のポリ（ジメチルシロキサン）ガムから同じ高さのガスケットを成形する。スライド（ 図1B ）にポリ（ジメチルシロキサン）ガムのボールを置き、少量の100％無水エタノールで第2のスライドを湿らせ、第2のスライドでポリ（ジメチルシロキサン）ガムボールを平らにして高さに達するまでのガラスストリップ（ 図1C ）。 <ol><li>必要ならば、余分なポリ（ダイム剃刀の刃で平らにすることを含む。 </li></ol></li><li>無水エタノールで湿らせた適切なカッターまたはカミソリの刃を使用して、ポリ（ジメチルシロキサン）ガムの内部を除去し、後で苗木および寒天スラブを保持する空洞を形成する（ 図1D ）。 </li><li>カミソリの刃で丁寧にトリミングして、最終的な肉厚が約2 mmのガスケットを作ります（ 図1E ）。ポリ（ジメチルシラキサン）障壁を通るガスの透過性は、50μm以上の厚さとは無関係です。 </li></ol>成長培地の寒天凝固スラブの作製<ol><li> 2つのガラスストリップを有する顕微鏡スライドガラス上に、ガラスストリップ上に載るようにカバーガラス（22mm×50mm）を配置する。 </li><li>ピペットは、1％w / vのスクロースおよび1.5％w / v寒天（1 / 2MS）を含む半強度の半透明のMurashigeおよびSkoog増殖培地を、得られた空間に溶解した後者が完全に満たされるまで（約1mLの全容量）カバースリップの下に置き、寒天がセットされるまで（約5分間）放置する。 注：薬理化合物は、スラブを注ぐ前に液体培地に適切な濃度を加えることによって、寒天スラブを介して投与することができる。これは、デキサメタゾン12 、イソキサベン、2,6-ジクロロベンゾニトリル（DCB）、オリザリン、およびラトランクリンBについて首尾よく試験された。 </li></ol> 3 。チャンバーセットアップの終了<ol><li>空気は、少量のPFDをチューブ7内で振盪することによってPFDを平衡させる。少量（約200μL）の空気平衡PFDをゲルパイプのウェルに加えますが、チャンバーを完全に満たさないようにしてください。このPFDは、寒天スラブがチャンバー内に置かれるとき、寒天スラブ下の気泡の捕捉を回避するのに役立つ。 </li><li>寒天スラブからカバースリップを取り除き（上記のステップ2.2）、カミソリの刃を使ってdeの一部を切り取る欲しいサイズと形状。次に、ゲルパイプの井戸に入れます（ 図1F ）。ガスケットには2〜4 mmの隙間があります。 </li><li>空気平衡PFDでチャンバーを完全に満たしてください。 </li><li> PFDに浮遊する子葉と胚軸が吊り下げられた寒天スラブ上に、1つ以上のA. thaliana苗（2〜3日以上の作像には最大3苗）を置く（ 図1G ）。 </li><li>実生を得るために、種子を70％エタノールで滅菌し、1％スクロースおよび0.8％寒天を補充した1 / 2MS培地上に植え、4℃で2〜4日間層別化し、垂直配向プレート上で22℃、16℃ h光/ 8時間の暗視野。側方の根を画像化するために、画像化チャンバに移す前に植物を7〜10日間増殖させる。 </li><li>チャンバーを閉じるには、目的の光学系に合ったカバースリップをガラス顕微鏡スライドガラスの端に軽く押してカバースリップ両方のガラスストリップ上に置かれる（ 図1H ）。 </li><li>必要に応じて、両端に半分の長さに切断した幅1.25cmの細孔手術用テープのストリップでカバーガラスを固定する（ 図1I ）。撮像前に試料を約30分間沈降させる。これにより、イメージング中の標本の移動が最小限に抑えられます。 </li><li>成長のために制御された基質を維持するために直立顕微鏡で画像化を行う。 20X / 0.7NAまたは63X / 1.2NA CS2の目標を使用してください。 </li></ol>

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著者は何も開示することはない。

ここに提示されている方法は、2〜3日間の側方根の発達の高解像度共焦点画像化のための簡単な戦略である。 48時間までの期間、側根発達に対するイメージングシステムの悪影響は観察されなかった。 48時間後、根の実質的なサブセット（37％）はプレート上の平均根の成長に匹敵する速度で成長し続けたが、平均側方根の成長は遅くなった。したがって、十分に多数の根を画像化することにより、48時間後に増殖が遅くなる根を排除することができる。撮像チャンバの体系的検査は、72時間よりも長い時間実施されなかったが、延長された撮像期間が望ましい場合には、代替戦略が推奨される。画像化チャンバは、適切な環境条件が提供された場合、顕微鏡ステージ上に連続的に残されてもよく、または成長施設に移され、定期的に顕微鏡に戻されてもよい。これにより、多数のチャンバが平行に結像されることが可能になる。/ p&gt; ここに記載されたチャンバの1つの利点は、側方の根がそれらの位置に固定され、高解像度水浸レンズを使用して画像化できることである。空間的安定性は、支持寒天スラブにおいて使用される寒天濃度に決定的に依存する。当初、0.8％寒天から2％寒天の種々の濃度の範囲で試験したところ、この範囲の高濃度は安定して根に固定されていたが、根の成長はより速く減速し、いくつかの根は細胞伸長の減少を含む機械的ストレスの徴候を示した。対照的に、低寒天濃度は、画像化中にx、y、およびzに漂流する必要な支持および根を提供しなかった。最適な1.5％寒天スラブは、有害な機械的影響なしに試験片の位置を固定する。これらの条件下では、最初の30分程度で安定した後、根は数時間にわたって安定し、一晩のデータ取得が可能になる。 4Dデータの取得中、zスタック範囲は典型的にはb追加の5〜10μmの厚さであったが、これは主に、zドリフトまたは揺動ではなく、横方向の根の面外成長に対応するためであった。標準的な寒天濃度は浸透に対する耐性を提供するが、重力によって成長する根は最終的に寒天に浸透する。しかしながら、画像化チャンバーのわずかな変更によって、根の成長はカバースリップと平行に維持され、より古い側方の根および主な根を画像化することが可能になる。さらに、基本イメージングチャンバは、胚軸用に容易にカスタマイズすることができる。このシステムでは胚軸はより自由に浮遊しているので、画像取得のためのz軸ブラケットは通常約20μmに増加した。この研究では、基板の特性を制御することを可能にした直立型顕微鏡を使用した。イメージングチャンバは、倒立型顕微鏡構成に適応可能であってもよいが、断熱臓器に対する硬質カバースリップの時間依存性の影響を評価する必要がある。 </p&gt; Littlejohnらは、PFD自体が生物学的分子を容易に溶解しないことを指摘しており、これは薬理学的化合物の送達のために直接使用することができないことを意味する7 。この問題は、そのような化合物を寒天スラブが載っている固化した増殖培地のスラブを通して供給することによって克服された。灌流システムは、ウォッシュアウト実験のための選択の方法のままであるが、イメージングチャンバは、デキサメタゾン12および他の化合物の投与に首尾よく使用されている。一方、この記事はWagenheimの準備中であり、同僚らは、薄いシート顕微鏡法を用いて側根発達を画像化するためのチャンバーを記載している。

植物発達の基礎となる細胞および細胞下の過程を研究するために、高分解能の長期間経過イメージング戦略に対する需要が高まっている。このようなイメージング実験における重要な課題は、十分な気体交換と水および栄養剤の供給を含む生理学的条件の維持である 1,2,3 。最適な光学分解能のために高い開口数を有する対物レンズを利用するためには、試料をカバースリップに近接して平行に配置する必要がある。 x、y、およびz方向の動きは、理想的には、イメージング中に最小でなければならない。 苗はしばしば短期間のイメージングのために水または水溶液中に設置されるが、水はCO 2およびO 2 （20℃、0.1MPaでそれぞれ1.54mg / mLおよび0.04mg / mL）それは長期間の実験には適していません。一定レベルの酸素および栄養素を維持する灌流システムは、この問題の1つの解決策であり、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM） 1,2,3および光シート顕微鏡（LSM） 5の両方で開発されている。 RootChip 2やRootArray 3のようなシステムは、発達する根の時間経過イメージングのために特別に設計されており、カスタムビルドマルチ検体装置に種子を発芽させることが含まれています。これらの配置は、最小の機械的摂動を保証し、複数の苗の平行分析のために設計されているが、細胞内構造のイメージングには最適化されていない。 Calderらは、検体がメッシュによって所定の位置に保持される細胞下構造の画像化に最適化された、より複雑な灌流ベースの画像化チャンバを設計した高倍率の液浸レンズ1の使用を可能にする。 ここに提示されているのは、灌流システムに基づいていないが、 シロイヌナズナイメージングのためのマウント媒体として最近普及しているペルフルオロカーボンであるペルフルオロデカリン（PFD）を利用する、この問題に対する代替の簡単な解決法である。そのような用途では、CO 2およびO 2 （PFD中のO 2については、水中で0.04mg / mLと比較して1.9g / mL） 9を溶解するためのPFDの高い容量は、浸漬した組織によるガス交換を可能にする。さらに、PFDは非蛍光性であり、その屈折率（1.313）は水（1.333）のそれに匹敵し、空気（1.000）よりもサイトゾルの屈折率（〜1.4）に近い。ペルフルオロカーボンは、様々な植物および植物に最小の生理学的効果を有することが報告されているPFDに沈めたときに容易に発芽し、水を供給したときに少なくとも2日間通常の成長と発育を示す大根種子が6である。 Arabidopsis種子の発芽についても同様の観察がなされている6 。 Littlejohnらは、浸潤後のシロイヌナズナ葉組織におけるPFDの分布を直接的にイメージ化する誘導ラマン散乱に基づいて、PFDが生きた細胞によって取り込まれない可能性が高いと結論している[ 8] 。 PFDは以前は空中組織を画像化するために主に使用されていましたが、表面張力が低いために空中に容易に浸透するため、イメージング深度が大幅に増加します。ここで、PFDは、発生する側方の根の長期共焦点画像化に採用される。この構成では、寒天で固められ、PFDに浸された成長培地のスラブ上に1つ以上の実生を置く。 PFDは、gイメージングチャンバー内での無菌交換、無酸素状態の防止。 PFDは非常に揮発性であるため、高いガス透過性（CO 2に対して1.5×10 -12 pmol m -1 s -1 Pa -1 ）も有するポリ（ジメチルシロキサン）ガムのガスケットによって保持される。栄養素と水は、寒天で固めた培地のスラブによって供給される。同時に、この寒天スラブは、カバーグラスに対して根元を静かに押しつけ、イメージングチャンバー内の相対位置を固定し、高解像度水浸レンズを使用することを可能にする。さらに、寒天スラブは、デキサメタゾン、オリザリン、およびイソキサベンを含む、ある範囲の薬理学的処置を施すために使用することができる。イメージングチャンバは、最小限の装置を使用して標準的な顕微鏡スライドから大量に組み立てることができる。イメージングチャンバーは、側方根の発達を研究するために開発され、特徴付けられたが、他の実生の器官、例えば根の先端および胚軸。

<table><tbody><tr><td>Perfluorodecalin</td><td>F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK</td><td>FLUTEC PP6</td><td></td></tr><tr><td>Poly(dimethylsiloxane) gum&amp;nbsp;</td><td>Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA</td><td>Item # 132700</td><td>Carolina Observation Gel</td></tr><tr><td>Cavity Microscope Slides</td><td>VWR International Ltd, Lutterworth,&amp;nbsp;UK</td><td>10118-600</td><td>Cavity is 13 mm diameter and 0.2-0.4 mm in depth. Any cavity slide will probably suffice</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Loctite</td><td>604753</td><td>Any &#039;super-glue&#039; suitable for glass will probably suffice</td></tr><tr><td>Cellulosic cellophane membrane</td><td>AA Packaging Limited, Preston, UK</td><td></td><td>325P cellulose film; 80 mm disc</td></tr></tbody></table>

a simple chamber for long-term confocal imaging of root and hypocotyl development

側根の形態形成などの植物発達のいくつかの局面は、数日の時間間隔で起こる。基礎となる細胞および細胞下の過程を研究するためには、生理学的状態を保存する高分解能経時顕微鏡法が必要である。植物組織は、持続的な気体交換を伴う適切な栄養および水供給を有しなければならないが、カバーガラスの下に沈め固定されると、特に無酸素状態になりやすい。成功裡に採用された1つの戦略は、酸素および栄養分の一定した供給を維持するための灌流システムの使用である。しかしながら、このような構成は、複雑で煩雑であり、特殊な装置を必要とする。浸漬媒体としてペルフルオロデカリンを使用する簡単なイメージングシステムの代替戦略がここに提示されている。このシステムはセットアップが簡単で、最小限の設備を必要とし、顕微鏡ステージに簡単に取り付けることができ、いくつかのイメージングチャンバをセットアップして同等対立遺伝子。このシステムでは、最初の2日間の寒天平板上での標準条件下での側根伸長率と成長率との差異はなく、少なくとももう1日は側根伸長率が低下する。植物組織には、寒天スラブを介して栄養素が供給され、これを用いて一連の薬理学的化合物を投与することもできる。この系は、側根の発達をモニターするために確立されたが、胚軸および一次根のような他の植物器官を画像化するために容易に適応可能である。

側根はイメージングチャンバー内で生理的速度で成長する。 （ 図2A 、左、ムービー1、n = 23）、成長速度を、同じ寒天固化培地を含有する標準ペトリプレート上で生育させた側根のものと比較した（ 図2 2A 、右、映画2、n = 23）。成長率は、根の長さが成長と増殖の領域がますます長くなるために決定要因の1つである、側方の根の間でかなり変化する可能性がある13 。したがって、横方向の根のセットは、画像化チャンバおよび寒天プレートの両方において、異なる初期長さ（50μm〜1150μmの範囲）の根を表すように選択された。実験開始時の平均横根の長さ各セット（439および442μmのイメージングチャンバおよびプレートそれぞれ）において同様であった。分析された27時間の時間間隔で、横方向の根の成長は、イメージングチャンバーおよびプレートの両方において、プレート上で52μm/ h（R 2 = 0.997）およびイメージングチャンバーで51μm/ hの平均成長速度R 2 = 0.993）（ 図2B ）。プレートとイメージングチャンバー（ 図2C ）の両方で高度に変動する個々の側根の成長速度は、イメージングチャンバーでは17μm/ hから82μm/ h、プレートでは13μm/ hから87μm/ hの範囲である。成長速度は根の長さと共に一般に増加したが、成長速度は同様の長さの根の間で実質的に変化したが、変動はイメージングチャンバおよびプレートにおいて同様であった。 側根はイメージングチャンバー内で増殖し、hiを用いて画像化することができるgh開口数の目標。 血漿膜マーカーNPSN12-YFP14および微小管マーカーUBQ1 :: mRFP-TUBULIN BETA6（RFP-TUB6） 15を同時発現する側方の根をCLSM10によって1時間間隔で画像化して、画像化チャンバー中の細胞増殖中の微小管挙動を記録した（ 図2D 、映画3）。これらのチャンバーでは、外側の根は、x、y、z軸上の位置が非常に安定しており、数時間にわたって連続的な時間経過共焦点スタックを得ることができました。プレプロバースバンド（ 図2D 、緑矢印）、有糸分裂スピンドル（ 図2D 、白矢印）、および線条体（ 図2D 、青矢印）の形成から明らかなように、分裂細胞は連続的に増殖した。ペトリ皿の実生と同様に、イメージングチャンバー内の完全に伸長した根細胞は根毛を開始した（ 図2A 、 図2D 、矢頭）。広い視野を提供するために、 図2Dの画像は20x / 0.7NAの対物レンズで得られた。高開口数の63x / 1.2NA水浸対物レンズ（ 図2E ）を使用して側根の高解像度画像を得ることも可能であった。 側根の成長は、画像化チャンバ内で3日間まで持続する。 イメージングチャンバーが生理的速度で横方向の根の成長をどれくらいの期間サポートできるかを調べるために、イメージングチャンバー（n = 27）およびプレート（n = 33）における側根の長さを0時間、24時間、48時間および72時間で定量した。ルーツ・チョウsenは、0時間で200μmより短く、平均横方向の長さは画像化チャンバで117μm、プレート上では121μmであった。より短い根は平均してよりゆっくりと成長するので（ 図2C ）、それらは寒天平板の縁部であまり成長せず、画像化が容易であった。最初の48時間で、すべての側根の平均成長は、ペトリプレートと比較して、イメージングチャンバーで有意に異ならなかった（ 図3A ）。しかし、平均成長は48時間と72時間との間で有意に低下した（ 図3A ）。成長速度は、48時間後のイメージングチャンバでは一般的に減速すると思われるが、個体間の成長速度は非常に変化し易い（ 図3B 、 3C ）。これは、プレートおよびチャンバー上で同等の速度で成長する側根の実質的なサブセットが存在することを意味する完全な72時間の成長期間にわたって。成長した33個の側根のうち23個（69.7％）は、72時間（927〜3,163μmの間、 図3B 、赤色）の平均長さの1標準偏差以内の長さに達する。イメージングチャンバー内の横方向の根は、この間隔内の長さに達する（ 図3B 、赤色）27のうちの10/27（37.0％）。 イメージングチャンバーは、より古い側方の根、主な根および胚軸に容易に適合させることができる 。 元のイメージングチャンバー設計の限界の1つは、硬い寒天スラブがいくらかの機械的耐性を提供する一方で、重力によって成長する根は最終的に寒天スラブに浸透し、画質の損失をもたらし（ 図4B ）、高NA比較的長い作動距離（0.3mm）の63X / 1.3 NA CS2対物レンズでさえも、若い側方の根は、それらは最初にイメージングチャンバー（ 図2E ）でカバースリップと平行に成長した。それらがより長く成長し、コルミラおよび顎石が形成されるにつれて、側根は増加する陽性重力作用を示し、一方、一次根は発芽後に強い重力応答を示す。これは、一次根を画像化することができる期間を数時間に制限し、48時間以上連続して画像化できる側根の開始長さを厳しく制限する。この制限を克服するために、寒天スラブの表面上の浸透障壁として作用するセルロースセロファン膜によって、カバースリップと平行に成長が維持されるように、チャンバーを改変した（ 図4A ）。 1.5％寒天スラブを用いた最初の試みは、おそらく機械的ストレスのために最初の24時間以内に根の成長を減少させた。スラブ中のより低い寒天濃度を試験した。0.8％の寒天およびセルロースフィルムを含むスラブを有するチャンバーでは、若い側根成長速度は、最初の48時間の従来のチャンバーにおける成長速度と有意に異ならないことが分かった。 0-24時間の間、セルロースチャンバーおよび従来のチャンバーにおける平均根の成長はそれぞれ242μmおよび262μmであり（p = 0.78スチューデントt検定）、24-48時間は330μmおよび355μmであった（p = 0.67スチューデントズt検定）; n = 12、n = 11である。この配置は、効果的にカバーグラスから寒天へと横方向の根が成長するのを防ぎ、さらに48時間まで一次根のイメージングを可能にした（ 図4C ）。 画像化チャンバーが根以外の臓器に適合できるかどうかを試験するために、 シロイヌナズナ胚軸を選択した。胚軸は実質的に根よりも厚いので、従来のイメージングチャンバでは、最上部のcellsはカバースリップに押し付けられ、変形を引き起こした。したがって、中央に楕円形のくぼみを含む空洞スライドを使用して、別の設計が開発された（ 図4D ）。この構成では、厚さ1mmの寒天スラブ（前記2.2と同様に調製）をスライドキャビティ内に数mm突出した一端に配置した（ 図4D ）。スライド中の窩の上に胚軸を配置し、根元を水平部分の上に配置した。これにより、苗が根で宇宙に固定されていたが、胚軸は押しつぶされなかった。プレートと比較して、チャンバー内の成長速度は系統的に定量化されなかったが、イメージングチャンバー内の胚軸は、胚軸（ 図4E 、 4F ） 16の上方に移動する、十分に記述された縦方向成長の波を示した。 <img alt="図1"class = &quot;xfigimg&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55331 / 55331fig1.jpg&quot; /&gt; 図1 ：イメージングチャンバの組み立て。すべての詳細は本文に記載されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig2.jpg" /> 図2 ：イメージングチャンバー内の生理的条件下で側根が成長する。 （ A ）イメージングチャンバー（左）およびプレート（右）上の25時間にわたるアラビドプシス側根発達（一定光、水平インキュベーション、同時イメージング）。スケールバー=200μm。 （ B ）（ A ）に示すように、側根の長さを27時間（1時間間隔で測定）以上に示すプロット。個別灰色にプロットされた根（プレートおよびイメージングチャンバーについてはn = 23）、赤色の円としての平均長さ。エラーバー= 1SD。赤い線は平均的な長さに線形にフィットします。 （ C ）初期長さに対する（ B ）に示されるすべての側根に対する平均成長率を示すプロット。 （ D ）連続する時点でNPSN12-YFPおよびRFP-TUB6を発現する側方の根から得られた3D共焦点スタックの最大強度予測。 Inset：ボックス領域の拡大。緑色の矢印：プレプロファーゼバンド;白い矢印：紡錘体。青い矢印：phragmoplasts; arrowheads：根毛。 （ E ）0時間および16時間における63X / 1.2NA対物レンズおよびナイキストサンプリング（ピクセル寸法77nm×77nm）を用いて、（ D ）に示すトランスジェニックラインの若い側根から得た高解像度画像の最大強度投影。 h;アスタリスクは、各時点で同一の細胞を突き止める。矢印は、0hと16hとの間で分割するセルを示す。スケールバー=50μm（AC）。 20μm（E）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig3.jpg" /> 図3 ：イメージングチャンバーにおける長期的な側方根の発達。 （ A ）プレートと比較して、撮像チャンバー内で3つの連続した24時間間隔で平均絶対根の成長を示すプロット。 nsはp&gt; 0.05を示す。 ***はp &lt;0.001（スチューデントt検定）を示す。 n = 33（プレート）およびn = 27（イメージングチャンバ）。 （ B ）（A）で使用したすべての根の連続した時点での側根の長さを示すプロット。赤：プレート上に生育したすべての側根の平均の1SD内の最終長さを有するすべての側根（927〜3163μmの間）。 （ C ）最大値72時間を超える連続した時点で取得された側方の根における血漿 - 膜マーカーNPSN12-YFPの代表的な3D共焦点スタックの高密度投影。スケールバー=100μm。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55331/55331fig4.jpg" /> 図4 ：イメージングチャンバーは、他の植物器官に適応させることができます。 （ A - C ）主な根のためのイメージングチャンバー適応。 （ A ）イメージング・チャンバ設計の概略図。これは、MS培地スラブが1.5％寒天の代わりに0.8％寒天を含有し、寒天と植物の間にセルロースフィルム（赤色）を入れて増殖を防止するという2つの変更点を除いて、標準的なデザイン（ 図1 ）寒天に加える。 （ B ）従来のイメージングにおいて0時間および48時間で撮像された7日齢実生の一次根における血漿膜マーカーNPSN12-YFPの代表的な3D共焦点スタックのXY（上）およびXZ（下）最大強度投影図チャンバー。その根は、その重力応答のために寒天に成長することに注意してください。 （ C ）画像化において0時間および48時間で画像化された7日齢実生の一次根における血漿膜マーカーNPSN12-YFPの代表的な3D共焦点スタックのXY（上）およびXZ（下）最大強度投影図セルロースフィルムを有するチャンバー。適用前に、セルロースフィルムを80％エタノール中で滅菌し、液体の1 / 2MS培地に浸漬した。寒天への根の重力による成長が防止されることに留意されたい。 （ D - F ）イメージングチャンバーの胚軸への適応。 （ D ）胚軸イメージングチャンバー設計を示す概略図。ポリ（ジメチルシロキサン）ガムガスケット（灰色）は、2つのガラスストリップ（黄色）間の空洞スライド上の赤色。 1.5％の寒天平板（ベージュ）をスライド上に置き、部分的に空洞に到達させる。チャンバはPFD（青色）で満たされている。胚軸が寒天の水平部分に置かれている間に、胚軸が空洞内の寒天スラブの下向きの傾斜領域を占めるように、苗を寒天スラブ上に置く。チャンバーをカバースリップで閉じます。 （ E ）2日苗の胚軸における、血漿 - 膜マーカーNPSN12-YFPの代表的な3D共焦点スタックの最大強度予測は、連続時間点で48時間以上撮像した。 （ F ）（E）に示す胚軸の根底から頂端軸（Eに示す軸に沿って0時間の相対位置）に沿った個々の細胞の2つの連続する時間間隔における縦方向の成長。胚軸16の上に移動する前述の成長波に注意してください。スケールバー=100μm。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/55331fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="映画1" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie1.jpg" /> 映画1： <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_1.avi" target="_blank">この映画をダウンロードするにはここをクリックしてください。</a> <img alt="映画2" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie2.jpg" /> 映画2： <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_2.avi" target="_blank">この映画をダウンロードするにはここをクリックしてください。</a> <img alt="映画3" src="/files/ftp_upload/55331/55331movie3.jpg" /> 映画3：し <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55331/Movie_3.avi" target="_blank">てください</a>この映画をダウンロードするにはここを舐めてください。

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A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

ここに提示されているのは、高開口数の対物レンズと浸漬媒体としてのパーフルオロデカリンを使用して、最長3日間の根および胚軸発達の高解像度共焦点経時撮影イメージングのための簡単な技術である。

根および胚軸発達の長期共焦点イメージングのための単純なチャンバー

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

a-simple-chamber-for-long-term-confocal-imaging-root-hypocotyl

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K ビュー.  University of Oxford. ここに提示されているのは、高開口数の対物レンズと浸漬媒体としてのパーフルオロデカリンを使用して、最長3日間の根および胚軸発達の高解像度共焦点経時撮影イメージングのための簡単な技術である。 

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Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, phosphorus, sulfate and trace elements that plants acquire from the soil. If we want to develop sustainable approaches to producing high crop yield, we need to better understand how the root develops, takes up a wide spectrum of nutrients, and interacts with symbiotic and pathogenic organisms. To accomplish these goals, we need to be able to explore roots in microscopic detail over time periods ranging from minutes to days.
We developed the RootChip, a polydimethylsiloxane (PDMS)- based microfluidic device, which allows us to grow and image roots from Arabidopsis seedlings while avoiding any physical stress to roots during preparation for imaging1 (Figure 1). The device contains a bifurcated channel structure featuring micromechanical valves to guide the fluid flow from solution inlets to each of the eight observation chambers2. This perfusion system allows the root microenvironment to be controlled and modified with precision and speed. The volume of the chambers is approximately 400 nl, thus requiring only minimal amounts of test solution.
Here we provide a detailed protocol for studying root biology on the RootChip using imaging-based approaches with real time resolution. Roots can be analyzed over several days using time lapse microscopy. Roots can be perfused with nutrient solutions or inhibitors, and up to eight seedlings can be analyzed in parallel. This system has the potential for a wide range of applications, including analysis of root growth in the presence or absence of chemicals, fluorescence-based analysis of gene expression, and the analysis of biosensors, e.g. FRET nanosensors3.

This article provides a protocol for cultivation of Arabidopsis seedlings in the RootChip, a microfluidic imaging platform that combines automated control of growth conditions with microscopic root monitoring and FRET-based measurement of intracellular metabolite levels.

RootChipを使用して、ルート環境の急激な操作によるシロイヌナズナの根の成長のタイムラプス蛍光イメージング

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

生物工学

RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop cultivars against environmental stresses. An experimental protocol is presented for RGB and hyperspectral imaging of root systems. The approach uses rhizoboxes where plants grow in natural soil over a longer time to observe fully developed root systems. Experimental settings are exemplified for assessing rhizobox plants under water stress and studying the role of roots. An RGB imaging setup is described for cheap and quick quantification of root development over time. Hyperspectral imaging improves root segmentation from the soil background compared to RGB color based thresholding. The particular strength of hyperspectral imaging is the acquisition of chemometric information on the root-soil system for functional understanding. This is demonstrated with high resolution water content mapping. Spectral imaging however is more complex in image acquisition, processing and analysis compared to the RGB approach. A combination of both methods can optimize a comprehensive assessment of the root system. Application examples integrating root and aboveground traits are given for the context of plant phenotyping and plant physiological research. Further improvement of root imaging can be obtained by optimizing RGB image quality with better illumination using different light sources and by extension of image analysis methods to infer on root zone properties from spectral data.

An experimental protocol is presented for assessment of soil grown plant root systems with RGB and hyperspectral imaging. Combination of RGB image time series with chemometric information from hyperspectral scans optimizes insights into plant root dynamics.

RGB とスペクトルのルート画像植物表現型解析および生理学的研究: 実験概要およびイメージ投射プロトコル

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop ...

環境学

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

共焦点イメージングは​​、シロイヌナズナの花の開発のライブ

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

発生生物学

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

別の植物種から茎頂の共焦点のライブ イメージング

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

マウス蝸牛外植片の長期的タイムラプスイメージング

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

神経科学

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

二層流体プラットフォームシロイヌナズナ実生の根毛の形態のイメージング

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

非常に小さいスペースで先端成長植物細胞の伸長機能を勉強するマイクロ流体デバイスの開発

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング<em&gt;シロイヌナズナ子葉</em発芽過程&gt;表皮

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

生物学

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

時空のCaを測定する<sup&gt; 2 +</supシロイヌナズナ植物における&gt;シグナル

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

ゲルの表面上に成長する植物の根の光シート蛍光顕微鏡

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

根および胚軸発達の長期共焦点イメージングのための単純なチャンバー

要約

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RootChipを使用して、ルート環境の急激な操作によるシロイヌナズナの根の成長のタイムラプス蛍光イメージング

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マウス蝸牛外植片の長期的タイムラプスイメージング

二層流体プラットフォームシロイヌナズナ実生の根毛の形態のイメージング

非常に小さいスペースで先端成長植物細胞の伸長機能を勉強するマイクロ流体デバイスの開発

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング

時空のCaを測定する

ゲルの表面上に成長する植物の根の光シート蛍光顕微鏡

根および胚軸発達の長期共焦点イメージングのための単純なチャンバー

要約

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この動画の章

RootChipを使用して、ルート環境の急激な操作によるシロイヌナズナの根の成長のタイムラプス蛍光イメージング

RGB とスペクトルのルート画像植物表現型解析および生理学的研究: 実験概要およびイメージ投射プロトコル

共焦点イメージングは​​、シロイヌナズナの花の開発のライブ

別の植物種から茎頂の共焦点のライブ イメージング

マウス蝸牛外植片の長期的タイムラプスイメージング

二層流体プラットフォームシロイヌナズナ実生の根毛の形態のイメージング

非常に小さいスペースで先端成長植物細胞の伸長機能を勉強するマイクロ流体デバイスの開発

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング

時空のCaを測定する

ゲルの表面上に成長する植物の根の光シート蛍光顕微鏡

共焦点イメージングは、シロイヌナズナの花の開発のライブ

別の植物種から茎頂の共焦点のライブイメージング