Name: evaluation of intracellular location of reactive oxygen species in solea senegalensis spermatozoa
Uploaded: 2018-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa at JoVE.com

AQUAGAMETE FA 1205 コスト行動に感謝いたします。この作品は AGL201568330 C2 1 R プロジェクト (MINECO/フェダー) によって財政上支えられます。デイヴィッド g. Valcarce 資金が供給された軍事政権・ デ ・ カスティーリャ ・ イ ・ レオン (EDU1084/2012 年) とフォンド社会 Europeo。著者は、博士アナ リアサ Stolt 海ファーム社、博士パウリノ ・ デ ・ ラパス、博士・ イグナシオ ・ マルティネス モンテロとホセ ・ ラモン ・ Guiérrez を認めます。我々 はビデオ撮影にポーラ フェルナンデス Colado をありがとうも。

注: 螢光色素インキュベーションと共焦点解析コントロールと扱われたサンプルの少なくとも 2-3 時間になります。データ処理は、この時間の計算には含まれません。必要な材料は、材料テーブルで見つけることができます。このプロトコルは、新鮮なまたは凍結精子に適用できます。やっぱりアオモンイトトンボ冷たい水、冷たい条件 (4 〜 7 ° C) の下で常に仕事で産卵する魚の種であります。プロトコルの一般的なビューは、図 1を参照してください。
1 実験前に準備作業
<ol><li>ミトコンドリア染色 1 mM 原液分析学年 DMSO を準備します。</li>
	<li>1 μ g/mL 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole 二塩酸塩 (DAPI) 脱イオン水で原液を準備します。</li>
	<li>200 mOsm/kg リンゲル液 (116 mM NaCl、KCl、2.9 mM 1.8 mM CaCl2, 5 mM HEPES、pH 7.7) の準備します。</li>
	<li>4 mM 2 ', 7 ' dichlorodihydrofluorescein ジアセテート (DCFH DA) 分析グレードのメタノールで原液を準備します。 注: は、-20 ° c まで必要な因数でストックのソリューションを維持します。</li>
	<li>4-7 ° C で、遠心を設定します。</li>
</ol>2. 螢光色素の孵化前にサンプル準備
注: ピペッティングと再、精子の穏やかな処理が望ましいです。
<ol><li>凍結保存した細胞を扱う場合水のお風呂が、やっぱりアオモンイトトンボ精子1040 ° C で融解することを備えることができます。7 槽のわらのサンプルを浸す s。</li>
	<li>カットするはさみを使用して、および microfuge の管にサンプルを空にして 4-7 ° C、1 分 1000 x g で遠心分離機します。</li>
	<li>汚損のプロトコルを妨げることができる任意のコンポーネントを破棄する分注して凍結サンプルから精液または凍結と精漿を削除します。</li>
	<li>50-100 μ L の 4 ° C 200 mOsm/kg リンガー液で細胞を再懸濁します。</li>
	<li>ノイバウアーや実体顕微鏡下で似たようなカウントの商工会議所と精子の濃度を決定します。</li>
	<li>1 - 2 106セル/mL 4 ° C リンガー液 0.5 mL の最終巻で x を細胞懸濁液を希釈します。</li>
</ol>3. 螢光色素インキュベーション
注: 螢は、低光の条件、特に溶液中で処理しなければなりません。
<ol><li>DCFH DA 原液の 3.125 μ L を追加 (サンプルの最終濃度: 25 μ M) 作業サンプル希釈します。4-7 ° C で闇10で 40 分間インキュベートします。</li>
	<li>30 分後の DAPI 原液 0.5 μ L を追加 (最終濃度サンプル: 2 μ M) とミトコンドリア染色原液 0.5 μ (サンプルの最終濃度: 100 nM) のサンプルに。暗闇の中で 10 分間両方の螢を孵化させなさい。</li>
</ol>4. 共焦点の顕微鏡検査のための試料
<ol><li>培養時間後 1000 x g、1 分の 4-7 ° C の細胞懸濁液を遠心します。</li>
	<li>ピペットで上澄みを慎重に廃棄します。</li>
	<li>200 mOsm/kg リンガー液の 10-20 μ L を追加します。</li>
	<li>濃縮細胞懸濁液の場所 5 μ L は、スライドにドロップします。</li>
	<li>慎重に、スライドを準備上のカバーを置く、ポーランド語でそれを封印します。ポーランドが乾燥して準備は共焦点の顕微鏡検査のための準備です。</li>
</ol>5 実験前共焦点のセットアップ
注: 顕微鏡によって DCFH DA が「焼かれる」。まず非貴重なサンプルに最適な条件を確立します。
<ol><li>顕微鏡、レーザー、カメラ、顕微鏡を実行しているコンピューターをオンにします。</li>
	<li>各螢光色素の励起と放射の最大値を考慮して励起レーザーを設定します。<ol>
<li>DAPI、用励振最大 358 nm、排出量最大 465 nm。</li>
		<li>ミトコンドリア染色用励振最大 644 nm、排出量最大 662 nm。</li>
		<li>DCFH-DA を使用して励起最大 504 nm、排出量最大 525 nm。</li>
	</ol>
</li>
	<li>精子に集中する 25 X 目的と作業を開始します。この螢光色素は、最高の強度を報告するために焦点を DAPI チャネルを選択します。セルを集中している、かつて用 63 X または 100 × 対物徹底的な評価ソレア アオモンイトトンボ精子サイズが約 2 μ m なので。</li>
	<li>各チャネルのピンホール、利得と電圧を最適化します。同じように、背景を減らすためにデジタル オフセットを調整します。すべてのパラメーターは、使用される螢光色素に最適な一度設定を保存します。単一のルーチン試験のソレア アオモンイトトンボ精子細胞を用いて (これらのパラメーターは、各実験で変化があります) 次: 1 の利得電圧 750 V のピンホール。</li>
</ol>6. 画像の取得
<ol><li>画像獲得の目的の品質条件を選択します。ビット深度、イメージ形式、光シート厚さのような取得設定を定義し、単一の両面照明を選択します。単一のルーチン試験のソレア アオモンイトトンボ精子使用 (これらのパラメーターは、各実験で変化があります) 次: フレーム; 1024 px のサイズビット/ピクセル 16;スキャン速度が 2-4)。</li>
	<li>開き、開始フィールドの画像を撮影してスキャン領域を中央にします。</li>
	<li>トリミング ツールを使用すると、関心領域を選択し、押しますライブ。</li>
	<li>範囲インジケーター ツールの助けを借りて、背景を減らすためにデジタル オフセットを調整します。チャンネルごとにこれを行うし、イメージを取る。</li>
	<li>各チャンネルごとの螢光と、その組み合わせの品質を確認します。</li>
</ol>7. 3 D イメージ ビデオを作成します。
<ol><li>Z スタック取得設定。<ol>
<li>ソフトウェアで Z スタック オプションを選択します。</li>
		<li>単一のセル、セルのグループまたは関心領域を選択し、フォーカスをします。</li>
		<li>Z スタック '最初スライス' と '最後のスライス' オプションを区切るし、良い焦点の助けを借りて、0.2 μ m 間隔に z ステップを確立します。最高の強度を報告ことがありますこの螢光色素と精子の頭全体を簡単に選択できるため、集中する DAPI チャネルを選択します。各チャンネルに最適なアクイジション ・ パラメーターを選択し、実験を実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Z スタック実験を実行します。チャンネルを分割し、各シグナルの細胞内の局在を観察します。</li>
	<li>Z スタック プロセス。<ol>
<li>ボリューム レンダリング: 実験が終わったら、Z スタック処理ソフトウェアのオプションを選択し、ボリュームのレンダリング オプションを選択します。ステップと回転度 (360 °) の数を選択します。動画の拡張子を持つファイルを保存します。</li>
		<li>ステレオ: オプションでステレオを選択プロセス ウィンドウ。このツールは、チャンネルの分割とビデオの 3 D 画像を作成することができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Amaral, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functionality+and+chemical+compound+action+on+sperm+function.">Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function.</a> Curr Med Chem. , (2016).</li><li>Morielli, T., O'Flaherty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+impairs+function+and+increases+redox+protein+modifications+in+human+spermatozoa.">Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa.</a> Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).</li><li>G&#252;rler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability,+synthesis+of+reactive+oxygen+species,+and+DNA+damage+of+bovine+sperm.">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. , (2016).</li><li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+E+Analogue+Improves+Rabbit+Sperm+Quality+during+the+Process+of+Cryopreservation+through+Its+Antioxidative+Action.">Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action.</a> PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).</li><li>Fang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+ROS+production+through+mitochondria-targeted+antioxidant+and+mitochondrial+uncoupling+increases+post-thaw+sperm+viability+in+yellow+catfish.">Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish.</a> Cryobiology. 69 (3), (2014).</li><li>Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation-induced+human+sperm+DNA+damage+is+predominantly+mediated+by+oxidative+stress+rather+than+apoptosis.">Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).</li><li>Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+phosphatidylserine+translocation,+intracellular+hydrogen+peroxide,+and+DNA+integrity+in+canine+sperm.">Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm.</a> Theriogenology. 73 (3), (2010).</li><li>Guthrie, H. D., Welch, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+reactive+oxygen+species+on+sperm+function.">Effects of reactive oxygen species on sperm function.</a> Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).</li><li>Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+and+sperm+function--in+sickness+and+in+health.">Reactive oxygen species and sperm function--in sickness and in health.</a> J Androl. 33 (6), (2012).</li><li>Valcarce, D. G., Robles, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+captivity+and+cryopreservation+on+ROS+production+in+Solea+senegalensis+spermatozoa.">Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa.</a> Reproduction. 152 (5), (2016).</li><li>Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+paradoxical+relationship+between+stallion+fertility+and+oxidative+stress.">The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress.</a> Biol Reprod. 91 (3), (2014).</li><li>Cabrita, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+enhancing+fish+sperm+quality+and+emerging+tools+for+sperm+analysis.">Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis.</a> Aquaculture. 432, 389-401 (2014).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

精子の運動性と機能キー細胞小器官であるミトコンドリアが知られています。これらの細胞小器官は、同時に直接活性酸素産生に関与しています。興味深いことに、適切な精子機能1活性酸素の制御のレベルが必要です。肯定的な哺乳類11不妊と酸化ストレスとの関係が示されているが、過剰なレベルに影響を与える精子品質12。正または?...

活性酸素種の生産は、精子の質とリンクされている最近1。ミトコンドリアの活性酸素産生には、通常の生理学的なプロセスを考えることができる、さまざまなレベルで精子の損傷の明確な原因は活性酸素産生の過剰による酸化ストレス。人間、酸化ストレスは、男性不妊症、運動性や受精2を受けるための能力を変更することに関連付けられています。哺乳類で、凍結精子サンプルの DNA の完全性の変化は H2O23の合成にも関連しています。
凍結保存は養殖で銀行の遺伝子のための一般的な手法です。この技術はやっぱりアオモンイトトンボなど生殖器の問題を持つ種で特に重要です。市場でこの貴重な種は、求愛の不足のため飼育下で生まれた個体の生殖機能障害を示しています。この事実は、精子の凍結保存を人工受精精子の可用性を持っている必要になります。しかし、凍結は、酸化ストレスと抗酸化サプリメントの有益な効果が報告されての精子4有害なことができるのソース可能性があります。ミトコンドリアをターゲットとした抗酸化作用による活性酸素抑制は黄色いナマズ5精子凍結保存用伝え有益であった。
したがって、精子サンプル中の ROS のレベルは、これらの分子は、精子の生存と不妊治療8の欠点として認識されているので、特に凍結6、7の後知ることが重要。さらに、細胞内 ROS の分布を調査、潜在的な損傷のレベルを推測する重要な可能性があります。例として通常、精子機能と互換性のある、ミトコンドリアにおける活性酸素の低レベルを想定できるが、核内活性酸素の高レベルは、精子の DNA 損傷の指標かもしれない。H2O2は、ミトコンドリアから解放されることができる、小さなおよび電荷レス分子9だから核を浸透最も関連性の高い活性酸素の 1 つです。ジクロルフルオレッセン ジアセテート (DCFH DA) 具体的には緑色の蛍光を発光細胞内の過酸化水素を明らかにできます。この記事は、やっぱりアオモンイトトンボ精子共焦点顕微鏡を用いた H2O2細胞内の局在を検出するための詳しいプロトコルが表示されます。

<table><tbody><tr><td>2&amp;prime;,7&amp;prime;-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6883</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;prime;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscopy</td><td>Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-541B</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Analytical Grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W387520</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Methanol, Analytical Grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>MitoTrackerDeep Red&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M22426</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge (refrigerated)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002441</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Neubauerchamber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR717810</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10143562BEF</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of intracellular location of reactive oxygen species in solea senegalensis spermatozoa

酸化ストレスは、精子の質を減少させる重要な要因の 1 つです。どんな種の重要度が高いは、精子の活性酸素種 (ROS) を検出するための効率的なプロトコルの開発が、これらのメソッドは、使用頻度の低いと硬骨魚も少ない。凍結保存は遺伝子銀行を含め、さまざまな目的のため養殖の便利なテクニックを年間を通じて精子可用性を保証します。凍結/融解手順や原因になる活性酸素産生精子細胞に損傷を与えます。考えると、将来の損害が活性酸素産生の過剰の原因、ローカリゼーション、ここによって精子の H2O2を検出し、共焦点顕微鏡による細胞内局在化を評価する詳細な方法について提供しています。この目的のため 3 螢 (2 ', 7 ' Dichlorodihydrofluorescein セルロースジ アセテート (DCFH DA)、ライブ ミトコンドリア染色と 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindole 二塩酸塩 (DAPI)) の組み合わせは、2 H2O の共局在の評価に使用されます。精子核やミトコンドリアソレア senegalesis精子サンプル。

共焦点顕微鏡は、魚類の精子細胞内 ROS の評価のための理想的な方法です。(図 1) 本論文で示した 3 つの螢 (DAPI、ミトコンドリア染色、DCFH DA) の組み合わせは、基礎研究に適用することができますし、改善で使用されるプロシージャにアプリケーションを持つことができます多くの有用な情報を提供します凍結プロトコルなどの産業水産植物細胞...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa at JoVE.com

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

このプロトコルは、やっぱりアオモンイトトンボ精子核の ROS は、ミトコンドリアのライブ ミトコンドリア染色 DAPI の敏感な螢光色素 DCFH-DA を使用して内 H2O2の局在を検出するための詳細な方法についてを記述します。可視化、それぞれ。プロトコルは、新鮮なまたは解凍精子と 2 h 内で実行する設計されています。

やっぱりアオモンイトトンボ精子における活性酸素種の細胞内局在の評価

Oxidative stress is one of the important factors in decreasing sperm quality. Developing efficient protocols for detecting reactive oxygen species (ROS) ...

evaluation-intracellular-location-reactive-oxygen-species-solea

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

6.2K ビュー.  University of León. このプロトコルは、やっぱりアオモンイトトンボ精子核の ROS は、ミトコンドリアのライブ ミトコンドリア染色 DAPI の敏感な螢光色素 DCFH-DA を使用して内 H2O2の局在を検出するための詳細な方法についてを記述します。可視化、それぞれ。プロトコルは、新鮮なまたは解凍精子と 2 h 内で実行する設計されています。

ビデオ: Evaluation of Intracellular Location of Reactive Oxygen Species in Solea Senegalensis Spermatozoa

Detection of Total Reactive Oxygen Species in Adherent Cells by 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative stress by measuring total reactive oxygen species (ROS) using 2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) staining in colorectal cancer cell lines as an example. This protocol describes detailed steps including preparation of DCFH-DA solution, incubation of cells with DCFH-DA solution, and measurement of normalized intensity. DCFH-DA staining is a simple and cost-effective way to detect ROS in cells. It can be used to measure ROS generation after chemical treatment or genetic modifications. Therefore, it is useful for determining cellular oxidative stress upon environment stress, providing clues to mechanistic studies.

Here, we present a protocol to detect total cellular reactive oxygen species (ROS) using 2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). This method can visualize cellular ROS localization in adherent cells with a fluorescence microscope and quantify ROS intensity with a fluorescence plate reader. This protocol is simple, efficient and cost-effective.

2',7'-ジクロロジドロフルオレセイン・ジアセテート染色による接着性細胞中の全活性酸素種の検出

Oxidative stress is an important event under both physiological and pathological conditions. In this study, we demonstrate how to quantify oxidative ...

生化学

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes require energy. There remains an ongoing debate about the sources generating the ATP which fuels sperm progressive motility, capacitation, hyperactivation, and acrosome reaction. Here, we describe the application of an extracellular flux analyzer as a tool to analyze changes in energy metabolism during mouse sperm capacitation. Using H+- and O2- sensitive fluorophores, this method allows monitoring glycolysis and oxidative phosphorylation in real-time in non-capacitated versus capacitating sperm. Using this assay in the presence of different energy substrates and/or pharmacological activators and/or inhibitors can provide important insights into the contribution of different metabolic pathways and the intersection between signaling cascades and metabolism during sperm capacitation.

We describe the application of an extracellular flux analyzer to monitor real-time changes in glycolysis and oxidative phosphorylation during mouse sperm capacitation.

細胞外フラックス分析装置を用いてマウス精子容量化時の糖質および酸化リン酸化の変化を測定する

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. Thiols are especially important for illuminating the redox status of cells via their reduced dithiol and oxidized disulfide ratios. Engineered cysteine-containing fluorescent proteins open a new era for redox-sensitive biosensors. One of them, redox-sensitive green fluorescent protein (roGFP), can easily be introduced into cells with adenoviral transduction, allowing the redox status of subcellular compartments to be evaluated without disrupting cellular processes. Reduced cysteines and oxidized cystines of roGFP have excitation maxima at 488 nm and 405 nm, respectively, with emission at 525 nm. Assessing the ratios of these reduced and oxidized forms allows the convenient calculation of redox balance within the cell. In this method article, immortalized human triple-negative breast cancer cells (MDA-MB-231) were used to assess redox status within the living cell. The protocol steps include MDA-MB-231 cell line transduction with adenovirus to express cytosolic roGFP, treatment with H2O2, and assessment of cysteine and cystine ratio with both flow cytometry and fluorescence microscopy.

This protocol describes the assessment of subcellular compartment-specific redox status within the cell. A redox-sensitive fluorescent probe allows convenient ratiometric analysis in intact cells.

細胞内膜特異的レドックス感受性緑色蛍光タンパク質を用いた細胞酸化の評価

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, motility and progressive motility, and sperm morphology and viability. However, none of these assessments is good enough to predict the semen quality. Given that maintenance of sperm viability and fertilization potential depends on membrane integrity and intracellular functionality, evaluation of these parameters might enable a better prediction of sperm fertilization competence. Here, we describe three feasible methods to evaluate sperm quality using specific fluorescent probes combined with fluorescence microscopy or flow cytometry analyses. Analyses assessed plasma membrane integrity using 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and propidium iodide (PI), acrosomal membrane integrity using fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) and mitochondrial membrane integrity using 5,5&#39;,6,6&#39;-tetra-chloro-1,1&#39;,3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1). Combinations of these methods are also presented. For instance, use of annexin V combined with PI fluorochromes enables assessing apoptosis and calculating the proportion of apoptotic sperm (apoptotic index). We believe that these methodologies, which are based on examining spermatozoon membranes, are very useful for the evaluation of sperm quality.

Here, we present methodologies to evaluate spermatozoan membrane integrity, a cellular feature associated with sperm fertilization competence. We describe three techniques for the fluorimetric assessment of sperm membranes: simultaneous staining with specific fluorescent probes, fluorescence microscopy, and advanced sperm-dedicated flow cytometry. Examples of combining the methodologies are also presented.

蛍光光度法による精子膜評価技術

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

発生生物学

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

、検出し可視化し、アメーバモデル系で活性酸素種の生成を定量

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

生物学

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

ゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスの分析

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in M&#252;ller Glial Cells

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the modification of proteins, lipids, and DNA, which finally may lead to alteration in cellular function and cell death. Therefore, it is beneficial for cells to increase their antioxidant defense in response to detrimental insults, either by activating an antioxidant pathway like Keap1/Nrf2 or by improving redox scavengers (vitamins A, C, and E, &#946;-carotene, and polyphenols, among others). Inflammation and oxidative stress are involved in the pathogenesis and progression of retinopathies, such as diabetic retinopathy (DR) and retinopathy of prematurity (ROP). Since M&#252;ller glial cells (MGCs) play a key role in the homeostasis of neural retinal tissue, they are considered an ideal model to study these cellular protective mechanisms. In this sense, quantifying ROS levels with a reproducible and simple method is essential to assess the contribution of pathways or molecules that participate in the antioxidant cell defense mechanism. In this article, we provide a complete description of the procedures required for the measurement of ROS with DCFH-DA probe and flow cytometry in MGCs. Key steps for flow cytometry data processing with the software are provided here, so the readers will be able to measure ROS levels (geometric means of FITC) and analyze fluorescence histograms. These tools are highly helpful to evaluate not only the increase in ROS after a cellular insult but also to study the antioxidant effect of certain molecules that can provide a protective effect on the cells.

Here, we propose a systematized, accessible, and reproducible protocol to detect cellular reactive oxygen species (ROS) using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe (DCFH-DA) in M&#252;ller glial cells (MGCs). This method quantifies total cellular ROS levels with a flow cytometer. This protocol is very easy to use, suitable, and reproducible.

ミュラーグリア細胞における2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブとフローサイトメトリーを用いた活性酸素種の定量

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the ...

神経科学

Flow Cytometric Analysis of Biomarkers for Detecting Human Sperm Functional Defects

The conventional semen parameter analysis is widely used to assess male fertility. However, studies have found that ~15% of infertile patients show no abnormalities in conventional semen parameters. Additional technologies are needed to explain the idiopathic infertility and detect subtle sperm defects. Currently, biomarkers of sperm function, including sperm apoptosis, mitochondrial membrane potential (MMP), and DNA damage, reveal sperm physiology at the molecular level and are capable of predicting male fertility.
With flow cytometry (FCM) techniques, each of these markers can be rapidly, accurately, and precisely measured in human semen samples, but time costs substantially increase and results could be obstructed if all the biomarkers need to be tested with a single cytometer. In this protocol, after collection and immediate incubation at 37 &#176;C for liquefication, semen samples were further analyzed for sperm apoptosis using Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)/propidium iodide (PI) staining. The MMP was labeled with 5,5&#8242;,6,6&#8242;-tetrachloro-1,1&#8242;,3,3&#8242;-tetraethyl-benzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) probe, and DNA damage was assessed using the sperm chromatin structure assay (SCSA) with acridine orange (AO) staining. Thus, flow cytometric analysis of sperm function markers can be a practical and reliable toolkit for the diagnosis of infertility and evaluation of sperm function at both bench and bed.

The present protocol provides a practical solution that allows for the measurement of apoptosis, mitochondrial membrane potential, and DNA damage in human sperm with a single cytometer.

ヒト精子の機能異常を検出するためのバイオマーカーのフローサイトメトリー解析

The conventional semen parameter analysis is widely used to assess male fertility. However, studies have found that ~15% of infertile patients show no ...

医学

高分解能呼吸測定によるヒト精子細胞の呼吸測定

High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Human Spermatozoa

Semen quality is often studied by routine semen analysis, which is descriptive and often inconclusive. Male infertility is associated with altered sperm mitochondrial activity, so the measurement of sperm mitochondrial function is an indicator of sperm quality. High-resolution respirometry is a method of measuring the oxygen consumption of cells or tissues in a closed-chamber system. This technique can be implemented to measure respiration in human sperm and provides information about the quality and integrity of the sperm mitochondria. High-resolution respirometry allows the cells to move freely, which is an a priori advantage in the case of sperm. This technique can be applied with intact or permeabilized spermatozoa and allows for the study of intact sperm mitochondrial function and the activity of individual respiratory chain complexes. The high-resolution oxygraph instrument uses sensors to measure the oxygen concentration coupled with sensitive software to calculate the oxygen consumption. The data are used to calculate respiratory indices based on the oxygen consumption ratios. Consequently, the indices are the proportions of two oxygen consumption rates and are internally normalized to the cell number or protein mass. The respiratory indices are an indicator of sperm mitochondrial function and dysfunction.

著者スポットライト:精子代謝とミトコンドリア機能を解明することで男性不妊症研究を進める 

The analysis of sperm mitochondrial function by high-resolution respirometry permits the measurement of the oxygen consumption of freely moving spermatozoa in a closed-chamber system. The technique can be applied to measure respiration in human spermatozoa, which provides information on sperm mitochondrial characteristics and integrity.

ヒト精子のミトコンドリア機能を評価するための高分解能肺活法

Semen quality is often studied by routine semen analysis, which is descriptive and often inconclusive. Male infertility is associated with altered sperm ...

やっぱりアオモンイトトンボ精子における活性酸素種の細胞内局在の評価

要約

さらに動画を探す

この動画の章

2',7'-ジクロロジドロフルオレセイン・ジアセテート染色による接着性細胞中の全活性酸素種の検出

細胞外フラックス分析装置を用いてマウス精子容量化時の糖質および酸化リン酸化の変化を測定する

細胞内膜特異的レドックス感受性緑色蛍光タンパク質を用いた細胞酸化の評価

蛍光光度法による精子膜評価技術

、検出し可視化し、アメーバモデル系で活性酸素種の生成を定量

ゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスの分析

ミュラーグリア細胞における2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブとフローサイトメトリーを用いた活性酸素種の定量

ヒト精子の機能異常を検出するためのバイオマーカーのフローサイトメトリー解析

ヒト精子のミトコンドリア機能を評価するための高分解能肺活法

ヒト精子のミトコンドリア機能を評価するための高分解能肺活法