C.D.M. was supported by the American College of Surgeons (ACS) Resident Research Scholarship. M.S.H. was supported by the California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Clinical Fellow training grant TG2-01159. M.S.H., H.P.L., and M.T.L. were supported by the American Society of Maxillofacial Surgeons (ASMS)/Maxillofacial Surgeons Foundation (MSF) Research Grant Award. H.P.L. was supported by NIH grant R01 GM087609 and a gift from Ingrid Lai and Bill Shu in honor of Anthony Shu. H.P.L. and M.T.L. were supported by the Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine and The Oak Foundation. M.T.L. was supported by NIH grants U01 HL099776, R01 DE021683-01, and RC2 DE020771. D.C.W. was supported by NIH grant 1K08DE024269, the Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, and the Stanford University Child Health Research Institute Faculty Scholar Award.

注：サンプルは、インフォームドコンセントを与えた患者から得ました。すべてのプロトコルを見直し、適切なスタンフォード大学の治験審査委員会によって承認されました。ヒト組織および細胞を処理している間、常にあなたの機関が指定されているように、バイオセーフティレベル2（BSL2）の注意事項に準拠しています。 試薬の調製<ol><li> FACS緩衝液を準備します。500 mLに滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を10 mLのFBS、5 mLのポロクサマー188と5 mLのペニシリン - ストレプトマイシンを追加します。 </li><li>混合物を消化する準備：0.375グラムC. hemolyticumコラゲナーゼII型粉末と5 mLのポロクサマー188〜500 mLの滅菌199 / EBSS媒体を追加します。 </li><li>標準培地を準備します：500mLのダルベッコ改変イーグル培地に50 mLのFBSおよび5mLのペニシリン - ストレプトマイシンを追加します。 </li></ol> 2.収穫とのASCの単離注：適切な機関の承認がヒト組織の使用時や、時間を単離するための場所であることを確認してくださいUMAN幹細胞。人間の腹部、脇腹を取得するか、または選択科目脂肪吸引を受けた健康なドナーからの皮下脂肪を太もも。プラスチック製の吸引キャニスターに脂肪をしてください。 <ol><li>オリジナルのプラスチック製のキャニスターに脂肪に1：1の比率で滅菌PBSを追加します。 （500 mLの脂肪が存在する場合には、500mLのPBSを加えます）。 30秒間穏やかに撹拌することによって混合します。水性の底に沈殿する層（ 図1）した後、吸引を可能にし、吸引に取り付けられた10mLのプラスチックピペットで水層を捨てます。 </li><li>大きなプラスチック容器に脂肪をデカントし、1で混合物を消化追加：1の比率。容器を閉じ、70％エタノールで外側を清掃します。パラフィンフィルムでキャップを封印。 </li><li> 37℃で30分間180rpmでオービタルシェーカーでこのコンテナを攪拌します。 </li><li> 1：1の比率で標準培地を追加することにより、消化を中和します。 （千ミリリットル脂肪混合物がある場合は、千ミリリットルを標準培地を追加します）。 </li><li>均等に25の偶数に混合物を配布0 mLのプラスチック製コニカル遠心チューブと遠心分離機4℃で20分間、300×gで混合</li><li>上清を吸引し、そのままペレットを残すように注意してください。各コニカルチューブのための5 mLの標準培地中で再懸濁ペレット。 </li><li> 1 50mLのコニカル遠心チューブに100ミクロンのフィルターを通してサスペンションをフィルタリングします。その後、4℃で15分間、300×gで遠心。 </li><li>上清を吸引し、5mLの室温RBC溶解緩衝液中にペレットを再懸濁します。混合物を室温（RT）で15分間300×gで遠心分離後、室温で5分間静置します。 </li><li>上清を吸引除去し、15 mLの標準培地でペレットを再懸濁。再び50mLのコニカル遠心チューブに100ミクロンのフィルターを通して濾過します。 </li><li>新しい50 mLコニカルでは、密度に基づく分離（試薬のリストを参照）用に設計された15 mLのポリスクロース溶液を添加。その後、45°の角度でチューブを保持し、慎重の側に細胞をピペットチューブポリスクロース溶液（ 図2）の上に細胞懸濁液を静か層ようにします。 注：これは、溶液の表面上にピペット細胞にとって重要です。これは不可逆的な混合物を作成するように、細胞の懸濁液にポリスクロースソリューションを追加しないでください。同様に、ポリスクロース溶液の中心に細胞をピペットではありません。 </li><li> RTで10分間、300×gで遠心分離し、この混合物を。低加速度を使用します（2から10のうち3）と、このステップのためにゼロに遠心機のブレーキ機能を設定します。 注：途中で曇った、底部に明確な、とサーモン色の上に：3層が表示されます。中間層は、目的の細胞が含まれています。 </li><li> 10 mLのピペットを使用すると、慎重に、中間層を除去し、新しい50 mLコニカルチューブに移します。 注：完全に中間層を転写し、中間層の一部を残すことよりもプロセスにトップとボトム層のいくつかを取ることをお勧めします。 </li> &lt;LI&gt;血球計数器を用いて細胞を数え、総生細胞数を決定します。 注：私たちは、通常、細胞を計数するのを助けるために0.8％の最終濃度まで細胞混合物に添加し、トリパンブルーを使用します。生存生細胞は青色色素を占有されることはありませんし、白表示されます。 </li></ol> BMPR-IB陽性細胞と細胞を含む足場の調製のためのソート3. FACS <ol><li> 4℃で5分間、300×gで細胞懸濁液を遠心。 （ステップ2.13で行わ細胞数に基づく）100μLあたり100万個の細胞の濃度でFACS緩衝液中で細胞を再懸濁します。 </li><li>ラベルされたプラスチック製遠心管に少なくとも10万個の細胞を移し、「BMPR-IB。」これとは別に、標識された別々のプラスチック製遠心チューブに100μLのFACS緩衝液で1万個の細胞を移す「未染色。」 「未染色 &quot;チューブに1mLのFACS緩衝液を追加します。 FACSはEXPERの一部を選別しながら、氷上で、FACS緩衝液中の細胞の残りを保ちます形態が行われています。 「未整理」をこれらの細胞を標識後で実験におけるコントロールとしてこれらを使用してください。 </li><li>製造元の指示に従って「BMPR-IB」チューブに蛍光抗ヒトBMPR-IB抗体の適切な量を追加します。抗体を配布するために静かに上下混合物をピペット。 注：私たちは、1：10希釈でヒトBMPR-IB / ALK-6 APC結合抗体を使用します（詳細については、試薬のリストを参照）。しかし、異なる製造業者からの抗体は、別の推奨濃度を持つことになります。 </li><li>光を保つ方法で、氷のバケツをカバーしています。細胞/抗体混合物を30分間（または抗体の製造者の指示に従って）のために座ってできるようにします。 注：抗BMPR-IBの抗体は二次抗体を必要とする主要な非結合抗体として来る場合は、製造元の指示に従って二次抗体と氷上で別々の染色工程を行います。 </li><li>で両方の管を遠心4℃で5分間、300×gで。ペレットを吸引しないように注意しながら、上清を吸引。 1mLのFACS緩衝液中でペレット化した細胞を再懸濁します。再び5分間、300×gでチューブを遠心します。注意深く上清を吸引し、1mLの当たり100万個の細胞の濃度になるようにFACS緩衝液中で細胞を再懸濁します。 </li><li>新しいラベルされたガラスFACSチューブに40ミクロンの細胞ストレーナーを通して、「未染色」、BMPR-IB「フィルタ」と「未整理」細胞。細胞をフィルターに残されていないことを確認するために、500μLのFACS緩衝液でフィルターを洗浄します。また、「BMPR-IB陽性」とラベルされた二つの別々のプラスチック製遠心チューブに2 mLの標準培地を追加し、「BMPR-IB陰性。」 FACS機で選別された細胞を収集するために、これらの2つを使用してください。 </li><li> FACSのマシンでは、蛍光マーカーのための負のゲートを定義するために、未染色細胞を使用しています。 </li><li> BMPR-IB陽性および陰性細胞がコン各チューブに並べ替え、100ミクロンのノズルを使用して標準培地をtaining。 FACSマシンはこの能力を持っている場合、ソート中に4℃で冷やしこれらのチューブを保管してください。 注：シャロンらによってJOVEの記事13を参照してください。 FACS選別のための優れたプロトコルのために。 </li><li>血球計数器を使用して、各チューブに細胞を数えます。 4℃で5分間、300×gで &quot;&quot;、BMPR-IB-陽性」BMPR-IB陰性」および「未整理」チューブを遠心し、細胞ペレットを乱さないように注意しながら、上清を吸引除去します。その後、250μLあたり100万個の細胞の濃度に標準培地で細胞を再懸濁します。 </li><li>プレカット4ミリメートルPLGA（ポリ[乳酸 - コ - グリコール酸]）ハイドロキシアパタイトで被覆された足場を取得します。 24ウェルプレートのウェルに各足場を置きます。ソートされていない、BMPR-IB陽性、およびBMPR-IB-負（ 図3）：3つのグループからの細胞懸濁液50μL（。 私は .E、200,000細胞）で各足場をカバーしています。 注：してくださいローらによるJOVEの記事14を参照してください。 PLGA足場の構築の詳細については。 </li><li>部分的に、（足場の乾燥を防ぐために）、その蓋付きプレートを覆い、そして30分間37℃で細胞培養インキュベーター中でインキュベート標準培地と周囲の空のウェルを満たします。 </li></ol>頭蓋冠の欠陥とACS含有足場の応用4.作成注：適切な機関の承認が生きたマウスにおける頭蓋冠の欠陥の発生のための場所であることを確認してください。このプロトコルは、スタンフォード大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されています。 <ol><li>吸入イソフルランガスまたは注入された長時間作用型麻酔薬カクテルのいずれかを使用してCD-1ヌードマウスを麻酔。 <ol><li>単独のガスを用いることが、麻酔チャンバー内にマウスを置き、2の酸素の流れを開始 - イソフルランを2％の濃度で3 L /分。マウスがfしたらully無意識、吸収性パッドで温水循環毛布の上に発生しやすい、それを配置し、酸素およびイソフルランの同じ濃度の麻酔ノーズコーンにその鼻を置きます。慎重に呼吸数を監視し、必要に応じてイソフルランの濃度を調整します。 </li><li>上記のように麻酔室でマウスを麻酔、注入された長時間作用型麻酔薬カクテルを使用し、麻酔薬カクテルを注入します。麻酔室からマウスを削除し、その動作を観察します。 注：マウスを簡単に麻酔から出てくるかもしれませんが、数分以内に再び完全に注入された麻酔薬の影響下で麻酔されるべきです。吸収性パッドで覆われた温水循環毛布にマウスを転送します。 注：麻酔薬カクテルのために、我々は通常の生理食塩水でケタミンを10mg / mLとキシラジンの1mg / mLを含む混合物で、腹腔内に配信することをお勧めします。この混合物の標準用量は、100mg / kgおよびキシラジン10mg / kgのをケタミンする等しい30グラムのマウス、300μL。注射用麻酔薬に関する詳細については、議論のセクションを参照してください。 </li><li>麻酔の深さを決定するために、つま先のピンチ操縦を使用してください。それは軽く外科医によって挟まれたときに適切に麻酔したマウスは、その足を撤回しません。 </li><li>角膜の乾燥を防ぐために、眼軟膏を適用します。 </li><li> 1ミリグラム/ kgのブプレノルフィンSRを皮下に投与します。 注：前の優れた疼痛緩和における手術結果に鎮痛を提供します。 </li><li>全体の手順の間、マウスの呼吸数を監視します。 注： - 100呼吸/分で適切にイソフルラン下で麻酔したマウスは、50の呼吸速度を持つべきです。減少した呼吸数は麻酔が深すぎることを示している可能性がありながら、呼吸数の増加は、麻酔が軽すぎることを示しています。 </li></ol></li><li>ポビドン-IODと頭蓋骨の背側面の皮膚をPREPINEの溶液を70％エタノールで3回行いました。露出された手術部位を残して、滅菌ドレープでドレープ。 注：無菌手術用手袋を着用し、手順中に滅菌技術を維持します。唯一のそのような無菌のドレープやオートクレーブ処理機器として無菌面およびオブジェクトをタッチします。アシスタントは、照明、オープン縫合パケットなどを調整しています</li><li> 15ブレードメスを用いて、背側頭蓋骨の大部分にわたって延びている矢状正中切開を行います。細かい歯付き鉗子を使用して、右頭頂骨を露出するために切開の右側に皮膚を撤回。 </li><li>オートクレーブさ4ミリメートルダイヤモンドコーティングされた穿孔ドリルビットとドリルを使用して、頭頂骨を通して欠陥をドリル。硬膜層に骨過去の欠陥を延長しないでください。 （ 図4） </li><li>欠損部に足場を置き、その後、ナイロン縫合糸を実行すると皮膚切開を閉じます。 </li><li>マウスを監視し、標準的な術後ケアaを提供機関のガイドラインにccording。 <ol><li>それが回復しながらきれいなケージの中に清潔なペーパータオル上でマウスを保管してください。ケージの半分は、温水循環毛布の上に配置されるべきであるとマウスは、最初はこの半分に配置する必要があります。 </li><li>それは歩行するのに十分な意識を取り戻したまでマウス無人のまま放置しないでください。それは完全に回復するまで、他のマウスを用いたケージに手術を受けたマウスを返さないでください。 </li></ol></li><li>試験される各足場のための新しいマウスを使って上記の手順を繰り返します。ホットビーズ滅菌または他の適切な方法を用いて、手術の間に外科用器具を滅菌します。 </li><li>まもなく手順の後、その後2,4,6、および8週目に、頭蓋冠欠損閉鎖の速度を分析するためのマイクロCTスキャンを使用します。 注：レヴィらによる記事を参照してください。頭蓋冠の欠陥のマイクロCTスキャンの説明については6。 </li><li>実験はcompleある場合TE、クリーン安楽死室にそれらを配置し、2 L /分の速度でチャンバ内への二酸化炭素ガスの流れを開始することによって、マウスを安楽死させます。呼吸後に安楽死を確認するために頸椎脱臼を行う（約10分後に）完全に止まっています。 </li><li>実験が完了した後、必要に応じて、使用の切片、組織学的染色は、欠陥内の骨形成を評価しました。 注：マッカードルらによる記事を参照してください。組織学のために骨の標本を作製する詳細については、12。組織学的および染色技術の総説については、そのような外科病理 15 のマニュアルとして組織学的マニュアルを参照してください。 </li></ol>

<ol>
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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteogenic+differentiation+of+mouse+adipose-derived+adult+stromal+cells+requires+retinoic+acid+and+bone+morphogenetic+protein+receptor+type+IB+signaling.">Osteogenic differentiation of mouse adipose-derived adult stromal cells requires retinoic acid and bone morphogenetic protein receptor type IB signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (33), 12335-12340 (2006).</li><li>McArdle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+for+bone+morphogenetic+protein+receptor+type-IB+promotes+differentiation+and+specification+of+human+adipose-derived+stromal+cells+toward+an+osteogenic+lineage.">Positive selection for bone morphogenetic protein receptor type-IB promotes differentiation and specification of human adipose-derived stromal cells toward an osteogenic lineage.</a> Tissue Eng Part A. 20 (21-22), 3031-3040 (2014).</li><li>Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+normal+and+cancer-associated+fibroblasts+from+fresh+tissues+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+(FACS).">Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J Vis Exp. 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The authors have no disclosures to make.

プロトコル内の重要なステップ ASCの収穫時には、重要なステップは、コラゲナーゼと脂肪の適切な消化です。不十分な消化は、ASCを低収量になります。 BMPR-IB +細胞のFACSソーティングの際には、慎重に陽性のためのゲートを定義することが重要です。あまりにも緩くゲートを定義すると、純粋ではないソートされた集団になることがあります。頭蓋冠欠損の作成時に、頭蓋...

傷害、感染症、または浸潤がんに起因する主な骨欠損は患者の回復と生活の質に大きな影響を与えます。技術は、他の場所で、患者自身の体内でより健康な骨でこれらの欠陥を埋めるために存在するが、この転送は、独自の罹患率および合併症の1、2、3のリスクを伴います。さらに、いくつかの欠陥が十分なドナー骨が欠損を埋めるために使用できないほど大規模または複雑です。補綴デバイスは、骨欠損を充填するための潜在的なオプションですが、これらは、感染リスク、ハードウェア障害、および異物反応4を含むいくつかの欠点と関連しています。 これらの理由のために患者自身の細胞5を用いて、生物学的代用骨を操作する可能性に大きな関心があります。脂肪由来間質細胞（ASCに）彼らは、患者自身の脂肪組織で豊富に入手可能であり、それらは新しい骨組織6,7を生成することにより骨欠損を治癒する能力が実証されているため、このアプリケーションの可能性を有しています。 ASCを、細胞の多様な集団であり、いくつかの研究は、特定の細胞表面マーカーについて選択する強化骨形成活性8,9で細胞集団を生成することができることを示しています。最も高い骨形成能とのASCを選択するこれらの細胞を播種した足場は、大きな骨欠損を再生することができると可能性を増加させます。 骨形成タンパク質（BMP）シグナル伝達は骨分化と形成10及びBMPレセプタータイプIB（BMPR-IB）を調節するために重要であるが、ASCを11で骨形成に重要であることが知られています。最近、我々は、BMPR-IBの発現をbができることを示していますeは強化された骨形成活性12とのASCを選択するために使用します。ここでは、in vivoでの頭蓋冠欠損モデルを用いて、それらの骨形成活性のアッセイが続く人間の脂肪からBMPR-IB発現のASCを単離するためのプロトコルを示しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="612">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:152px;">100 micron cell strainer</td>
			<td style="width:136px;">Falcon</td>
			<td style="width:116px;">352360</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:152px;">15 blade scalpel</td>
			<td style="width:136px;">Miltex</td>
			<td>4-515</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:152px;">24 well plate</td>
			<td style="width:136px;">Corning</td>
			<td style="width:116px;">3524</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:152px;">40 micron cell strainer</td>
			<td style="width:136px;">Falcon</td>
			<td style="width:116px;">352340</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:152px;">50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:136px;">Falcon</td>
			<td style="width:116px;">352098</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:152px;">6-0 Ethilon nylon suture, 18&#34;, P-3 needle,&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Ethicon</td>
			<td style="width:116px;">1698G</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:152px;">Anti-BMPR-IB primary antibody</td>
			<td style="width:136px;">R&#38;D systems</td>
			<td>FAB5051A</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:152px;">BioGel PI surgical gloves</td>
			<td style="width:136px;">M&#246;lnlycke Health Care</td>
			<td style="width:116px;">ALA42675Z</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:152px;">Buprenorphine SR</td>
			<td style="width:136px;">ZooPharm</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:152px;">Castro-Viejo needle driver</td>
			<td style="width:136px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:116px;">12565-14</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:152px;">CD1 nude mouse</td>
			<td style="width:136px;">Charles River</td>
			<td style="width:116px;">086</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:152px;">Collagenase Type II powder</td>
			<td style="width:136px;">Gibco</td>
			<td style="width:116px;">17101-015</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:152px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:136px;">Gibco</td>
			<td style="width:116px;">10564-011</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:152px;">Drill: Circular knife 4.0 mm</td>
			<td style="width:136px;">Xemax Surgical</td>
			<td style="width:116px;">CK40</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:152px;">Drill: Z500 Brushless Micromotor</td>
			<td style="width:136px;">NSK</td>
			<td style="width:116px;">NSKZ500</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:152px;">FBS</td>
			<td style="width:136px;">Gicbo</td>
			<td>10437-077</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:152px;">Fisherbrand Absorbent Underpads, 20&#34; x 24&#34;</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:116px;">14-206-62</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:152px;">Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4&#34; x 4&#34;</td>
			<td style="width:136px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:116px;">22-415-469</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:152px;">Heating pad</td>
			<td style="width:136px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:116px;">DCT-20</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:152px;">Hyclone 199/EBSS medium</td>
			<td style="width:136px;">GE&#160; Life Sciences</td>
			<td style="width:116px;">SH30253.01</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:152px;">Isothesia isoflurane</td>
			<td style="width:136px;">Henry Schein&#160;</td>
			<td style="width:116px;">050033</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:152px;">Micro Forceps with teeth</td>
			<td style="width:136px;">Roboz</td>
			<td style="width:116px;">RS-5150</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:152px;">Micro Forceps with teeth</td>
			<td style="width:136px;">Roboz</td>
			<td style="width:116px;">RS-5150</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:152px;">Paraffin film (Parafilm)</td>
			<td style="width:136px;">Bemis</td>
			<td style="width:116px;">PM996</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:152px;">PBS</td>
			<td style="width:136px;">Gibco</td>
			<td style="width:116px;">10010-023</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:152px;">Pen-Strep</td>
			<td style="width:136px;">Gibco</td>
			<td style="width:116px;">15140-122</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:152px;">PLGA scaffolds</td>
			<td style="width:136px;">Proprietary Formulation</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:152px;">Poloxamer 188, 10%</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td>P5556-100ML</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:152px;">Polylined Sterile Field, 18&#34; x 24&#34;</td>
			<td style="width:136px;">Busse Hospital Disposables</td>
			<td style="width:116px;">696</td>
			<td style="width:208px;">Cut a rectangular hole of the appropriate size</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:152px;">Polysucrose Solution: Histopaque 1119</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td>11191</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:152px;">Povidone Iodine Prep Solution</td>
			<td style="width:136px;">Medline</td>
			<td style="width:116px;">MDS093944H</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:152px;">Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube</td>
			<td style="width:136px;">Dechra Veterinary Products</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:152px;">RBC lysis buffer</td>
			<td style="width:136px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;">11814389001</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:152px;">Webcol alcohol prep swabs</td>
			<td style="width:136px;">Covidien</td>
			<td style="width:116px;">6818</td>
			<td style="width:208px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid isolation of bmpr-ib+ adipose-derived stromal cells for use in a calvarial defect healing model

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own body. The ability to grow bone de novo using a patient's own cells would allow bony defects to be filled with adequate tissue without the morbidity of harvesting native bone. There is interest in the use of adipose-derived stromal cells (ASCs) as a source for tissue engineering because these are obtained from an abundant source: the patient's own adipose tissue. However, ASCs are a heterogeneous population and some subpopulations may be more effective in this application than others. Isolation of the most osteogenic population of ASCs could improve the efficiency and effectiveness of a bone engineering process. In this protocol, ASCs are obtained from subcutaneous fat tissue from a human donor. The subpopulation of ASCs expressing the marker BMPR-IB is isolated using FACS. These cells are then applied to an in vivo calvarial defect healing assay and are found to have improved osteogenic regenerative potential compared with unsorted cells.

手術の日に行われたマイクロCTスキャンは明らかに頭蓋骨の欠陥が表示されます。この時点で4ミリメートルの欠陥に何の内部成長はありません。後続のスキャンをベースラインと比較して時間をかけて欠陥の大きさを定量化するために時間をかけて得られます。 BMPR-IB +細胞を播種欠陥は、BMPR-IB-と未整理の細胞（ 図5）と比較して、欠陥のより迅速な閉鎖...

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Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Adipose-derived stromal cells may be useful for engineering new tissue from a patient's own cells. We present a protocol for the isolation of a subpopulation of human adipose-derived stromal cells (ASCs) with increased osteogenic potential, followed by application of the cells in an in vivo calvarial healing assay.

頭蓋冠欠損治癒モデルで使用するためのBMPR-IB +脂肪由来間質細胞の迅速な単離

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.6K ビュー.  Stanford University School of Medicine. Adipose-derived stromal cells may be useful for engineering new tissue from a patient's own cells. We present a protocol for the isolation of a subpopulation of human adipose-derived stromal cells (ASCs) with increased osteogenic potential, followed by application of the cells in an in vivo calvarial healing assay.

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Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

強化された骨形成のためのヒト脂肪由来間質細胞の単離および濃縮

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

発生生物学

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. However, the analysis and quantification of cellular localization is difficult, as in many cases it relies on manual counting, thus bearing the risk of introducing a rater-dependent bias and reducing interrater reliability. Moreover, it is often difficult to judge whether the co-localization between two cells results from random positioning, especially when cell types differ strongly in the frequency of their occurrence. Here, a method for unbiased quantification of cellular co-localization in the bone marrow is introduced. The protocol describes the sample preparation used to obtain histological sections of whole murine long bones including the bone marrow, as well as the staining protocol and the acquisition of high-resolution images. An analysis workflow spanning from the recognition of hematopoietic and non-hematopoietic cell types in 2-dimensional (2D) bone marrow images to the quantification of the direct contacts between those cells is presented. This also includes a neighborhood analysis, to obtain information about the cellular microenvironment surrounding a certain cell type. In order to evaluate whether co-localization of two cell types is the mere result of random cell positioning or reflects preferential associations between the cells, a simulation tool which is suitable for testing this hypothesis in the case of hematopoietic as well as stromal cells, is used. This approach is not limited to the bone marrow, and can be extended to other tissues to permit reproducible, quantitative analysis of histological data.

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

造血細胞の自動定量化 - 脱灰骨の組織学的画像における間質細胞の相互作用

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. Although numerous immortalized adipogenic cell lines have been established, adipose-derived stem cells from the stromal vascular fraction of subcutaneous white adipose tissues provide a reliable cellular system ex vivo much closer to adipose development in vivo. Pig adipose-derived stem cells (pADSC) are isolated from 7- to 9-day old piglets. The dorsal white fat depot of porcine subcutaneous adipose tissues is sliced, minced and collagenase digested. These pADSC exhibit strong potential to differentiate into adipocytes. Moreover, the pADSC also possess multipotency, assessed by selective stem cell markers, to differentiate into various mesenchymal cell types including adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. These pADSC can be used for clarification of molecular switches in regulating classical adipocyte differentiation or in direction to other mesenchymal cell types of mesodermal origin. Furthermore, extended lineages into cells of ectodermal and endodermal origin have recently been achieved. Therefore, pADSC derived in this protocol provide an abundant and assessable source of adult mesenchymal stem cells with full multipotency for studying adipose development and application to tissue engineering of regenerative medicine.

This protocol describes the isolation of pig adipose-derived stem cells (pADSC) from subcutaneous adipose tissues with examination of multipotency. The multipotent pADSC are used to delineate processes of adipocyte differentiation and study transdifferentiation into multiple cell lineages of mesodermal mesenchyme or further lineages of ectoderm and endoderm for regenerative studies.

ブタ皮下脂肪組織から分離し、脂肪由来幹細胞の分化

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

脂肪デポ固有のSca1の免疫磁気分離<sup&gt;高</sup&gt;脂肪由来幹細胞（ASCに）

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

単離およびヒト胎盤組織由来の間葉系幹/間質細胞の増殖

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 &#215; g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.

Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.

遠心重力によって脂肪由来幹細胞の軟骨形成分化誘導

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

マウス子宮内膜上皮と間質細胞の単離のために<em&gt;インビトロ</em&gt;脱落膜化

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

ヒト臍帯及び胎児胎盤由来間葉系間質細胞の単離および特徴付け

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the efficacy of cell persistence and biodistribution of haMSCs in animal models. We demonstrated a method to label the cell membrane of haMSCs with lipophilic fluorescent dye. Subsequently, intra-articular injection of the labeled cells in rats with surgically induced KOA was monitored dynamically by an in vivo imaging system. We employed the lipophilic carbocyanines DiD (DilC18 (5)), a far-red fluorescent Dil (dialkylcarbocyanines) analog, which utilized a red laser to avoid excitation of the natural green autofluorescence from surrounding tissues. Furthermore, the red-shifted emission spectra of DiD allowed deep-tissue imaging in live animals and the labeling procedure caused no cytotoxic effects or functional damage to haMSCs. This approach has been shown to be an efficient tracking method for haMSCs in a rat KOA model. The application of this method could also be used to determine the optimal administration route and dosage of MSCs from other sources in pre-clinical studies.

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

This protocol describes an efficient way to monitor the cell persistence and biodistribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells (haMSCs) by far-red fluorescence labeling in a rat knee osteoarthritis (KOA) model via intra-articular (IA) injection.

生体内でひと脂肪由来間葉系幹細胞が脂溶性膜の蛍光色素をラット膝関節変形性関節症モデルでの追跡

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for embryo implantation into the uterine lining of the maternal womb. Improper decidualization has been established as a root cause for implantation failure and subsequent early embryo miscarriage. Therefore, understanding the molecular mechanisms underlying decidualization is advantageous to improving the rate of successful births. In vivo based studies of artificial decidualization are often limiting due to ethical dilemmas associated with human research, as well as translational complications within animal models. As a result, in vitro assays through primary cell culture are often utilized to explore the modulation of decidualization via hormones. This study provides a detailed protocol for the isolation of HESC and subsequent artificial decidualization via the supplementation of hormones to the culturing medium. Further, this study provides a well-designed method to knockdown any gene of interest by utilizing lipid-based siRNA transfections. This protocol permits the optimization of culture purity as well as product yield, thereby maximizing the ability to utilize this model as a reliable method to understand the molecular mechanisms underlying decidualization, and the subsequent quantification of secreted agents by decidualized endometrial stromal cells.

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a validated and optimized procedure for the isolation and culture of human endometrial stromal cells to conduct in vitro decidualization assay. Further, this study provides a detailed method to efficiently knockdown a specific gene using siRNAs in human endometrial stromal cells.

エストロージェン体外用ひと子宮内膜間質細胞の分離

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

頭蓋冠欠損治癒モデルで使用するためのBMPR-IB +脂肪由来間質細胞の迅速な単離

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