We thank Peter Johnson of the Georgetown University Microscopy Core for assistance with imaging the zebrafish embryos. The Microscopy &amp; Imaging Shared Resource and the Zebrafish Shared Resource are partially supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. This work was also supported by NIH/NCI CA71508 (AW) and CA177466 (AW).

倫理文：承認されたIACUCプロトコルに従ってゼブラフィッシュの胚を生成しました。これらの実験は、ジョージタウン大学動物実験委員会によって勧告に準拠して実施しました。 1.注射用胚を整理し、原液を作成します。 <ol><li>癌細胞の血管浸潤を評価するために必要なゼブラフィッシュの幼虫を生成します。 <ol><li> mitfa b692; ednrb1の B140の魚：（grcfp kdrl）ZN1 Tgを有するにおけるクロス交配ペアワイズまたはグループを設定します。 注：ZN1; mitfaのb692; ednrb1の B140のゼブラフィッシュを、Tgは（kdrl：grcfp）交配することによって：我々は、Tgは（grcfp kdrl）を生成した色素細胞を欠いている行で、内皮細胞に緑色のサンゴ礁のサンゴの蛍光タンパク質を発現ZN1 25を 、mitfa b692; ednrb1 B140、ゼブラフィッシュ国際リソースセンターで開発されました。 </li><li>共同llect卵、清潔、そして翌日22未受精または変形した胚を削除します。 </li><li>ゼブラフィッシュの胚は受精後（2 DPF）2日間あるときに発生する、癌細胞の注射の準備ができるまで、28.5℃で胚を培養します。 </li></ol></li><li>注入プレートを作成します。 <ol><li>各プレートのためのdH 2 O中1.5％アガロースの25ミリリットルを溶かします。 </li><li> 100ミリメートル×15ミリメートルのペトリ皿にアガロースの12ミリリットルを注ぎ、それを硬化させます。 </li><li>プレートに残っているアガロースを注ぐその後、再溶融。 </li><li>それは、アガロースに30度の角度であり、プレートの中央に位置するようにすぐにカットガラスモールド（7.5センチx xは7.2センチメートル広い3ミリメートル）を配置します。 注：これは急な60°の壁と30°傾斜したランプを作成します。 </li><li>代わりにガラスモールドをテープやアガロース硬化しましょう。 </li><li>静かにガラスモールドを除去し、アガロースを引き裂くしないように注意してください。 注型は、4℃でのdH 2 Oに保存することができます。 </li></ol></li><li>魚の水（0.3グラム/ Lの海塩）で注入プレートを平衡化します。 <ol><li>蒸留水で2回プレートを洗浄します。 </li><li> 10分間シェーカー上でプレートと場所に魚の水の10ミリリットルを追加することによって、プレートを平衡化します。 </li><li>魚の水でプレートをもう一度平衡化します。 </li></ol></li><li>魚の水22を含む皿にそれらを転送することにより、注射群に2日後に受精（DPF）の胚を分割します。 </li><li>注入後に利用するグループごとに回復料理を準備します。回復皿は10ミリリットル魚の水に加え、ペニシリン（25μg/ ml）およびストレプトマイシン（50μg/ ml）を含んでいることを確認してください。 </li><li>魚の水+ペニシリンおよびストレプトマイシンの50ミリリットルに緩衝トリカインストック（4 mg / mlで、10 mMトリス、pHが7）の4ミリリットルを追加することで、2倍トリカイン溶液を調製します。 </li><li>イマジンライブ胚を固定します取り付け麻酔媒体を生成するために、2倍トリカイン溶液10ml中に15mgの低融点アガロースを溶解グラム。 注：マウント培地を1.5％アガロースで構成されています。 </li><li>マイクロインジェクションの針を引き出します。 <ol><li>垂直ピペットプラーにガラスキャピラリーチューブを置きます。 20ミリアンペアの電流と2コイルの発熱体を使用して長いテーパー状のピペットを引き出します。 </li></ol></li></ol>親油性蛍光色素で標識化2.癌細胞<ol><li>その推奨される培養条件でがん細胞を維持します。 注：BT-474、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468およびSK-BR-3：これらの行は、DMEM + 10％FBS中で維持しました。 HCC 1806 T-47D：これらのラインは、RPMI + 10％FBS中で維持しました。すべての細胞株は、インキュベーション中に37 O C及び5％CO 2で維持しました。 </li><li>癌細胞の接着培養を解離することにより、単一細胞懸濁液を生成します。 <ol><li> PBSを用いて最初の細胞を洗浄した後、0.05％トリプシン-EDTA溶液で処理します。 注：トリプシン露光時間細胞株に依存するであろう。 </li><li> SEとのトリプシン溶液を中和細胞がデタッチした後、ラム含有細胞培養培地。 </li></ol></li><li>遠心分離機200×gで5分間トリプシン中和し、細胞懸濁液を、次いで、細胞計数のために、新鮮な培地中に細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>自動化された計数器を用いて細胞懸濁液を計数し、細胞培養培地200μlに100万個の細胞を調製します。 <ol><li>ゼブラフィッシュ胚に注入前にトリパンブルー色素排除と細胞生存率を確認します。 注：死細胞の注入は、真の血管浸潤が反映されませんようにのみ生存細胞集団は、ゼブラフィッシュ胚に注入する必要があります。 </li></ol></li><li> 、100倍希釈よく混ぜ、その後、37℃で20分間混合物をインキュベート：1のための癌細胞懸濁液に赤親油性色素の2μLを加えます。 注：染料の濃度および標識時間は、各細胞株のために最適化される必要があるかもしれません。 </li><li>インキュベーション後、チューブに新鮮な培地の1ミリリットルを追加し、その後で5分間遠心200×gです。 </li><li>癌細胞からの残留蛍光染料を洗い流します。 <ol><li>吸引は、細胞ペレットから上清を、200×gで5分間、新鮮な培地1ml中のペレット、及び遠心分離機を再懸濁します。 </li><li>洗浄工程をもう一度繰り返します、上清を吸引新鮮な培地1ml中に細胞ペレットを再懸濁した後、200×gで5分間、再び遠心します。 </li><li>洗浄工程三回目を繰り返します、上清を吸引新鮮な培地1ml中に細胞ペレットを再懸濁した後、200×gで5分間、再び遠心します。 </li></ol></li><li>上清を吸引し、新鮮な培地500μlの中に百万標識された癌細胞を含む細胞ペレットを再懸濁します。 注：0.5mMのEDTAは、細胞凝集を防止するために、培地に添加することができます。 </li></ol> 3.ゼブラフィッシュ胚の事前の心臓洞に癌細胞を注入<ol><li>加圧空気源にマイクロインジェクションディスペンスシステムを接続し、目をオンにします電子マイクロインジェクション分配システムの電源。 <ol><li>フットペダルを押すことにより試験圧力。空気の短いパルスは、針ホルダーから放射する必要があります。 </li></ol></li><li> 2Xトリカイン溶液で2回噴射プレートを平衡化。 <ol><li>各平衡段階のために、10分間シェーカー上射出プレートと場所に2倍トリカイン溶液20mlを加えます。 </li></ol></li><li> 2倍のトリカイン溶液を含む小さな皿に胚のグループを転送するためにプラスチック製のピペットを使用してください。 </li><li>ゲルローディングピペットチップを使用して、癌細胞を有するマイクロインジェクション注射針を埋め戻します。 <ol><li>細胞は先端付近に落ち着くように下向きに先端を有する電極保存瓶に針を置きます。 </li></ol></li><li>プラスチックピペットで2倍トリカインをたっぷり使って胚を収集することにより、射出プレートに30麻酔し、胚 - 転送20。 <ol style="margin-left: 40px;"><li>胚は、ピペットの先端に定住することを可能にします。 </li><li>ヘントlyがトラフの長さに沿って胚を拡散、注入プレートのトラフに胚を追放します。 </li><li>トラフの急な壁に直面して上を向く頭と腹を持つ胚を合わせます。 注：トリカイン溶液は、胚が唯一のトラフに存在すると、トラフの長さとフラットアガロース面の両方をカバーする必要があります。胚は今、注射の準備ができています。 </li></ol></li><li>マイクロインジェクションディスペンスシステムを用いて、ゼブラフィッシュ胚の心臓前方の洞に - （5 NL 2）100癌細胞 - 50を注入します。 <ol><li>マイクロマニピュレータの針ホルダーに針を取り付けます。 </li><li>左に60度の壁とステレオスコープの下で注入プレートを置き、25倍の倍率でトップ胚に焦点を当てます。 </li><li>拡張時、針が胚を貫通するように、マイクロマニピュレーターを配置します。 </li><li>それはほぼ胚をタッチするまで目で針を拡張します。 </li><li>顕微鏡で見ると、トンように針を合わせます帽子には、さらなる伸長時の胚を貫通します。 </li><li>ピアースだけでチップを置く卵黄嚢を通して胚ではなく、中に、プレ心臓洞。 </li><li>フットペダルを押すことによって、細胞を注入します。注入の力は、心臓の洞に細胞を放出します。針を撤回。 </li><li>右手を使用して、拡張し、注射針を後退させます。左手で、次の胚を配置するために微調整を行います。 </li><li>別のプレートを注入するために設定しながら、電極保存瓶に針を戻します。 </li></ol></li><li>プレート全体が注入されると、回復皿に胚を移します。 <ol><li>トラフのうち残りの胚を洗浄し、プラスチック製ピペットでそれらを収集し、下部にある胚をプールするために注入プレートを傾けます。 </li><li>胚は、ピペットの底に定住することができます。 </li><li>トリカインの最小容量の回復皿に胚を移します。 </li></ol></li><li> Incuba1時間28℃でのTE回収皿。 <ol><li>死んだ胚および他の破片から独立した実行可能なゼブラフィッシュ胚。 </li></ol></li><li> 96時間 - 得点、一般的に24の準備ができるまで33℃で皿をインキュベートします。 注意：この温度は37℃、癌細胞のための理想的な温度、及び28.5°C、ゼブラフィッシュのための理想的な温度との間の妥協点として決定されます。 </li></ol> 4.得点溢出<ol><li>トリカイン溶液で皿にそれらを置くことによって得点する胚のバッチを麻酔。 </li><li>トリカインのドロップでうつ病顕微鏡スライド上に麻酔をかけた幼虫を置きます。 <ol><li>尾部領域の最適なイメージングのための横方向に東洋の幼虫。 </li></ol></li><li>正常に明らかに無傷の細胞を識別するためにテール領域を介して上下に着目して血管系の外に侵入した癌細胞の数をカウントします。 注：これは、トンに関与する少なくとも2人を持っているのがベストです個々の魚の得点彼のプロセスは、評価される実験条件に盲目です。 <ol><li> 10倍の対物レンズを有する化合物の蛍光顕微鏡で幼虫をスコア。いかなる困難通話用20倍対物レンズを使用してください。 </li></ol></li></ol> 5.スライドとその後の蛍光イメージングに胚をマウントします<ol><li> 1.5％アガロース/トリカイン溶液を融解し、37℃にもたらします。 </li><li>トリカイン溶液中にそれを置くことによって撮像される胚を麻酔。 </li><li>撮像面にトリカイン溶液の液滴で胚を転送します。必要に応じてガラスボトムディッシュや顕微鏡スライドを使用します。 </li><li>撮像面に胚を保持し、過剰トリカイン溶液を除去するためにガラスピペットを使用してください。 </li><li>胚の上に溶融アガロース溶液の一滴をオーバーレイ。 </li><li>迅速に、アガロースが重合前に、イメージングのために横方向に胚を配向させるために、まつげブラシのような、繊細なツールを使用し、特別な注意を与えます胚を確実にするために、撮像面に沿って平坦化されます。 </li><li>トリカインソリューションの下になりまし重合アガロースドロップを水没。 </li><li>顕微鏡イメージングにライブゼブラフィッシュ胚を施します。 </li></ol> 6.変更：ゼブラフィッシュ胚の卵黄嚢に癌細胞を注入<ol><li>以前にこのプロトコルの項（3）に記載されているようにマイクロインジェクションディスペンスシステムと注入プレートを準備します。 </li><li>以前にこのプロトコルの項（2）に記載されているように対照的な蛍光色素と2つの細胞集団にラベルを付けます。 </li><li>卵黄嚢の中に2×10 ^ 7細胞/ mlの10 NL - 5を注入します。各細胞集団から - （200癌細胞100）同一の細胞数を注入する注入量を一定に保ちます 注：一つは、このアッセイの蛍光血管系を欠く透明なゼブラフィッシュの胚を使用することができます。受動的な脈管構造への粒子の侵入蛍光ビーズ（&lt;10ミクロン）を注入することによってために制御することができ、あるいは、変化させますネイティブ、intravsateしない細胞株。 </li><li>以前に（3）このプロトコルの、その後成功した注射用画面セクションで説明したように注入された胚を回復します。 <ol><li>首尾よく新しい皿に注入した生存可能な胚を選別し、転送するためにステレオスコープを使用してください。 注：すべての胚は、卵黄に位置する細胞の一貫サイズの質量を持っている必要があります。任意の細胞は卵黄の外側に配置されている場合は質量のサイズが異なる場合、または胚は廃棄されます。 </li><li>癌細胞が明らかに卵黄嚢に見られる場合は、新しい皿に実行可能な胚を移します。 </li></ol></li><li> 48時間 - 得点、一般的に24の準備ができるまで33℃で皿をインキュベートします。 注意：この温度は37℃、癌細胞のための理想的な温度、及び28.5°C、ゼブラフィッシュのための理想的な温度との間の妥協点として決定されます。 </li><li> 、血管内をスコアこのプロトコルの項（4）に記載されているガイドラインに従うのではなく、Cの数をカウントするには成功した尾部領域の血管系に侵入したancer細胞。 </li></ol>

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The authors have no conflicts of interest to disclose.

この技術は、効率的に癌細胞（ 図1参照 ）の脈管浸潤能を試験するためのゼブラフィッシュモデルを利用します。ここでは、他の研究者は、その後、独自の研究（; - 3図2、 表1を参照）を構築することができ、その上にベースラインを提供するために、乳癌細胞株のパネルに技術を適用しました。 MDA-MB-231細胞は容易にゼブラフィッシュ胚の?...

転移性疾患は、癌死亡率および癌細胞の播種を可能にする1が発見されずに残っている多くのメカニズムの主要な原因です。正常に転移する癌細胞のためには、まず、原発腫瘍を囲む間質を介して侵入しなければならない循環系に（intravasate）を入力し、輸送中に生き残る、循環からの出口（浸出）、および最後に実行可能なコロニーを確立します遠隔臓器サイト2で。血管内および血管外漏出は、このように転移カスケードにおける重要なステップであり、まだすべての癌細胞は、内皮接合部3を介して破壊し、移行では、本質的に熟達していません。実際には、癌細胞の血管浸潤を取り囲み、プロセスはさらに、内因性及び外因性因子4の様々な影響を与えることができるユニークな選択圧のシリーズがあります。これらの理由から、進行期癌の攻撃的な行動を調べる技術は、多くの場合、Vに焦点を当てます転移拡散を予測する手段としてascular浸潤能。 様々なモデル系は、in vitroでの癌細胞の血管浸潤の研究を促進するために存在します。 インビトロアッセイにおいて最も使用され、癌細胞6によって無傷内皮単層のリアルタイム破壊を監視するために、内皮障壁5または電気細胞-基質インピーダンスセンシング（ECIS）技術を介して癌細胞の移動を評価するために、トランスウェルシステムのいずれかを含みます。これらのアッセイは、典型的には、それ以外の内皮壁に癌細胞の付着に影響を与える流体力学および間質の要因を欠いています。この問題は、やや間質細胞を支持して内皮の3D培養から生じる灌流血管ネットワークによって回避されており、これらの3Dマイクロ流体システムは現在、in vitroでの現在のオプション7,8の最前線を表します。それでも、これらのアプローチは、機能的な循環系の堅牢な微小環境を省略しますしたがって、唯一のin vivoでのモデルの一部代替インチ最も広く血管浸潤のin vivoモデルで使用されるそれらは、比較的短い時間スケール上に発生し、一般的転移能9を示しているので、実験的転移アッセイが一般的に実行されたマウスです。これらのアッセイは、循環への癌細胞の直接注入を伴う、したがって転移、臓器の血管外遊出すなわち癌細胞コロニー形成の最終段階をモデル化します。実験的転移アッセイは、癌細胞の注射部位に基づいて異なると器官は、最終的に分析しました。第1のアッセイ型では、癌細胞をマウスの尾静脈に注入され、肺の癌細胞の播種は、10,11モニターされます。第二のアッセイは、転移性骨微小環境12-14に向かって播種するだけでなく、脳15を指示するために心臓内注射を実行する必要があります。第三のアッセイでは、癌Cellsは頸動脈に第送達経路は、脳17,18に癌細胞を担持し、一方、肝臓16のコロニー形成を可能にするために、脾臓内に注入されます。かかわらず、癌細胞送達方法、臓器のコロニー形成の受け入れ実験的エンドポイントであると一般的に発光、組織学、またはPCRベースの技術を介して決定されます。マウス宿主内で実験的転移アッセイを行うの生理学的な利点にもかかわらず、これらの実験はまだ完了し、分析するために数週間から数ヶ月が必要です。 ゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ ）モデルは、最近、癌の進行19,20を研究するための新しいシステムとして登場し、マウス21-24と比較してはるかに短い時間スケールで機能的な循環系内の癌細胞の血管浸潤の評価が可能にしました。この方法は、その内皮は緑のサンゴのfluoのタグが付いている透明なゼブラフィッシュ系統を利用しますkdrlプロモーターによって駆動されるrescentタンパク質レポーター、血管内皮増殖因子25ゼブラフィッシュレセプター。アッセイでは、癌細胞は赤色蛍光マーカーで標識され、2日齢の胚の心臓前方の洞に注入しました。どこでも注射後48〜96時間の間に、血管系の外と胚の尾部領域に侵入した癌細胞は、蛍光顕微鏡で効率的に得点することができます。ここでは、それらの血管の浸潤能で全く差異を実証するために一般的に使用されるヒト乳癌細胞株のパネルに技術を適用します。さらに、我々は癌細胞集団は、示差蛍光色素で標識され、蛍光血管系を欠くゼブラフィッシュ胚に注入することができるように、胚の卵黄嚢に注射部位を変えることは、不均一な細胞相互作用の研究を可能にすることを示しています。この後者のアッセイでは、卵黄に侵入した癌細胞はvasculaturにintravasatedeは注射後48時間に尾部領域24で採点されます。これにより、モデルの有効性と利便性のために、ゼブラフィッシュはますます急速に生理学的な設定の下で、癌細胞の血管の侵襲能力を試験するために使用されます。

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Dishes</td><td>Corning Incorporated</td><td>3160-100</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4&quot; Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass</td><td>Fisher Brand</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Dish</td><td>Corning Incorporated</td><td>3160-60</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, Low Melting</td><td>Fisher</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, Molecular Grade</td><td>Bioline</td><td>BIO-41026</td><td></td></tr><tr><td>Capillary Glass, Standard, 1.2 mm x 0.68 mm, 4&quot;</td><td>A-M Systems, Inc</td><td>627000</td><td></td></tr><tr><td>David Kopf 700C Vertical Pipette Puller</td><td>Hofstra Group</td><td>3600</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Storage Jar, 1.0 mm</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>E210</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222)</td><td>Fluka</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Eyelash Brush</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>113</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-12</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Transfer Pipettes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Gel Loading Pipet Tips</td><td>Fisher Brand</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>Glass Bottom Dishes (12.0 mm)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150680</td><td></td></tr><tr><td>Glass Depression Slide</td><td>VWR</td><td>470005-634</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Salt, Sea Salt</td><td>Pentair</td><td>IS50</td><td></td></tr><tr><td>Latex Rubber Bulbs, 2 ml, Pack of 72</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS20622B</td><td></td></tr><tr><td>SP8 Confocal Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E600</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-G Potassium</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP914-100</td><td></td></tr><tr><td>Petri Plates, 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Brand</td><td>&amp;nbsp;FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer II</td><td>General Valve Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin Sulfate</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22885</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafish&amp;nbsp;</td><td>Georgetown Zebrafish Shared Resources</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

testing the vascular invasive ability of cancer cells in zebrafish (danio rerio)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.

ここでは、ゼブラフィッシュ胚モデルで一般的に使用される乳癌細胞株（ 図1）の血管の侵襲能力を試験しました。厳格な基準は、癌細胞が明らかに溢出した場合は正のイベントのみカウントされ、これは細胞の破片を得点に起因する可能性のある偽陽性を制限するために主に行われていたこれらの異なる細胞株、のために得点溢出に採用されました。 </...

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Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish Danio Rerio

この方法は、効果的に癌細胞の血管の浸潤能をテストするためにゼブラフィッシュ胚を利用します。蛍光性の癌細胞は、心臓前方の洞または胚の開発の卵黄嚢に注入されます。癌細胞血管浸潤と血管外漏出は、24から96時間後に尾部領域の蛍光顕微鏡によって評価します。

（ゼブラフィッシュにおける癌細胞の血管浸潤能をテストします<em&gt;ゼブラフィッシュ</em&gt;）

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression.  Traditional in vitro models of cancer cell invasion of ...

testing-vascular-invasive-ability-cancer-cells-zebrafish-danio

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio)

11.9K ビュー.  Georgetown University. この方法は、効果的に癌細胞の血管の浸潤能をテストするためにゼブラフィッシュ胚を利用します。蛍光性の癌細胞は、心臓前方の洞または胚の開発の卵黄嚢に注入されます。癌細胞血管浸潤と血管外漏出は、24から96時間後に尾部領域の蛍光顕微鏡によって評価します。 

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Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying cancer metastasis in vivo, other efficient, reliable, low-cost models are needed to quickly access the potential effects of (epi)genetic changes or pharmacological compounds. As such, we illustrate and explain the feasibility of xenograft models using human breast cancer cells injected into zebrafish embryos to support this goal. Under the microscope, fluorescent proteins or chemically labeled human breast cancer cells are transplanted into transgenic zebrafish embryos, Tg (fli:EGFP), at the perivitelline space or duct of Cuvier (Doc) 48 h after fertilization. Shortly afterwards, the temporal-spatial process of cancer cell invasion, dissemination, and metastasis in the living fish body is visualized under a fluorescent microscope. The models using different injection sites, i.e., perivitelline space or Doc are complementary to one another, reflecting the early stage (intravasation step) and late stage (extravasation step) of the multistep metastatic cascade of events. Moreover, peritumoral and intratumoral angiogenesis can be observed with the injection into the perivitelline space. The entire experimental period is no more than 8 days. These two models combine cell labeling, micro-transplantation, and fluorescence imaging techniques, enabling the rapid evaluation of cancer metastasis in response to genetic and pharmacological manipulations.

Here, we describe xenograft zebrafish models using two different injection sites, i.e., perivitelline space and duct of Cuvier, to investigate the invasive behavior and to assess the intravasation and extravasation potential of human breast cancer cells, respectively.

胚ゼブラフィッシュにおけるヒト乳癌細胞の浸潤挙動

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

がん研究

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to assess potential patient response to therapy. Current methods largely depend on using syngeneic or immune-compromised animals to avoid rejection of the tumor graft. Such methods require the use of specific genetic strains that often prevent the analysis of immune-tumor cell interactions and/or are limited to specific genetic backgrounds. An alternative method in zebrafish takes advantage of an incompletely developed immune system in the embryonic brain before 3 days, where tumor cells are transplanted for use in short-term assays (i.e., 3 to 10 days). However, these methods cause host lethality, which prevents the long-term study of tumor cell behavior and drug response. This protocol describes a simple and efficient method for the long-term orthotopic transplantation of zebrafish brain tumor tissue into the fourth ventricle of a 2-day-old immune-competent zebrafish. This method allows: 1) long-term study of tumor cell behaviors, such as invasion and dissemination; 2) durable tumor response to drugs; and 3) re-transplantation of tumors for the study of tumor evolution and/or the impact of different host genetic backgrounds. In summary, this technique allows cancer researchers to assess engraftment, invasion, and growth at distant sites, as well as to perform chemical screens and cell competition assays over many months. This protocol can be extended to studies of other tumor types and can be used to elucidate mechanisms of chemoresistance and metastasis.

The transplantation of cancer cells is an important tool for the identification of cancer mechanisms and therapeutic responses. Current techniques depend on immune-incompetent animals. Here, we describe a method to transplant zebrafish tumor cells into immune-competent embryos for the long-term analysis of tumor cell behavior and in vivo drug responses.

腫瘍細胞の挙動および薬物応答の長期的研究のためのゼブラフィッシュ小児脳腫瘍の免疫適格宿主への移植

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A zebrafish xenograft is created by implanting mammalian tumor cells into the perivitelline space of two days-post-fertilization zebrafish embryos, followed by measuring the extent of the angiogenic response observed at an experimental endpoint up to two days post-implantation. The key advantage to this method is the ability to accurately quantitate the zebrafish host angiogenic response to the graft. This enables detailed examination of the molecular mechanisms as well as the host vs tumor contribution to the angiogenic response. The xenografted embryos can be subjected to a variety of treatments, such as incubation with potential anti-angiogenesis drugs, in order to investigate strategies to inhibit tumor angiogenesis. The angiogenic response can also be live-imaged in order to examine more dynamic cellular processes. The relatively undemanding experimental technique, cheap maintenance costs of zebrafish and short experimental timeline make this model especially useful for the development of strategies to manipulate tumor angiogenesis.

The aim of this method is to generate an in vivo model of tumor angiogenesis by xenografting mammalian tumor cells into a zebrafish embryo that has fluorescently-labelled blood vessels. By imaging the xenograft and associated vessels, a quantitative measurement of the angiogenic response can be obtained.

ゼブラフィッシュ腫瘍異種移植片における宿主血管新生応答の生体内イメージングと定量

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the standard in the field, but zebrafish have emerged as an alternative model with several advantages, including the ability for high-throughput and low-cost drug screening. Zebrafish also allow for in vivo drug screening with large replicate numbers that were previously only obtainable with in vitro systems. The ability to rapidly perform large scale drug screens may open up the possibility for personalized medicine with rapid translation of results back to clinic. Zebrafish xenograft models could also be used to rapidly screen for actionable mutations based on tumor response to targeted therapies or to identify new anti-cancer compounds from large libraries. The current major limitation in the field has been quantifying and automating the process so that drug screens can be done on a larger scale and be less labor-intensive. We have developed a workflow for xenografting primary patient samples into zebrafish larvae and performing large scale drug screens using a fluorescence microscope equipped imaging unit and automated sampler unit. This method allows for standardization and quantification of engrafted tumor area and response to drug treatment across large numbers of zebrafish larvae. Overall, this method is advantageous over traditional cell culture drug screening as it allows for growth of tumor cells in an in vivo environment throughout drug treatment, and is more practical and cost-effective than mice for large scale in vivo drug screens.

Zebrafish xenograft models allow for high-throughput drug screening and fluorescent imaging of human cancer cells in an in vivo microenvironment. We developed a workflow for large scale, automated drug screening on patient-derived leukemia samples in zebrafish using an automated fluorescence microscope equipped imaging unit.

ゼブラフィッシュにおける原発性腫瘍異種移植片の薬物スクリーニング

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal models are required for bridging the nanotechnology to its biomedical application. The mouse represents the traditional animal model for preclinical testing; however, mice are relatively expensive to keep and have long experimental cycles due to the limited progeny from each mother. The zebrafish has emerged as a powerful model system for developmental and biomedical research, including cancer research. In particular, due to its optical transparency and rapid development, zebrafish embryos are well suited for real-time in vivo monitoring of the behavior of cancer cells and their interactions with their microenvironment. This method was developed to sequentially introduce human cancer cells and functionalized nanoparticles in transparent Casper zebrafish embryos and monitor in vivo recognition and targeting of the cancer cells by nanoparticles in real time. This optimized protocol shows that fluorescently labeled nanoparticles, which are functionalized with folate groups, can specifically recognize and target metastatic human cervical epithelial cancer cells labeled with a different fluorochrome. The recognition and targeting process can occur as early as 30 min postinjection of the nanoparticles tested. The whole experiment only requires the breeding of a few pairs of adult fish and takes less than 4 days to complete. Moreover, zebrafish embryos lack a functional adaptive immune system, allowing the engraftment of a wide range of human cancer cells. Hence, the utility of the protocol described here enables the testing of nanoparticles on various types of human cancer cells, facilitating the selection of optimal nanoparticles in each specific cancer context for future testing in mammals and the clinic.

Described here is a method for utilizing zebrafish embryos to study the ability of functionalized nanoparticles to target human cancer cells in vivo. This method allows for the evaluation and selection of optimal nanoparticles for future testing in large animals and in clinical trials.

ゼブラフィッシュにおける機能化された蛍光シリカナノ粒子を用いた異種移植ヒト癌細胞のビボ標的化

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly visualizing the response to anti-cancer therapies (chemo, radiotherapy, and biologicals), angiogenesis and metastasis with single cell resolution, places the zebrafish xenograft model as a top choice to develop preclinical studies.

The zebrafish larval xenograft assay presents several experimental advantages compared to other models, but probably the most striking is the reduction of size scale and consequently time. This reduction of scale allows single cell imaging, the use of a relatively low number of human cells (compatible with biopsies), medium-high-throughput drug screenings, but most importantly enables a significant reduction of the time of the assay. All these advantages make the zebrafish xenograft assay extremely attractive for future personalized medicine applications.

Many zebrafish xenograft protocols have been developed with a wide diversity of human tumors; however, a general and standardized protocol to efficiently generate zebrafish larval xenografts is still lacking. Here we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Here, we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

ゼブラフィッシュラーバル異種移植片の生成と腫瘍行動解析

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms of screening, prevention, and treatment; however, preclinical models that predict the chemosensitivity profile of cancer patients are still lacking. To fill this gap, an in vivo patient-derived xenograft model was developed and validated. The model was based on zebrafish (Danio rerio) embryos at 2 days post fertilization, which were used as recipients of xenograft fragments of tumor tissue taken from a patient's surgical specimen. 
It is also worth noting that bioptic samples were not digested or disaggregated, in order to maintain the tumor microenvironment, which is crucial in terms of analyzing tumor behavior and the response to therapy. The protocol details a method for establishing zebrafish-based patient-derived xenografts (zPDXs) from primary solid tumor surgical resection. After screening by an anatomopathologist, the specimen is dissected using a scalpel blade. Necrotic tissue, vessels, or fatty tissue are removed and then chopped into 0.3 mm x 0.3 mm x 0.3 mm pieces. 
The pieces are then fluorescently labeled and xenotransplanted into the perivitelline space of zebrafish embryos. A large number of embryos can be processed at a low cost, enabling high-throughput in vivo analyses of the chemosensitivity of zPDXs to multiple anticancer drugs. Confocal images are routinely acquired to detect and quantify the apoptotic levels induced by chemotherapy treatment compared to the control group. The xenograft procedure has a significant time advantage, since it can be completed in a single day, providing a reasonable time window to carry out a therapeutic screening for co-clinical trials.

Preclinical models aim to advance the knowledge of cancer biology and predict treatment efficacy. This paper describes the generation of zebrafish-based patient-derived xenografts (zPDXs) with tumor tissue fragments. The zPDXs were treated with chemotherapy, the therapeutic effect of which was assessed in terms of cell apoptosis of the transplanted tissue.

化学感受性試験のためのゼブラフィッシュ患者由来膵臓癌異種移植片の樹立

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...

ゼブラフィッシュ幼生の効率的なIn vivo腫瘍研究への活用

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we present larval zebrafish as a transplant model that has numerous advantages over murine models, including ease of handling, low expense, and short experimental duration. Moreover, the absence of an adaptive immune system during larval stages obviates the need to generate and use immunodeficient strains. While established protocols for xenotransplantation in zebrafish embryos exist, we present here an improved method involving embryo staging for faster transfer, survival analysis, and the use of flow cytometry to assess disease burden. Embryos are staged to facilitate rapid cell injection into the yolk of the larvae and cell marking to monitor the consistency of the injected cell bolus. After injection, embryo survival analysis is assessed up to 7 days post injection (dpi). Finally, disease burden is also assessed by marking transferred cells with a fluorescent protein and analysis by flow cytometry. Flow cytometry is enabled by a standardized method of preparing cell suspensions from zebrafish embryos, which could also be used in establishing the primary culture of zebrafish cells. In summary, the procedure described here allows a more rapid assessment of the behavior of tumor cells in vivo with larger numbers of animals per study arm and in a more cost-effective manner.

著者スポットライト:ゼブラフィッシュにおける腫瘍異種移植を用いたがん治療の進歩

We describe a protocol for xenotransplantation into the yolk of transparent zebrafish embryos that is optimized by a simple, rapid staging method. Post-injection analyses include survival and assessing the disease burden of xenotransplanted cells by flow cytometry.

透明ゼブラフィッシュ胚における腫瘍異種移植解析のための簡便、迅速、効果的な方法

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

（ゼブラフィッシュにおける癌細胞の血管浸潤能をテストします

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胚ゼブラフィッシュにおけるヒト乳癌細胞の浸潤挙動

腫瘍細胞の挙動および薬物応答の長期的研究のためのゼブラフィッシュ小児脳腫瘍の免疫適格宿主への移植

ゼブラフィッシュ腫瘍異種移植片における宿主血管新生応答の生体内イメージングと定量

ゼブラフィッシュにおける原発性腫瘍異種移植片の薬物スクリーニング

ゼブラフィッシュにおける機能化された蛍光シリカナノ粒子を用いた異種移植ヒト癌細胞のビボ標的化

ゼブラフィッシュラーバル異種移植片の生成と腫瘍行動解析

化学感受性試験のためのゼブラフィッシュ患者由来膵臓癌異種移植片の樹立

透明ゼブラフィッシュ胚における腫瘍異種移植解析のための簡便、迅速、効果的な方法

透明ゼブラフィッシュ胚における腫瘍異種移植解析のための簡便、迅速、効果的な方法

透明ゼブラフィッシュ胚における腫瘍異種移植解析のための簡便、迅速、効果的な方法