Name: nuclear magnetic resonance spectroscopy for the identification of multiple phosphorylations of intrinsically disordered proteins
Uploaded: 2016-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
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The NMR facilities were funded by the R&#233;gion Nord, CNRS, Pasteur Institute of Lille, European Community (FEDER), French Research Ministry and the University of Sciences and Technologies of Lille. We acknowledge support from the TGE RMN THC (FR-3050, France), FRABio (FR 3688, France) and Lille NMR and RPE Health and Biology core facility. Our research is supported by grants from the LabEx (Laboratory of Excellence) DISTALZ (Development of Innovative Strategies for a Transdisciplinary approach to Alzheimer's disease), EU ITN TASPPI and ANR BinAlz.

15 N、13 C-タウ（図1）の1.生産<ol><li> BL21にをpET15b-タウ組換えT7発現プラスミド13,14を変換（DE3）コンピテント大腸菌細菌細胞15。 注：最長（441アミノ酸残基）タウアイソフォームをコードするcDNAは、たpET15bプラスミド中にNcoIおよびXhoI制限部位の間にクローニングされています。 <ol><li>有能BL21 1.5ミリリットルのプラスチックチューブに100ngのプラスミドDNAとプラスミドDNAのμgのあたり1-5×10 7個のコロニーを形成する（DE3）細胞の穏やか50μlのを混ぜます。 注：真核生物のcDNA発現のためのコドン使用最適化された細菌株は、ヒトのタウを生成するために必須ではありません。 </li><li> 30分間氷上で細胞混合物を配置し、42℃で10秒間ヒートショック。バック氷上で5分間チューブを置き、室温LB（Luria-Bertani）培地の1ミリリットルを追加します。穏やかな下37℃で30分間細菌懸濁液をインキュベート攪拌。 </li></ol></li><li>アンピシリン抗生物質の100μg/ mlを含むLB培地の寒天プレート上に白金耳に均等に100μlの細胞懸濁液を用いて拡散。 </li><li> 37℃で15時間、選択プレートをインキュベートします。 </li><li>約2週間の最大のために、培養工程に進むまで4℃で選択プレートを保管してください。 注：細菌培養液（50％グリセロール）のグリセロールストックを、-80℃で保存されたが、後の段階で培養を開始するために調製することができます。 </li><li>オートクレーブ処理M9塩の1 L（6グラムの Na 2にHPO 4、3グラムのKH 2 PO 4をミリリットルの100mMのCaCl 2、10ミリリットル100倍のMEMビタミン補数1ミリリットルの1MのMgSO 4、1、1ミリリットルを100mg / mlのアンピシリンを追加します。 、0.5グラムのNaCl）。 注：白色の沈殿物はすぐに消散M9塩へのCaCl 2溶液の添加時に形成することになります。 </li><li> 15 Nの300mgを、13 C-完全培地、15 1gを溶解NH 4 ClおよびM9培地10mlで13 C 6 -グルコースの2グラム。フィルター滅菌直接M9培地に、0.2μmのフィルターを用いた同位体ソリューションを。 </li><li> 100μg/ mlのアンピシリンを添加したLB培地20mlに選択プレートから細菌を形質転換したpET15b-タウの接種ループ1コロニーを使用して一時停止します。 </li><li>約6時間、37℃で接種した培地をインキュベートします。 </li><li>プラスチック製の分光計のキュベット中の細菌培養物の10倍希釈の1ミリリットルで600 nmで（OD 600）での光学密度を測定します。 注：3.0から4.0の600を ODに対応する細菌培養物の濁度は、飽和増殖期に到達したことを示しています。 </li><li> 2 Lの三角プラスチックバッフル付き培養フラスコに、アンピシリン（100μg/ mlの最終濃度）を補充したM9成長培地の1Lに飽和LB培地20 mLを加え。 </li><li> 10°に設定し、プログラム可能なインキュベーターで培養フラスコを配置Cと50 rpmで。次の日の朝早く200rpmで、37℃に切り替えるにはインキュベーターをプログラムします。 </li><li>プラスチック製の分光計キュベット中の細菌培養物1ml 1のOD 600を測定します。 OD 600は、組換えタウタンパク質の発現を誘導するために、約1.0の値に達すると（-20℃に保たれ）1 M IPTG（イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド）ストック溶液の400μlのを追加します。 </li><li>さらに3時間37℃でインキュベーションを続けます。 20分間、5000×gでの遠心分離によって菌体を回収。 </li><li> -20℃で細菌ペレットを凍結します。必要に応じて長時間、精製工程まで凍結保管してください。 </li></ol> 15 Nの2精製、13 C-タウ（図2） <ol><li> 20分間、15 psiの下、121℃でオートクレーブ陽イオン交換（CEX）精製バッファー。 4°Cで保存するバッファ。 </li><li>細菌細胞ペレットを解凍し、45ミリリットルで徹底的に再懸濁抽出CEX新たにプロテアーゼ阻害剤カクテル1×（1錠）及びDNアーゼI（2,000単位）を補充した緩衝液（50mMのNaPi緩衝液pH 6.5、1 mMのEDTA）の。 </li><li> 20,000psiで高圧ホモジナイザーを使用して、細菌細胞を破壊します。 3-4パスが必要です。不溶性物質を除去するために40分間20,000×gで遠心分離します。 </li><li>水浴を用いて75℃で15分間、細菌細胞抽出物を加熱します。 注：白色沈殿物が数分後に観察されます。 </li><li> 20分間、15,000×gで遠心分離し、熱安定性タウ蛋白質を含有する上清を保ちます。 </li><li>次の精製工程まで-20°Cで保存し、必要に応じて。 </li><li>高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）システム（ 図3A）を用いて、5 mlの床カラムとしてパック強いCEX樹脂の陽イオン交換クロマトグラフィーを行います。 <ol><li> 2.5ミリリットル/分に設定流量。 </li><li>バッファCEXカラムを平衡化</li><li> 60〜70ミリリットルhea​​ted-をロードタウは、試料ポンプを使用して含有する抽出物、あるいはシステムに応じて、ポンプ。フロースルータウタンパク質を効率的に（2.8を参照）を樹脂に結合されていることを確認するための分析のために収集します。 </li><li> 280nmでの吸光度がベースラインに戻る値になるまで、CEX A緩衝液で樹脂を洗浄します。 </li><li> CEX Bバッファー（1 M NaClでCEX緩衝液）の緩やかな増加により得られた三段階NaCl勾配を用いてカラムから溶出タウ。プログラムFPLC次のように250mMの塩化ナトリウム、500mMのNaClに到達する5 CV 50％CEX Bのバッファに第二工程、第三工程に到達する10カラム容量（CV）で25％CEX Bバッファに傾斜する第一の工程と2 CVで100％CEX B緩衝液は、1MのNaClに到達します。溶出工程の間に1.5ミリリットルの画分を収集します。 </li></ol></li><li> SDS-PAGE（12％SDSアクリルアミドゲル）により溶出工程とクマシー染色（ 図3 A）16の間に収集された画分の10μLを分析します。 ANALYによってだけでなく、カラムに負荷ステップをチェックフロースルーを10μlシュッ。 </li><li>タウを含む画分を選択し、次のステップのためにこれらの画分をプール。 </li><li>タウ含有プールされた画分（ 図3 B）に緩衝液交換を行います。 <ol><li> FPLCシステムを用いて、50mMの重炭酸アンモニウム（揮発性緩衝液）中で53ミリリットルG25樹脂充填床（26×10センチ）の脱塩カラムを平衡化します。 </li><li> 5ミリリットル/分に設定流量。 5ミリリットル注入ループを介してカラム上のタウのサンプルを注入します。 280nmの吸収ピークに対応する画分を収集します。 </li><li>初期CEXプールのボリュームに応じて、注射を3-4回繰り返します。 </li></ol></li><li> （タウ1mgの140 MAU * mlに相当する）、280nmでのクロマトグラムのピーク面積を用いて精製したタウタンパク質の量を計算します。 注：280 nmにおけるタウタンパク質の吸光係数は、7550 M -1 -1です。タウは、任意のTrp残基が含まれていません。 </li><li>プールは、すべてのタウ画分。 </li><li> Aliquoタウの1〜5ミリグラムと同等のものを含むチューブにサンプルトン。溶液の体積は、チューブ（50mlチューブ中の溶液を、例えば、5ml）中の容積に比べて小さいように、これらのチューブを選択します。 </li><li>針を用いて、チューブキャップに穴をパンチ。 -80℃で凍結タウサンプル。 </li><li>凍結乾燥タウサンプル。凍結乾燥されたタウタンパク質は、長期間-20℃で保存することができます。 </li></ol> 15 N-タウのin vitroリン酸化3. <ol><li> 500μlのリン酸化緩衝液（50mMのHepes・KOH、pHは8.0、12.5ミリモルのMgCl 2、1mMのEDTA、50mMのNaCl）中で凍結乾燥されたタウ5mgを溶解させます。 </li><li> 0.5 M株式の2.5 mMのATP（100mMのストック溶液25μlを-20℃で保存）、1mMのDTT（1 Mストック溶液1μlは、-20℃で保存）、1mMのEGTAを追加（2μlの溶液）、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル（1 mlのリン酸化緩衝液中に1錠を溶解した40倍ストックの25μL）および181; Mは、総サンプル体積中（保全バッファーて10mMのHepes、pHが7.3、-80℃で保存1mMのDTT、5mMのMgCl 2、100mMのNaCl、10％グリセロール、250μlの）彼の-ERK2を活性化します1ミリリットル。 注：活性化された彼の-ERK2はMEKキナーゼでリン酸化することにより、社内で5,8調製することができます。 </li><li> 37℃で3時間インキュベートします。 </li><li> ERKキナーゼを不活性化するために15分間75℃で試料を加熱します。 </li><li> 15分20,000×gで遠心分離します。収集し、上清を保持します。 </li><li> 1ミリリットルのサンプルに適して3.45ミリリットルG25樹脂充填床（1.3×2.6センチメートル）のカラムを用いて50mMの重炭酸アンモニウムへのタンパク質試料を脱塩します。 </li><li>その完全性と効率的なリン酸化（ 図4）の両方をチェックするためにタンパク質試料の2.5μlの12％SDS-PAGE 16を実行します 。 </li><li>リン酸化タウのサンプルを凍結乾燥。 -20℃で粉末を保管してください。 </li></ol> NMRスペクトルの4買収（FIグレ5） <ol><li>凍結乾燥された15 Nの4 mgを、400μlのNMRバッファ内の13 C ERKリン酸化タウ（50 mMののNaPiまたはトリス- D11 .Cl重水素化の50mM、pH6.5の、30mMの塩化ナトリウム、2.5mMのEDTAおよび1mM DTT）を可溶化します。 </li><li>内部のNMR信号基準としてNMR分光計のフィールドのロックおよび1mM TMSP（3-（トリメチルシリル）プロピオン-2,2,3,3- D 4酸ナトリウム塩））、5％のD 2 Oを追加します。完全プロテアーゼ阻害剤カクテルの40倍ストック溶液10μlを加えます。 </li><li>長い針またはパスツールピペットで電子注射器を用いて、5mmのNMRチューブにサンプルを転送します。プランジャーを使用して、NMR管を閉じます。プランジャーの動きによってプランジャと液体の間に閉じ込められた任意の気泡を除去します。 </li><li>スピナーでNMR管を配置します。試料溶液のほとんどは、NMRコイルの内側となるように、使用されるNMRプローブヘッドのための適切なゲージでスピナーでその垂直位置を調整します。 </li><li>空気の流れを開始します。 リフト私をクリック磁石制御システムウィンドウをNです。慎重に磁石ボアの上部の気流にチューブをスピナーを置きます。空気の流れを停止します（ リフトをクリックして）、チューブを磁石にプローブヘッド内部の所定の位置に降りてみましょう。 </li><li> 25°C（298 K）に設定された温度。 </li><li>動力伝達を最適化するために、プローブヘッドの半自動チューニング及びマッチングを行います。コマンドラインでatmm入力します。 </li><li>重水素チャンネルで録音したサンプルのD 2 O信号を用いた分光周波数をロックします。磁石制御システムウィンドウでロックをクリックします。 </li><li>試料の位置における磁場の均一性を最適化するために、シミング手順を開始します。シム・ウィンドウを開くには、コマンドラインでtopshim GUIを入力します。シム・ウィンドウで開始 ]をクリックします。シムは（2未満Hzのが良いです）最適であることを確認するために、残留B0標準偏差値を確認してください。 </li><li>プロトンのP1パラメータ（長さのキャリブレーションプロトンスピンの90°の回転を得るために必要であるマイクロ秒での高周波パルス）。水プロトンの1Dスペクトル（ 図6）を用いて、360°パルスを目指します。 </li><li> （ 図6）1Dスペクトルにおけるプロトン水周波数（Hz単位）O1パラメータを設定することにより、周波数オフセットを調整します。 </li><li>サンプル（ 図7）からの信号を確認するために（例えばzggpw5のために、水信号抑圧のためのウォーターゲートの配列を有するパルス・シーケンス）1Dプロトンスペクトルの取得を開始します。相対的なタンパク質濃度にスキャン数を適応させます。取得を開始するには、コマンドラインでZG入力します。 </li><li> （パルスシーケンスhsqcetfpf3gpsi、8-9図 ）2D [1 H、15 N] HSQCスペクトルを取得するための追加パラメータを設定します。 <ol><li> 15 Nについては、13 C、15 N、間接的進化の間に13 Cを切り離す、サンプルを標識しました。 </li><li&gt; 1 H（F2）および15 N（F1）次元での点の数とスペクトル幅（ppm）を設定します。 注：ポイントごとヘルツ同様の数を維持し、デカップリング時間を制限するために、分光器のフィールドに取得データポイントの数を適応：1 H次元で、600 MHzで900 MHzおよび2048ポイントで3072ポイントを使用しています。 </li><li>追加の遅延に対応するパルスシーケンスのパラメータ、パルス長、オフセット周波数、電力レベルを最適化します。タイプは、実験に関連するすべてのパラメータを表示するには、コマンドラインでASED。 </li></ol></li><li> 600 MHzで3D [1 H、15 N、13 C] HNCACBスペクトル（パルスシーケンスhncacbgpwg3d、 図10A）の取得のためのパラメータを設定。 </li><li> 600 MHzで3D [1 H、15 N、15 N] HNCANNH実験（パルスシーケンスhncannhgpwg3d）のためのパラメータを設定。 1 Hに2048ポイントの数を設定して、64そして2 15 N次元で128点。 、25は、百万分率（ppm）25部は4.7、119、1 Hで119 ppmで、15 Nおよび15 N寸法を中心に14としてスペクトル幅を定義します。 16スキャンで取得期間は1日と22時間です。 </li></ol>リン酸化部位の同定5. <ol><li>収集処理NMRソフトウェアを使用して処理スペクトル。 <ol><li>データ（ 図7）のフーリエ変換を実行します。 1Dスペクトルの型フィート 、2DスペクトルのためのXFBまたはコマンドラインで、3Dスペクトルをft3d。 </li><li>対話型のウィンドウを使用して位相およびリファレンスすべてのスペクトル（ 図7C）。 </li></ol></li><li> 2D HSQCが潜在的リン酸化のSerおよびThr残基（ 図9、赤いボックス）に対応するの関心の共振を特定します。 </li><li>抽出面からの（ すなわち 、2D 1 H- 13 Cスペクトル）2Dにおける関心の共鳴の15 N化学シフトを用いた3次元1 H- 15 N- 13 Cスペクトル。可視化する面（W1-W3）に対応した15 Nの周波数（ 図10B）を選択する次元2（W2）のカーソルを使用してください。 </li><li> 「CA」の共振周波数を選択し、それぞれの[1 H、15 N]共鳴のための「私」と「I-1」残基（I残基のものに比べて信号の弱い組）の「CB」13 C核ポインタモードメニューで、共振をクリックしてHNCACB 3Dスペクトルの関心のピークリストファイルに化学シフト値を追加するには、ピークを追加/見つけます。 <ol><li> pSerおよびPTHR 17のCAとCB化学シフトの既知の値にピークリスト内の化学シフトを比較することによって、私の残基の種類、のpSerまたはPTHRを識別します。 </li><li>特徴的な追加の2 ppmのシフトOによってI + 1位のPro残基の存在を特定しますCAの化学シフト値18 F。 </li><li>化学シフトの表に、I-1残基に対応するCAとCB共鳴の化学シフト値を比較し、I-1位の残基の性質を識別するために、タウのアミノ酸残基19を予測しました 。 </li></ol></li><li> &#39;i&#39;はHNCANNHスペクトルの関心の各[1 H、15 N]共鳴のためにと「I-1」残基の15 N核の共鳴周波数を選択してください。 </li><li> 23 -タウタンパク質20の化学シフトの割り当てに15 N化学シフト値を比較します。 </li><li>配列特異的な割り当てを定義するにはタウ・シーケンスで識別ジペプチドを比較してください。 </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

私たちは、酵素的に修飾タウサンプルを特徴づけるためにNMR分光法を使用しています。全長ヒトタウタンパク質のためにここに記載の組換え発現および精製は、同様に変異タウまたはタウドメインを生成することができます。同位体濃縮されたタンパク質は、組換え発現を必要とする、NMR分光法のために必要とされます。リン酸化部位の同定は、共鳴の割り当てと15 N、13 C二?...

21世紀の医療の主な課題の1つは、アルツハイマー病（AD）などの神経変性疾患です。タウは、微小管（MT）の形成を刺激する微小管結合タンパク質です。タウは、最もよく知られている、いわゆるタウオパチーは、ADである、いくつかの神経変性疾患においても同様に関与しています。これらの疾患では、タウ対らせん状フィラメント（たPHF）で自己集合体とは、リン酸化の1のような翻訳後修飾（PTMを）により、多くの残基に変更された発見されました。タウタンパク質のリン酸化は、MTの安定化とADの神経細胞を特徴付ける関数の病理学的喪失のその生理学的機能の両方の調節に関与しています。 また、病気のニューロンでのPHFに統合タウタンパク質は、必ず2を過剰リン酸化されています。 2-3リン酸基を含んでいる通常のタウとは異なり、のPHF中の過リン酸化タウは、5から9 phosphatが含まれていますe基3。タウの過剰リンは、いくつかのサイトでの化学量論の増加におよびリン酸化の病理学的部位と呼ばれる追加の部位のリン酸化の両方に対応しています。しかし、オーバーラップはレベル4で量的な違いにもかかわらず、ADおよびリン酸化の正常な成人のパターンとの間に存在します。タウのどの特定のリン酸化事象の影響関数と機能障害はほとんど不明のまま。私たちは、分子レベルでのPTMによってタウ規制を解読することを目指しています。 タウの分子的側面の理解を深めるために、我々は技術的な課題に対処する必要があります。まず、タウは、溶液中で単離された本質的に無秩序なタンパク質（IDP）です。そのようなタンパク質は、生理学的条件下で十分に定義された三次元構造を欠き、その機能（複数可）および構造的特性を研究するために、特定の生物物理学的方法を必要とします。タウは、多くの場合、関連付けられた発見、国内避難民の成長クラスのパラダイムであります神経変性疾患のような病理は、したがって、それらの機能の基礎となる分子パラメータを理解するために関心が高まっ。第二に、タウのリン酸化の特徴付けは最長441アミノ酸のタウアイソフォームの配列に沿って80の潜在的なリン酸化部位で、分析的な課題です。抗体の数は、タウのリン酸化されたエピトープに対して開発されており、ニューロンまたは脳組織中の病理学的タウの検出のために使用されます。リン酸化事象は、プロリンに富む領域内に近接して、プロリン指向性キナーゼによって標的と少なくとも20のサイトにそれらのほとんどを行うことができます。定性（どのサイト？）および定量的（どの化学量論？）キャラクタリゼーションは、最も最近のMS技術5により困難です。 NMR分光法は、配座のアンサンブルから構成される非常に動的なシステムである無秩序なタンパク質を研究するために使用することができます。高分解能NMR分光法は、アプリましたタウタンパク質の構造と機能の両方を調査するために編。 8 -また、タウのリン酸化プロファイルの複雑性は、リン酸化部位6を識別するためのNMRを使用して分子ツール、新しい分析法の開発につながりました。分析方法としてNMRは、リン酸取り込みの程度の全体的な方法で、タウのリン酸化部位の同定、単一の実験内のすべての単一サイトの変更の可視化、定量化を可能にします。タウ上のリン酸化研究は文献にあふれているが、それらのほとんどは、リン酸化の完全なプロファイルの不確実性の大きな程度のため、個々のリン酸化事象の真のインパクトを残して、抗体を用いて行われてきたので、この点は必須です。 PKA、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β（GSK3β）、サイクリン依存性キナーゼ2 /サイクリンA（CDK2 / CycA）、サイクリン依存性キナーゼ5（CDK5）/ P25の行為を含む組換えキナーゼタウ向かっリン酸化活性を示すivatorタンパク質、細胞外シグナル調節キナーゼ2（ERK2）と微小管親和性調節キナーゼ（MARK）は、活性形態で調製することができます。また、十分に特徴付けられたリン酸化パターンと特定のタウタンパク質アイソフォームの生成を可能にするタウ変異体は、タウのリン酸化のコードを解読するために使用されます。 8 - NMR分光法は次に酵素的に修飾されたタウのサンプル6を特徴付けるために使用されます。タウのin vitroリン酸化は、このようなグルタミン酸（Gluの）残基に選択されたセリン/スレオニンの変異などによって擬似リン酸化よりも困難ではあるが、このアプローチは、そのメリットがあります。実際に、リン酸化のいずれも構造的な影響も相互作用パラメータは、常にグルタミン酸によって模倣することができます。例では、Gluの突然変異9で再現されていないホスホセリン202（pSer202）の周りに観察ターンモチーフ/ホスホトレオニン205（pThr205）、です。 インビトロでのリン酸化のタウの詳細なプロトコルが提示されています。 12 - ERK2は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ/ ERKキナーゼ（MEK）10によるリン酸化によって活性化されます。修飾された、同位体標識されたタウタンパク質の調製に加えて、のPTMの同定のために使用されるNMR戦略が記載されています。

<table><tbody><tr><td>pET15B recombinant T7 expression plasmid</td><td>Novagen</td><td>69257</td><td>Keep at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>BL21(DE3) transformation competent &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; bacteria</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td>Keep at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Autoclaved LB Broth, Lennox&amp;nbsp;</td><td>DIFCO</td><td>240210</td><td>Bacterial Growth Medium</td></tr><tr><td>MEM vitamin complements 100x</td><td>Sigma</td><td>58970C</td><td>Bacterial Growth Medium Supplement</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N, &lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C-ISOGRO complete medium powder</td><td>Sigma</td><td>608297</td><td>Bacterial Growth Medium Supplement</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma</td><td>299251</td><td>Isotope</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;-Glucose</td><td>Sigma</td><td>389374</td><td>Isotope</td></tr><tr><td>Protease inhibitor tablets&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td>Keep at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>1 tablet in 1 ml is 40x solution that can be kept at -20 &amp;deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>EUROMEDEX</td><td>1307</td><td>Keep at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Homogenizer (EmulsiFlex-C3)</td><td>AVESTIN</td><td></td><td>Lysis is realized at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Pierce&amp;trade; Unstained Protein MW Marker</td><td>Pierce</td><td>266109</td><td></td></tr><tr><td>Active human MEK1 kinase, GST Tagged</td><td>Sigma</td><td>M8822</td><td>Keep at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>AKT&amp;Auml; Pure chromatography system</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FPLC</td></tr><tr><td>HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5156-01</td><td>Cation exchange chromatography columns</td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 Desalting</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5087-01</td><td>Protein Desalting column</td></tr><tr><td>PD MidiTrap G-25</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9180-08</td><td>Protein Desalting column</td></tr><tr><td>Tris D11, 97% D</td><td>Cortecnet</td><td>CD4035P5</td><td>Deuterated NMR buffer</td></tr><tr><td>5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (set of 5 inner &amp;amp; outerpipe)&amp;nbsp;</td><td>Euriso-top</td><td>BMS-005B</td><td>NMR Shigemi Tubes</td></tr><tr><td>eVol kit-electronic syringe starter kit</td><td>Cortecnet</td><td>2910000</td><td>Pipetting</td></tr><tr><td>Bruker 900 MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead</td><td>Bruker</td><td></td><td>NMR spectrometer for data acquisition</td></tr><tr><td>Bruker 600 MHz Avance with a triple resonance cryogenic probehead</td><td>Bruker</td><td></td><td>NMR spectrometer for data acquisition</td></tr><tr><td>TopSpin 3.1</td><td>Bruker</td><td></td><td>Acquisition and Processing software for NMR experiments</td></tr><tr><td>Sparky 3.114</td><td>UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller)</td><td></td><td>NMR data Analysis software</td></tr></tbody></table>

nuclear magnetic resonance spectroscopy for the identification of multiple phosphorylations of intrinsically disordered proteins

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau's heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

図3Aは、溶出勾配の間に観察された280nmの主要な吸収ピークを示します。クロマトグラム以上のアクリルアミドゲル上で見られるように、このピークは、精製されたタウタンパク質に相当します。 図3Bは、タンパク質の脱塩が効率的であることを確認して、280 nmおよび導電率のピーク時によく分離吸収ピークを示しています。 図4は、タンパク質のSDS-PAGE分析により、複?...

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Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

本質的に無秩序なタンパク質の複数のリン酸化の同定のための核磁気共鳴分光法

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

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18.7K ビュー.  Lille University. We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

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Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications (PTMs). They are newly identified species with unknown means of establishment and functional implications. Current analytical methods are inadequate to detect the copy-specific occurrence of PTMs on the nucleosomal sister histones. This protocol presents a biochemical method for the in vitro reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. The generated complex can be also asymmetrically modified, after including a premodified histone pool during refolding of histone subcomplexes. These asymmetric nucleosome preparations can be readily reacted with histone-modifying enzymes to study modification cross-talk mechanisms imposed by the asymmetrically pre-incorporated PTM using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Particularly, the modification reactions in real-time can be mapped independently on the two sister histones by performing different types of NMR correlation experiments, tailored for the respective isotope type. This methodology provides the means to study crosstalk mechanisms that contribute to the formation and propagation of asymmetric PTM patterns on nucleosomal complexes.

This protocol describes the reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. At the same time, asymmetrically post-translationally modified nucleosomes can be generated after using a premodified histone copy. These preparations can be readily used to study modification crosstalk mechanisms, simultaneously on both sister histones, by using high-resolution NMR spectroscopy.

示差同位体で標識された姉妹ヒストンとヌクレオソームの再構成

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

生化学

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

リン酸化部位決定のためのオリゴペプチド競合アッセイ

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the propagation of neurodegenerative disorders. Such assemblies consist in multiple protein subunits organized in a non-covalent way to form large macromolecular objects that can execute a variety of cellular functions or cause detrimental consequences. Atomic insights into the assembly mechanisms and the functioning of those macromolecular assemblies remain often scarce since their inherent insolubility and non-crystallinity often drastically reduces the quality of the data obtained from most techniques used in structural biology, such as X-ray crystallography and solution Nuclear Magnetic Resonance (NMR). We here present magic-angle spinning solid-state NMR spectroscopy (SSNMR) as a powerful method to investigate structures of macromolecular assemblies at atomic resolution. SSNMR can reveal atomic details on the assembled complex without size and solubility limitations. The protocol presented here describes the essential steps from the production of 13C/15N isotope-labeled macromolecular protein assemblies to the acquisition of standard SSNMR spectra and their analysis and interpretation. As an example, we show the pipeline of a SSNMR structural analysis of a filamentous protein assembly.

Structures of supramolecular protein assemblies at atomic resolution are of high relevance because of their crucial roles in a variety of biological phenomena. Herein, we present a protocol to perform high-resolution structural studies on insoluble and non-crystalline macromolecular protein assemblies by magic-angle spinning solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy (MAS SSNMR).

固体核磁気共鳴分光法による高分子アセンブリの原子スケール構造の研究

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human proteome. The highly flexible nature of these sequences allows them to form weak, long-range, and transient interactions with diverse biomolecular partners. Specific yet low-affinity interactions promote promiscuous binding and enable a single intrinsically disordered segment to interact with a multitude of target sites. Because of the transient nature of these interactions, they can be difficult to characterize by structural biology methods that rely on proteins to form a single, predominant conformation. Paramagnetic relaxation enhancement NMR is a useful tool for identifying and defining the structural underpinning of weak and transient interactions. A detailed protocol for using paramagnetic relaxation enhancement to characterize the lowly-populated encounter complexes that form between intrinsically disordered proteins and their protein, nucleic acid, or other biomolecular partners is described.

A protocol for the application of paramagnetic relaxation enhancement NMR spectroscopy to detect weak and transient inter- and intra-molecular interactions in intrinsically disordered proteins is presented.

天然的に無秩序なタンパク質の自己会合の検出と特性評価のための常磁性緩和増強

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to measure protein phosphorylation cannot preserve the heterogeneity in phosphorylation across individual proteins. The single-molecule pull-down (SiMPull) assay was developed to investigate the composition of macromolecular complexes via immunoprecipitation of proteins on a glass coverslip followed by single-molecule imaging. The current technique is an adaptation of SiMPull that provides robust quantification of the phosphorylation state of full-length membrane receptors at the single-molecule level. Imaging thousands of individual receptors in this way allows for quantifying protein phosphorylation patterns. The present protocol details the optimized SiMPull procedure, from sample preparation to imaging. Optimization of glass preparation and antibody fixation protocols further enhances data quality. The current protocol provides code for the single-molecule data analysis that calculates the fraction of receptors phosphorylated within a sample. While this work focuses on phosphorylation of the epidermal growth factor receptor (EGFR), the protocol can be generalized to other membrane receptors and cytosolic signaling molecules.

The present protocol describes sample preparation and data analysis to quantify protein phosphorylation using an improved single-molecule pull-down (SiMPull) assay.

タンパク質リン酸化の定量のための最適化された1分子プルダウンアッセイ

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

糖鎖-タンパク質相互作用解析のための高度なNMR技術

Disentangling Glycan-Protein Interactions: Nuclear Magnetic Resonance (NMR) to the Rescue

The interactions of glycans with proteins modulate many events related to health and disease. In fact, the establishment of these recognition events and their biological consequences are intimately related to the three-dimensional structures of both partners, as well as to their dynamic features and their presentation on the corresponding cell compartments. NMR techniques are unique to disentangle these characteristics and, indeed, diverse NMR-based methodologies have been developed and applied to monitor the binding events of glycans with their associate receptors. This protocol outlines the procedures to acquire, process and analyze two of the most powerful NMR methodologies employed in the NMR-glycobiology field, 1H-Saturation transfer difference (STD) and 1H,15N-Heteronuclear single quantum coherence (HSQC) titration experiments, which complementarily offer information from the glycan and protein perspective, respectively. Indeed, when combined they offer a powerful toolkit for elucidating both the structural and dynamic aspects of molecular recognition processes. This comprehensive approach enhances our understanding of glycan-protein interactions and contributes to advancing research in the chemical glycobiology field.

著者スポットライト:糖鎖分子認識の構造的および動的側面の解明

Here, we present a protocol detailing the acquisition, processing, and analysis of a series of NMR experiments aimed at characterizing protein-glycan interactions in solution. Most common ligand-based and protein-based methodologies are outlined, which undoubtedly contribute to the fields of structural glycobiology and molecular recognition studies.

糖鎖-タンパク質相互作用の解きほぐし:核磁気共鳴(NMR)による解決

The interactions of glycans with proteins modulate many events related to health and disease. In fact, the establishment of these recognition events and ...

化学

<meta charset="utf8"></head><body>蛋白質の動力学の調査のNMR 15Nの緩和およびhetNOEの実験のためのプロトコル

NMR 15N Relaxation Experiments for the Investigation of Picosecond to Nanoseconds Structural Dynamics of Proteins

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy allows studying proteins in solution and under physiological temperatures. Frequently, either the amide groups of the protein backbone or the methyl groups in side chains are used as reporters of structural dynamics in proteins. A structural dynamics study of the protein backbone of globular proteins on 15N labeled and fully protonated samples usually works well for proteins with a molecular weight of up to 50 kDa. When side chain deuteration in combination with transverse relaxation optimized spectroscopy (TROSY) is applied, this limit can be extended up to 200 kDa for globular proteins and up to 1 MDa when the focus is on the side chains. When intrinsically disordered proteins (IDPs) or proteins with intrinsically disordered regions (IDRs) are investigated, these weight limitations do not apply but can go well beyond. The reason is that IDPs or IDRs, characterized by high internal flexibility, are frequently dynamically decoupled. Various NMR methods offer atomic-resolution insights into structural protein dynamics across a wide range of time scales, from picoseconds up to hours. Standard 15N relaxation measurements overview a protein&#39;s internal flexibility and characterize the protein backbone dynamics experienced on the fast pico- to nanosecond timescale. This article presents a hands-on protocol for setting up and recording NMR 15N R1, R2, and heteronuclear Overhauser effect (hetNOE) experiments. We show exemplary data and explain how to interpret them simply qualitatively before any more sophisticated analysis.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:NMR緩和実験による本質的に不規則なタンパク質ダイナミクスの探索

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy can characterize structural protein dynamics in a residue-specific manner. We provide a hands-on protocol for recording NMR 15N R1 and R2 relaxation and {1H}-15N heteronuclear Overhauser effect (hetNOE) experiments, sensitive to the picoseconds to nanoseconds timescale.

タンパク質のピコ秒からナノ秒の構造ダイナミクスを調べるためのNMR 15N緩和実験

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy allows studying proteins in solution and under physiological temperatures. Frequently, either the amide ...

本質的に無秩序なタンパク質の複数のリン酸化の同定のための核磁気共鳴分光法

要約

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示差同位体で標識された姉妹ヒストンとヌクレオソームの再構成

リン酸化部位決定のためのオリゴペプチド競合アッセイ

固体核磁気共鳴分光法による高分子アセンブリの原子スケール構造の研究

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

天然的に無秩序なタンパク質の自己会合の検出と特性評価のための常磁性緩和増強

タンパク質リン酸化の定量のための最適化された1分子プルダウンアッセイ

糖鎖-タンパク質相互作用の解きほぐし:核磁気共鳴(NMR)による解決

糖鎖-タンパク質相互作用の解きほぐし:核磁気共鳴(NMR)による解決

糖鎖-タンパク質相互作用の解きほぐし:核磁気共鳴(NMR)による解決

タンパク質のピコ秒からナノ秒の構造ダイナミクスを調べるためのNMR ¹⁵N緩和実験