ここで説明する呼吸器病原体アッセイの作業はコーネルアニマルヘルス診断センター内部開発資金によってサポートされていました。ナノスケールのPCRワークフローと関連する品質保証システムの開発は、部分的に（FOA PA-13から244）資金を提供し、助成金番号1U18FD005144-下に食品医薬品局（FDA）の獣医研究所調査・対応ネットワーク（FDA獣医-LIRN）と共同で実施しました01。出版料はVWRとクアンタBiosciences社が主催しました。私たちは、書き込みやプロトコルの見直しとその支援のためにガブリエル・ニッカーソン、Roopa Venugopalan、Veldinaカモ、XiuLin張、Jinzhiゆう、Weihua王、およびカトリーナウォーカーに感謝します。私たちは、作者のインタビューを撮影するためのマイク・キャロルに感謝します。我々は最終的に彼らの役に立つコメントのためのエディタと3匿名の査読をお願いいたします。

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マーシャ・スレーターとエレンオルテンベルクは、この記事で使用する試薬および器具を生産サーモフィッシャーサイエンティフィック社の従業員です。

この手順は、6ヶ月（週2~3回）にわたって我々の研究室での呼吸器病原体のルーチン試験に使用されてきました。また、個別にカスタマイズされたプレート上の糞便サンプルおよび細菌分離株における腸管病原体プロファイリングのために同じ手順を使用して成功を収めています。プレートが生産されると、経験豊富なスタッフが一つの標準勤務時間内の2-7のステップを完了することができます。最も重要なステップは、プリアンププレート、（蒸発を防ぐために迅速に行わなければなりません）プレート間の前置サンプルの転送、および増幅プレートの最終的なカバーの適切なシールです。それが大幅にこのプロセスに必要な時間や事務処理の量を減少させたとして結果の分析（サンプルおよびコントロールの曲線をチェックする）ためのガイドとして、マクロのスプレッドシートを使用することも重要でした。提供マクロスプレッドシートは一例です。それは、異なる構成を有する板のために修正または再作成する必要があります。これは簡単にPEすることができます基本的なスプレッドシートの知識を持つ誰かによってrformed。 増幅板（33 NL）上にロードしたサンプルの非常に少量に、前増幅が必要とされます。このプロトコル（図示せず）の最適化では、増幅前にマスターミックス、ランダムプライマーの添加、サイクル数、アニール時間、および希釈を含む前置増幅パラメータの数を比較しました。各ターゲットは独自の最適な条件を持っていて、ここに記載されているものは、私たちのパネルの全体的な検出の最高の限界をもたらしたものを表します。このパネルには、ルーチン獣医の診断テストで検出された病原性ターゲットとサンプルタイプの広い範囲をカバーしていますが、プリアンプ手順への変更は、異なるパネルのために必要になることがあります。製造者に最適化された増幅条件は、95℃、アンでの変性、続いて95℃の酵素活性化で10分間で標準プローブベースのリアルタイムPCRプロトコルに基づいています60℃でのイーリング/エクステンション。プライマーおよびプローブはまた、メーカーに最適化された条件、したがって、滴定を必要としないを使用して、プレート上に予め印刷されています。 （関係なく、ターゲットのタイプの）全ての試料について、逆転写および予備増幅工程を組み合わせることで、ワークフローの効率を維持するために必要でした。全てのサンプルが逆転写し持つことも、感度を最大化するために有益です。さらに、阻害剤を最小限に抑えるために最適化されたプリアンプ用マスターミックスの使用は、同じプレート上の異なるサンプルタイプを組み合わせることで汎用性を可能にします。 シュウらによって記載された疾病管理センター（CDC）インフルエンザマトリックスアッセイ。7およびナノリットルスケールの反応のためにここに適合した人間とコンパニオンアニマルからサンプルをテストするのに適しているアッセイ普遍的なインフルエンザです。これは、マイクロリットルスケールのレアを使用して、すべてのA型インフルエンザウイルスのマトリックス遺伝子の普遍的検出のために設計されましたctions。これは、CDCヒトインフルエンザウイルスパネルとCDC豚インフルエンザパネルの一部として世界中で使用されています。ここで適応EHV-1アッセイ8は、流産や神経疾患（Pusterlaとハッセー10によってレビュー）を引き起こす可能性があります馬の重要な呼吸器病原体を検出します。種に依存しない内部対照とのハイスループットプラットフォームにこれらのテストを適応の重要性は、それらがOneHealth監視手法に組み込むことができることです。高スループットのテストプラットフォーム上でこれらのアッセイの両方を持つことは、臨床施設、避難所、およびパフォーマンスイベントのための緊急事態への準備を容易にするであろう。 上記の結果は、分析的な性能にかなり多くの変動を示したマイコプラズマカニクイザルを除いて、プレート上のすべてのターゲットの代表でした。これは、理想的には58〜60となるべきであるプライマーの次善の融解温度（T m）に思われました＃176; C（理想的なプローブのTmは、68から70℃です）。このプラットフォームの制限は、それが迅速に配列を変更する能力を制限する個々のプローブを、注文の場合よりもプレートの設計、製造に時間がかかることです。一般に、リアルタイムPCRの他の制限は、新規または予期しない病原体を検出することができないことです。これは、複数の種における配列に一致するアッセイを設計することによってある程度克服することができますが、公平な全ゲノムシーケンシングベースの方法論は、新規薬剤の発見のために、より適しています。11,12 ナノスケールのリアルタイムPCRは、シンドロームベースではなく、高スループット分子診断における試薬や人件費を低減するために有用である種ベースのテストのための新しいパラダイムを可能にします。このアプローチによる大規模なパネルテストは、ダンとGurfield 13とMoutailler ら 14に記載されているようなOneHealthサーベイランスを容易にすることができます。初期のスワブサンプルの収集、一般的に臨床的発症の3日以内に、呼吸器病原体の存在を同定するための最良の機会を提供します。感染症の出現は、多くの場合、予測不可能であり、および試薬の変更を必要とすることなく、異なる種に対して実行できるテストは準備のために理想的です。この技術の将来のアプリケーションはpathotyping、抗菌薬耐性プロファイリング、さらにシンドロームベースの臨床診断のパネルにある可能性が高いです。ナノスケールリアルタイムPCRは、複数のサンプルの病原体タイプの迅速、ハイスループットスクリーニングのために最も有用であり、新しく出現する病原体を同定するための公平なまたは部分的にバイアスされたシークエンシングに基づくアプローチによって補完されます。

単一疾患のためにテストされている多数のサンプルに使用しない限り、ヒトおよび動物のための臨床診断における複数のエージェントの迅速かつ包括的に検出するための需要が、病原体検出のための単一の生物の分子診断方法は厄介です。獣医学的文脈では、ハイスループット診断方法が原因種の多種多様な病原体をカバーするための追加の必要性に特に重要です。食品媒介性疾患の管理や新興病原体サーベイランスのために近づくOneHealth細菌、ウイルス（DNAまたはRNAベース）、寄生虫、および真菌の数を含むテストのニーズの一例です。テスト効率を向上させるために一緒に複数の検体（多重化）のためのテストを組み合わせることへの挑戦は、感度の損失の可能性と最適化およびアッセイの検証のための大きな負担となっています。 ナノリットルスケールリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を変更であります多くの別々の反応は、同じ試料1上で同時に実行することを可能にする多重化の実施にネイティブ。 OpenArrayプラットフォームは、この原則2のアプリケーションです。それは、リアルタイムPCRとマイクロアレイ技術を兼ね備えています。空間多重化の概念に基づいて、すべてのサンプルは、貫通孔別個で多数のターゲットのために試験されます。このプラットフォームは、最初はシアニン系の二本鎖DNA結合化学2を使用し、暗い消光プローブ3を用いて、プローブベースの化学的性質のために利用できるようになりましたました。このプラットフォームは、主に人間4及び動物5に遺伝的プロファイリングに使用されています。最近、Grigorenko らによって血液由来DNA及びRNAの病原体を検出するように適合された。6二段階の逆転写/プレ増幅（プリアンプ）の手順を使用して。 ここでは、呼吸秒で病原体の両方のタイプを検出するためのワンステッププリアンプベースの手順を説明しますretionsと標準勤務時間内で完全に行うことができ、他の様々なサンプルタイプ。ワンステップのプリアンプが完了すると、サンプルは、このナノスケールPCRプラットフォームに付属の自動液体ハンドリングシステムによって受け入れられるフォーマットで384ウェルプレートに移します。システムは、一度に最大4枚のプレート（192検体およびコントロール）の表面を横切ってマスターミックスとサンプルを描画します。このロード処理の後、我々はサンプルが増幅され、1枚のプリントページに収まるの表に、各サンプル/ターゲットの組み合わせの3技術的反復の平均をまとめたマクロスプレッドシートを用いて分析する方法について説明します。 このプラットフォームを使用したサンプルから抽出したDNAおよび/またはRNAを分析するための統一された方法を確立しました。サンプルの多種多様なエラーの可能性を最小限に抑え、逆転写され、抽出された96ウェルフォーマットで事前に増幅しました。テストした呼吸サンプルは鼻腔スワブ、深い咽頭スワブを含め、トランス気管洗浄液、気管支肺胞洗浄液、および肺組織。試験された薬剤のいくつかはまた、末梢血または糞便中に存在することができるので、我々は、プロシージャに、サンプルのこれらのタイプを組み込みました。この合理化されたワークフローは、個々のテストの代わりにパネルベースの病原体や毒素遺伝子の検出によって、効率的なテストを可能にすることによって、複数のプレートで実験を実行するに比べて時間とリソースを節約するのに役立ちます。ここで実証した呼吸器パネルは18アッセイは、各プレートあたり48サンプルまで収容、スルーホール三重に印刷されていました。検出されたウマの病原体は、ウマアデノウイルス1及び2、ウマ動脈炎ウイルス、ウマ鼻炎ウイルスA及びB、ウマヘルペスウイルス（EHV）タイプ1及び4、及びストレプトコッカス・エクイを含んでいました 。イヌの病原体は、イヌ呼吸器コロナウイルス（betacoronavirus）、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌニューモ、 気管支敗血症菌、およびマイコプラズマカニクイザルが含まれていました 。 Aユニバーサルインフルエンザアッセイおよび内部統制（MS2 RNAファージ）も含まれていました。

<table><tbody><tr><td>Zap-OGlobin II lytic reagent</td><td>Beckman Coulter</td><td>7546138</td><td>Optional reagent for preparing blood samples.</td></tr><tr><td>Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>AM1840</td><td>Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer.</td></tr><tr><td>2x One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix)</td><td>Quanta Biosciences</td><td>95134-500</td><td></td></tr><tr><td>Gene-specific primer pool</td><td>IDT</td><td>custom order</td><td>Can be generated by the user or purchased with the amplification plates.</td></tr><tr><td>Random primer mix</td><td>New England Biolabs</td><td>S1330S</td><td></td></tr><tr><td>Standard 96-well plate</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>N8010560</td><td>This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used.</td></tr><tr><td>Amplification master mix (OpenArray master mix)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4462164</td><td></td></tr><tr><td>Clear adhesive seal</td><td>Thermo-Fisher</td><td>430611</td><td></td></tr><tr><td>Foil seal</td><td>Excel Scientific</td><td>AF-100</td><td></td></tr><tr><td>384-well plate</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4482221</td><td></td></tr><tr><td>Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4470813</td><td>Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Accessories kit</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4469576</td><td>Contains the case lids, plugs, and immersion fluid.</td></tr><tr><td>AccuFill tips</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4457246</td><td></td></tr><tr><td>Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4471090</td><td></td></tr><tr><td>Liquid handler (OpenArray AccuFill System)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4457243</td><td>This is purchased with the amplification machine.</td></tr><tr><td>Primer design software (Primer Express)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4363991</td><td>See manufacturer&#039;s instructions for detailed primer and probe specifications.</td></tr><tr><td>Image analysis program (ImageJ)</td><td>NIH</td><td></td><td>Available at http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Spreadsheet program (Excel)</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Available at https://products.office.com/en-us/excel</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo-Fisher/Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Tissue disruptor (TissueLyser II)</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Conventional thermal cycler (Veriti)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td>Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used.</td></tr><tr><td>PCR plate spinner</td><td>VWR</td><td>89184-608</td><td>This device has only one speed (2,500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed.</td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>Millipore</td><td>8890-100ML</td><td>10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0</td></tr></tbody></table>

high-throughput detection of respiratory pathogens in animal specimens by nanoscale pcr

ナノリットルスケールリアルタイムPCRは、複数のアッセイが一緒に反応を組み合わせた一般的な欠点がない単一のプレート上で並行して実行できるように空間多重化を使用します。私たちは、急速に急性呼吸器疾患でイヌやウマの一般的な疾患の薬剤の存在を同定するために、この原理に基づいてパネルを設計し、評価しました。この原稿は、マイクロリットルスケールの反応とは異なる手順に焦点を当て、サンプル調製、増幅、および標的病原体配列の分析のためのナノスケール診断PCRワークフローを記載しています。提示呼吸パネルでは、18アッセイは、各プレートあたり48サンプルまで収容、三重に設定しました。ユニバーサル抽出および増幅前のワークフローは、複数の行列及びDNAとRNAベースの病原体を収容するためにハイスループット試料調製のために最適化しました。代表的なデータを1つのRNAターゲット（インフルエンザマトリックス）と1つのDNA標的（ウマヘルペスウイルスのために提示されています1）。迅速かつ正確に病原体の包括的、シンドロームベースのグループをテストする能力は、診断テストの効率性と人間工学を改善するため、および急性呼吸器疾患の診断と管理のための貴重なツールです。

結果は、ポジティブコントロールルーチン診断試験のために提出臨床サンプルの組み合わせによる代表的なRNAアッセイ（インフルエンザマトリックス）とDNAアッセイ（EHV-1）のために、図1および図 2に示されています。この典型的な反応を通じて放出された蛍光シグナルは、1サイクル当たりの生の蛍光値をプロットし、図1に示されています。すべての相対サイクル閾値（Ct）値は、自動的に増幅マシンソフトウェアによって生成されました。バックグラウンド蛍光は、Ct値を計算する前に蛍光読み取りに組み込むのではなく、負荷品質の評価のための別個の測定基準として使用しました。 各ターゲットの検出（LOD）の分析限界は95％の検出レベルでのCt値の全体平均値プラスのコントロールのプールで2標準偏差に基づいて算出しました。すべてのターゲット。複製の少なくとも95％が代表的なアッセイのために陽性であった最高希釈は50コピーでした。 5コピーの検出は、複製の50％に成功しました。どちらのアッセイは、以下の1コピーで検出されました。 RNAおよびDNA分析のためのLODは、21.92と20.05のCt値で計算しました。これらの値は、疑わしい対として正の（潜在的にではない反復）の報告値のカットオフであると考えられました。 ターゲットの分析的性能の他の側面は、3つの異なる日（ 図2）で実行プール陽性対照の連続希釈を用いて評価しました。代表的なRNAとDNAのアッセイの平均効率は101.1パーセントと106.6パーセントでした。すべてのターゲットの全体の平均効率は101.3パーセントでした。アッセイはまた、良好な直線性（R 2&gt; 0.98）を有していました。複製中の変動はスルーホール一般的に、臨床サンプルについての0.2の標準偏差内でしたDコントロール。標的のいずれかとの間の交差反応性は観察されませんでした。 補足ファイル内の最終結果のワークシートは、10臨床診断サンプルおよび4を制御するための代表的な定量的な結果を示しています。臨床サンプルは日常鼻/口咽頭スワブ、肺組織、および糞便サンプルを含む試験した試料の種類のサブセットです。このセット内の1つ（馬）糞便サンプルは、サンプル中の阻害剤の存在を示して失敗したMS2内部統制を、示しています。これは、典型的に溶出された試料および/または再抽出の希釈によって管理されています。ここでそうであるように、負の増幅制御は、すべてのターゲットに対して否定的であるべきであり、負の抽出制御は、内部コントロールが含まれている必要があります。臨床セットでは、サンプルがbetacoronavirus、 気管支敗血症菌 、イヌジステンパーウイルスA、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌニューモ、およびインフルエンザのためのCt値を生成しA. <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54781/54781fig1.jpg" /> 図1増幅プロット。蛍光読み取りはRNAアッセイ（A）およびDNAアッセイ（B）用の増幅サイクルに対してプロットされています。三角形はCt値を表す示されている。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54781/54781figure2.jpg" /> 図2.標準曲線を3つの異なる日に試験したRNAおよびDNAアッセイの標準曲線は、ポジティブコントロールを使用して、増幅の直線範囲を示すためにプロットされています。 RNA（A）又はDNAのコピー数のサイクル閾値（Ct）値は対数に対してプロットされている（10）（ <strong&gt; B）標準。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/54781/54781table1.jpg" /> 増幅プレート及びターゲット位置の表1に概略図。このプラットフォーム上でナノスケールのリアルタイムPCR試験のために使用したプレートは、顕微鏡スライドのサイズであり、貫通孔64の48サブアレイに配置され、貫通孔3,072の合計個々の反応のために。一つのサブアレイは三連で18ターゲットに、ここに示されています。各試料は、液体ハンドラーずつサブアレイに添加されます。プレートは、表面張力を介して貫通孔内の試薬を保持するために親水性および疎水性化合物で被覆されています。ステンレス鋼チップは3,072マイクロ加工、320ミクロンdiameteの直線アレイを形成するために、「フォトリソグラフィパターン化およびウェットエッチングでありますrを次のようにターゲットのための33ナノリットルの穴それぞれ「2略語は次のとおりです。BCOR、イヌ呼吸器コロナウイルス（betacoronavirus）; BORD、 気管支敗血症菌 CAV、イヌアデノウイルス; CPIV、イヌパラインフルエンザウイルス; CPNV、イヌニューモ; DISTA / B、イヌを。ジステンパーウイルスA及びB; EADV1 / 2、ウマアデノウイルス1/2; EAV、ウマ動脈炎ウイルス; EHV1 / 4、ウマヘルペスウイルスタイプ1/4; ERVA / B、ウマ鼻炎ウイルスA / B; IVM、インフルエンザマトリックス; MCYNOS、 マイコプラズマカニクイザル 、MS2、内部統制（MS2 RNAファージ）; SEQU、 ストレプトコッカス・エクイ 。 <img alt="表2" src="/files/ftp_upload/54781/54781table2.jpg" /> 表2プレート伝達マップ 384ウェルプレートの96ウェルプリアンププレートから転送するために、固定の8チャンネルピペットを使用するための色分けされたプレート転送マップが示されています。あるいは、調節可能なピペットを使用してもよいです。同じ手順にかかわらず時間のたびに実行されます<html> OW多くのサンプルをプレートにあります。 <img alt="補足ファイル" src="/files/ftp_upload/54781/54781sup.jpg" /> 補足ファイル。サマリーテーブルに結果をフォーマットするための2つのマクロを含むマクロ有効スプレッドシートファイルは、（プロトコールに記載されているように）が設けられています。マクロによって生成される典型的な結果表は（最終結果の下の）ファイルに含まれています。 2のマクロは、（48サンプルまで）最初の列のサンプル名と肯定的な結果とのそれらのため、各ターゲットのための3つのCt値の平均を記入します。増幅しなかったターゲットがこの表に空白表示されていることに注意してください。これは、簡単に用紙1枚に印刷され、効率的に生データを確認するための基準として使用することができます。最終的な結果]タブでは、10の臨床サンプルおよび4のコントロールのための代表的な結果が示されています。アッセイ名の略語は、 表1の凡例に記載されています。jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

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High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

ナノスケールPCRによってDNA及びRNAベースの病原体のハイスループット試験は、症候性イヌおよびウマの呼吸PCRパネルを用いて説明します。

ナノスケールPCRによる動物標本における呼吸器病原体のハイスループット検出

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

high-throughput-detection-respiratory-pathogens-animal-specimens

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K ビュー.  Cornell University Animal Health Diagnostic Center. ナノスケールPCRによってDNA及びRNAベースの病原体のハイスループット試験は、症候性イヌおよびウマの呼吸PCRパネルを用いて説明します。 

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High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

免疫・感染学

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Fast and effective diagnostics play an important role in controlling infectious disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we present an integrated microfluidic thermoplastic chip with the ability to amplify influenza A virus in patient nasopharyngeal (NP) swabs and aspirates. Upon loading the patient sample, the microfluidic device sequentially carries out on-chip cell lysis, RNA purification and concentration steps within the solid phase extraction (SPE), reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR) in RT-PCR chambers, respectively. End-point detection is performed using an off-chip Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). For peripherals, we used a single syringe pump to drive reagent and samples, while two thin film heaters were used as the heat sources for the RT and PCR chambers. The chip is designed to be single layer and suitable for high throughput manufacturing to reduce the fabrication time and cost. The microfluidic chip provides a platform to analyze a wide variety of virus and bacteria, limited only by changes in reagent design needed to detect new pathogens of interest.

An integrated microfluidic thermoplastic chip has been developed for use as a molecular diagnostic. The chip performs nucleic acid extraction, reverse transcriptase, and PCR. Methods for fabricating and running the chip are described.

マイクロ流体チップの作製とインフルエンザを検出する方法

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

生物工学

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly sensitive. This protocol obtains precise measurements of gene expression from single worms or from bulk samples. The protocol presented here provides a novel adaptation of existing methods for complementary DNA (cDNA) preparation coupled to a nanofluidic RT-qPCR platform. The first part of this protocol, named &#8216;Worm-to-CT&#8217;, allows cDNA production directly from nematodes without the need for prior mRNA isolation. It increases experimental throughput by allowing the preparation of cDNA from 96 worms in 3.5 h. The second part of the protocol uses existing nanofluidic technology to run high-throughput RT-qPCR on the cDNA. This paper evaluates two different nanofluidic chips: the first runs 96 samples and 96 targets, resulting in 9,216 reactions in approximately 1.5 days of benchwork. The second chip type consists of six 12 x 12 arrays, resulting in 864 reactions. Here, the Worm-to-CT method is demonstrated by quantifying mRNA levels of genes encoding heat shock proteins from single worms and from bulk samples. Provided is an extensive list of primers designed to amplify processed RNA for the majority of coding genes within the C. elegans genome.

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

In this article a high-throughput protocol for fast and reliable determination of gene expression levels in single or bulk C. elegans samples is described. This protocol does not require RNA isolation and produces cDNA directly from samples. It can be used together with high-throughput multiplexed nanofluidic real-time qPCR platforms.

ナノ流体技術を用いた単一およびバルク C.エレガンス サンプルにおける高スループット定量RT-PCR

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...

遺伝学

High-Performance Graphene-Modified Sensing Chip for SARS-CoV-2 Detection

This sensing prototype model involves the development of a reusable, twofold graphene oxide (GrO)-glazed double inter-digitated capacitive (DIDC) detecting chip for detecting severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 virus (SARS-CoV-2) specifically and rapidly. The fabricated DIDC comprises a Ti/Pt-containing glass substrate glazed with graphene oxide (GrO), which is further chemically modified with EDC-NHS to immobilize antibodies (Abs) hostile to SARS-CoV-2 based on the spike (S1) protein of the virus. The results of insightful investigations showed that GrO gave an ideal engineered surface for Ab immobilization and enhanced the capacitance to allow higher sensitivity and low sensing limits. These tunable elements helped accomplish a wide sensing range (1.0 mg/mL to 1.0 fg/mL), a minimum sensing limit of 1 fg/mL, high responsiveness and good linearity of 18.56 nF/g, and a fast reaction time of 3 s. Besides, in terms of developing financially viable point-of-care (POC) testing frameworks, the reusability of the GrO-DIDC biochip in this study is good. Significantly, the biochip is specific against blood-borne antigens and is stable for up to 10 days at 5 &#176;C. Due to its compactness, this scaled-down biosensor has the potential for POC diagnostics of COVID-19 infection. This system can also detect other severe viral diseases, although an approval step utilizing other virus examples is under development.

The present protocol describes the fabrication of low-cost biosensing prototypes based on useful nanosystems for accurately detecting viral proteins (at the Fg level). Such a tiny sensor platform allows for point-of-care applications that can be integrated with the Internet of Medical Things (IoMT) to meet telemedicine objectives.

This sensing prototype model involves the development of a reusable, twofold graphene oxide (GrO)-glazed double inter-digitated capacitive (DIDC) ...

Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by a high rate of transmission and low mortality, the COVID-19 pandemic necessitated accurate and efficient diagnostic testing, particularly in closed populations such as residential universities. Initial availability of nucleic acid testing, like nasopharyngeal swabs, was limited due to supply chain pressure which also delayed reporting of test results. Saliva-based reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) testing has shown to be comparable in sensitivity and specificity to other testing methods, and saliva collection is less physically invasive to participants. Consequently, we developed a multiplex RT-qPCR diagnostic assay for population surveillance of Clemson University and the surrounding community. The assay utilized open-source liquid handling robots and thermocyclers instead of complex clinical automation systems to optimize workflow and system flexibility. Automation of saliva-based RT-qPCR enables rapid and accurate detection of a wide range of viral RNA concentrations for both large- and small-scale testing demands. The average turnaround for the automated system was &#60; 9 h for 95% of samples and &#60; 24 h for 99% of samples. The cost for a single test was $2.80 when all reagents were purchased in bulk quantities.

The protocol describes a SARS-CoV-2 diagnostic method that utilizes open-source automation to perform RT-qPCR molecular testing of saliva samples. This scalable approach can be applied to clinical public health surveillance as well as to increase the capacity of smaller university laboratories.

オープンソースピペッティングロボットを活用した効率的なSARS-CoV-2定量逆転写酵素PCR唾液診断戦略

The emergence of the recent SARS-CoV-2 global health crisis introduced key challenges for epidemiological research and clinical testing. Characterized by ...

等温増幅法を用いたヒト呼吸器細菌感染症診断

Rapid Detection of Bacterial Pathogens Causing Lower Respiratory Tract Infections via Microfluidic-Chip-Based Loop-Mediated Isothermal Amplification

Respiratory tract infections (RTIs) are among the most common problems in clinical settings. Rapid and accurate identification of bacterial pathogens will provide practical guidelines for managing and treating RTIs. This study describes a method for rapidly detecting bacterial pathogens that cause respiratory tract infections via multi-channel loop-mediated isothermal amplification (LAMP). LAMP is a sensitive and specific diagnostic tool that rapidly detects bacterial nucleic acids with high accuracy and reliability. The proposed method offers a significant advantage over traditional bacterial culturing methods, which are time-consuming and often require greater sensitivity for detecting low levels of bacterial nucleic acids. This article presents representative results of K. pneumoniae infection and its multiple co-infections using LAMP to detect samples (sputum, bronchial lavage fluid, and alveolar lavage fluid) from the lower respiratory tract. In summary, the multi-channel LAMP method provides a rapid and efficient means of identifying single and multiple bacterial pathogens in clinical samples, which can help prevent the spread of bacterial pathogens and aid in the appropriate treatment of RTIs.

著者スポットライト:マイクロ流体チップを使用した呼吸器病原体の迅速な検出の進歩 

Various bacterial pathogens can cause respiratory tract infections and lead to serious health issues if not detected accurately and treated promptly. Rapid and accurate detection of these pathogens via&#160;loop-mediated isothermal amplification provides effective management and control of respiratory tract infections in clinical settings.

マイクロ流体チップベースのループ媒介等温増幅による下気道感染症を引き起こす細菌性病原体の迅速な検出

Respiratory tract infections (RTIs) are among the most common problems in clinical settings. Rapid and accurate identification of bacterial pathogens will ...

Rapid and Specific Detection of Acinetobacter baumannii Infections Using a Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a-based System

Acinetobacter baumannii, a gram-negative bacterium, is notorious for causing severe infections with high mortality rates. Rapid and accurate detection of A. baumannii is crucial for prompt treatment, effective infection control, and curbing antibiotic resistance. However, there is no suitable method for rapid and easy on-site detection of A. baumannii. The DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter (DETECTR) system offers a rapid, precise, and sensitive approach to A. baumannii detection by integrating the target-specific recognition capabilities of Cas12a with the isothermal amplification efficiency of Recombinase Polymerase Amplification (RPA). This protocol details the detection of A. baumannii using RPA combined with LbaCas12a endonuclease. The following steps are described in this article: extraction of DNA, selection of a specific DNA sequence, design of primer and CRISPR RNA (crRNA), construction of positive recombinant plasmid, setup of Cas12a-RPA assay, optimization of the RPA amplification system, visualization of the RPA-CRISPR/Cas12a assay using a fluorescence detection tool such as a real-time PCR instrument, and evaluation of sensitivity and specificity evaluation.

To facilitate the rapid and precise detection of Acinetobacter baumannii, we present a protocol that employs Recombinase Polymerase Amplification (RPA) in conjunction with LbaCas12a endonuclease for identifying A. baumannii infections.

Acinetobacter baumannii, a gram-negative bacterium, is notorious for causing severe infections with high mortality rates. Rapid and accurate detection of ...

低所得国における狂犬病制御のためのナノポアベースのゲノムアプローチ

Whole Genome Sequencing for Rapid Characterization of Rabies Virus Using Nanopore Technology

Genomic data can be used to track the transmission and geographic spread of infectious diseases. However, the sequencing capacity required for genomic surveillance remains limited in many low- and middle-income countries (LMICs), where dog-mediated rabies and/or rabies transmitted by wildlife such as vampire bats pose major public health and economic concerns. We present here a rapid and affordable sample-to-sequence-to-interpretation workflow using nanopore technology. Protocols for sample collection and the diagnosis of rabies are briefly described, followed by details of the optimized whole genome sequencing workflow, including primer design and optimization for multiplex polymerase chain reaction (PCR), a modified, low-cost sequencing library preparation, sequencing with live and offline base calling, genetic lineage designation, and phylogenetic analysis. Implementation of the workflow is demonstrated, and critical steps are highlighted for local deployment, such as pipeline validation, primer optimization, inclusion of negative controls, and the use of publicly available data and genomic tools (GLUE, MADDOG) for classification and placement within regional and global phylogenies. The turnaround time for the workflow is 2-3 days, and the cost ranges from $25 per sample for a 96 sample run to $80 per sample for a 12 sample run. We conclude that setting up rabies virus genomic surveillance in LMICs is feasible and can support progress toward the global goal of zero dog-mediated human rabies deaths by 2030, as well as enhanced monitoring of wildlife rabies spread. Moreover, the platform can be adapted for other pathogens, helping to build a versatile genomic capacity that contributes to epidemic and pandemic preparedness.

著者スポットライト:リソースが限られている環境で狂犬病制御を進めるための費用対効果の高いゲノムワークフロー 

Here, we present a rapid and cost-effective workflow for characterizing rabies virus (RABV) genomes using nanopore technology. The workflow is intended to support genomics-informed surveillance at a local level, providing information on circulating RABV lineages and their placement within regional phylogenies to guide rabies control measures.

ナノポア技術を用いた狂犬病ウイルスの迅速な特性評価のための全ゲノムシーケンシング

Genomic data can be used to track the transmission and geographic spread of infectious diseases. However, the sequencing capacity required for genomic ...

ナノスケールPCRによる動物標本における呼吸器病原体のハイスループット検出

要約

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インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

マイクロ流体チップの作製とインフルエンザを検出する方法

ナノ流体技術を用いた単一およびバルク C.エレガンスサンプルにおける高スループット定量RT-PCR

High-Performance Graphene-Modified Sensing Chip for SARS-CoV-2 Detection

オープンソースピペッティングロボットを活用した効率的なSARS-CoV-2定量逆転写酵素PCR唾液診断戦略

マイクロ流体チップベースのループ媒介等温増幅による下気道感染症を引き起こす細菌性病原体の迅速な検出

マイクロ流体チップベースのループ媒介等温増幅による下気道感染症を引き起こす細菌性病原体の迅速な検出

マイクロ流体チップベースのループ媒介等温増幅による下気道感染症を引き起こす細菌性病原体の迅速な検出

Rapid and Specific Detection of Acinetobacter baumannii Infections Using a Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a-based System

ナノポア技術を用いた狂犬病ウイルスの迅速な特性評価のための全ゲノムシーケンシング

ナノスケールPCRによる動物標本における呼吸器病原体のハイスループット検出

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マイクロ流体チップの作製とインフルエンザを検出する方法

ナノ流体技術を用いた単一およびバルク C.エレガンス サンプルにおける高スループット定量RT-PCR

High-Performance Graphene-Modified Sensing Chip for SARS-CoV-2 Detection

オープンソースピペッティングロボットを活用した効率的なSARS-CoV-2定量逆転写酵素PCR唾液診断戦略

マイクロ流体チップベースのループ媒介等温増幅による下気道感染症を引き起こす細菌性病原体の迅速な検出

マイクロ流体チップベースのループ媒介等温増幅による下気道感染症を引き起こす細菌性病原体の迅速な検出

マイクロ流体チップベースのループ媒介等温増幅による下気道感染症を引き起こす細菌性病原体の迅速な検出

Rapid and Specific Detection of Acinetobacter baumannii Infections Using a Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a-based System

ナノポア技術を用いた狂犬病ウイルスの迅速な特性評価のための全ゲノムシーケンシング

ナノ流体技術を用いた単一およびバルク C.エレガンスサンプルにおける高スループット定量RT-PCR