Name: spin saturation transfer difference nmr (sstd nmr): a new tool to obtain kinetic parameters of chemical exchange processes
Uploaded: 2016-11-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spin Saturation Transfer Difference NMR SSTD NMR: A New Tool to Obtain Kinetic Parameters of Chemical Exchange Processes at JoVE.com

Funding by the University of East Anglia, the EPSRC (EP/L012855/1) and the EU (H2020-MSCA-IF-2014-EF-ST-658172) is gratefully acknowledged (MTQ).

注意：使用する前に、関連するすべての物質安全データシート（MSDS）を参照してください。 1. NMR試料の調製<ol><li> N、N-ジメチルアセトアミド5mgを秤量し、低温のための適切なNMRチューブに追加し、トルエンさd 8の0.6ミリリットルに溶解します。 </li></ol> 2. NMR実験のセットアップ25 <ol><li> NOEスペクトルの取得<ol><li> 1次元NOE（核オーバーハウザー効果）実験を実行します。26 注：NOE効果は任意の温度で起こることができます。 SSTD NMR実験で照射される信号を照射する1次元NOEスペクトルは、ここで使用したサンプル中の回転と磁化移動が最小化されたことを確認するために、-40℃で記録したところ、したがってNOE、存在しない場合、優勢になると、この実験で測定すること。理想的には、2つの間のNOE効果は核shoulを交換しますSSTD法との干渉を避けるために存在していないdは。 </li></ol></li><li> SSTD NMR実験のセットアップ<ol><li>空気の流れをオンにするソフトウェアのコマンドラインの最初のタイピングEJによって磁石のサンプルを挿入します。そして、磁石の上にサンプルを入れ、ijを入力します。サンプルは、磁石の内側にあるまで待ちます。 </li><li>サンプルたら、磁石にコマンドラインで型EDTEです。実験（この場合は295.5 K）を実行するために最初に選択された温度まで温度を変更します。サンプルを少なくとも20分間、選択された温度で安定してみましょう。 </li><li>サンプル上の1D 1 H-NMR実験を実行します。 <ol><li> 1 H-NMR実験の新しいデータセットを作成します。このためにFILE / NEWをクリックして新規の実験に名前を付けます。 </li><li>順次入力し、仕上げに前のコマンドを待っている： ロック 、 アートマ 、topshim、getprosolとRGA。 </li><li>タイプ&lt;em&gt;のプロトン実験を取得するZG。それはフーリエ変換型EFPとAPKを終了したら、それを変換し、位相を調整。 </li></ol></li><li> 1 H NMR実験、例えば、新しいデータセットを作成します。このためにFILE / NEWをクリックして新規の実験に名前を付けます。 </li><li>この新しいデータセットでは、コマンドラインでRPARと入力します。例えばSTDDIFFESGPのために、リストから「STDDIFF」パラメータセットのいずれかを選択し、「読み」、次に（ 図1）「すべてを読み込む」をクリックします。また、 すべてのRPAR STDDIFFESGPを入力してこれを行います。 注記：この実験は、このパルスシーケンスを用いて行うことができます。しかし、我々の実験で使用されるパルスプログラムがSTDDIFFました。 </li><li> STDDIFFパルスシーケンスを選択するには、PULPROGラインの3つのドット（ 図2、図 3）でボタンをクリックします。 </li><li> SSTD NMR実験を行う前に、1 H 90°ハードPULSをキャリブレーションE（P1）。この目的のために、サンプルを所望の温度（ステップ2.2.2）で、磁石であることを確認してください。コマンドラインで入力しpulsecalと高い電力（PL1 = -1デシベルこの場合）、 すなわち、最短パルス（ 図4）を与える1で90°パルスの値をコピーします。 </li><li>実験で校正ハードパルスの値を導入します。タイプgetprosol 1H（ステップ2.2.7で得られたP1の値）（PL1の値）（ 図5）。 </li><li>整形されたパルスの長さを設定します。タイプP13と50,000マイクロ秒（ 図6）の値を紹介します。 </li><li>選択パルス形状を設定します。これを行うには、電源に移動して（ 図7）を成形するために、次の「編集...」ボタンをクリックします。整形パルス13に移動し、選択します。GAUS 1.1000（ 図8）。 </li><li>選択パルス電力（SP13）を設定します。適切な何かにそれを設定し、 すなわち </em&gt; 40〜60 dBのこのシステム上で（ 図8）（約120ヘルツの電界強度に対応します）。過度の電界強度が許容できない飽和効果につながることができます。27-29 注：50デシベルは、我々の場合には最適でした。これは減衰スケールなので、小さい方の値が高い高周波のパワーであることを考慮してください。それは長い時間（数秒）に適用される飽和ガウスカスケードに対応するように、SP13は、（必要であれば、のような高電力で長パルスがプローブヘッドを損傷する恐れがあり、機器の仕様を参照してください）40デシベル以下に行くべきではありません。私たちの経験41から61で（この作業で-1デシベル）ハード1 H 90°パルスの減衰上記デシベルが正常に動作します。常に同様の飽和レベルにつながる可能な限り最高の減衰を選択してみてください。 </li><li> ナノ秒を入力し、8に設定し、DSを入力し、4に設定します。 </li></ol></li></ol> 3. NMRデータ集録ANd処理25 <ol><li> SSTD NMR実験獲得<ol><li>照射される信号がどこにあるか確認するために、ステップ2.2.3で行わ1 H NMR実験を開きます。このため、ソフトウェアのブラウザで実験を検索し、右データセット内をクリックし、「新しいウィンドウで表示」をクリックします。 </li><li> ppmでの化学シフトを照射し、書き留めて信号の中心にカーソル線を移動します。実験に使用されるスペクトル幅を選択します。 注：この場合、照射された信号は2.17 ppmになり、使用するスペクトル幅は1.46 ppmでした。何の化学シフト補正が使用されていないか、照射回数が誤って設定することができることを確認してください。 </li><li> 2.2節で述べたセットアップを使用して、以前に作成したSSTD NMR実験に移動します。 </li><li>照射の周波数のリストを作成します。このため、コマンドラインでfq2list入力し、既存のリストを選択します。 </li><li>リストを編集3最初の行（ 図9）で、次のデータを含む照射周波数の： 行1、Pは、（以下のデータはppmであることを示す）; 行2 3.1で測定して、ppmで照射される信号の周波数を。 1;行3.40 ppmの （遠いその周波数での照射がスペクトルに影響を与えないように、化合物の1 H信号からある周波数）。 </li><li>新しい名前でリストを保存し、コマンドラインでfq2list入力し、先ほど作成したリストを選択します。 </li><li> 、検討中の信号について実験を中心型o1pと実験の中心として照射される信号の化学シフトを選択します。 </li><li>スペクトル幅を選択するタイプのSW（この場合は1.46 ppmのが、他のスペクトル幅を選択することができます）。 注：スペクトル幅を変更した後に得られた収集時間が長すぎる場合（スペクトルにおけるより多くのノイズを導入します）それは、CAnは希望する自由誘導減衰（FID）解像度（FIDRES、この場合は0.25 Hz）を提供するために、AQを入力して調整すること。 </li><li>インタースキャン緩和遅延D1の値を選択してください。それはT最も遅いリラックスの1の少なくとも1から5倍の値であることを確認してください プロトン。 注：我々は、実験の中で最も長い飽和時間（D20）で40秒、それを設定します。このように、すべての実験は、「スキャンごとに &quot;同じ合計時間（遅延+飽和時間+パルス+取得時間）を維持します。 </li><li> D1を入力し、40秒に設定します。 </li><li> D20を入力し、40秒に設定することで飽和時間の最初の値を設定します。 RGAを入力して、自動的に受信機の利得（RG）を決定します 。 </li><li> iexpno入力して、次の実験を作成します。 D20を入力し、この実験では20秒の飽和時間を選択します。自動的にRGを決定するためにRGAを入力します。 </li> &lt;李は&gt; D20 = 10、5、2.5、1.25、0.625、0.3秒のための最後のステップを繰り返します。 </li><li>すべての実験が作成されると、最初の1を開き、コマンドライン型multizgで（ すなわち 、multizg 8）この場合の実験の数、8を指定します。 </li></ol></li><li> SSTD NMR実験処理<ol><li>セットのEXPNO 1からPROCNO 1（プロセス番号）（実験番号）（高い飽和時間との1）を開きます。 </li><li>コマンドライン型ポンドで1.5に値を設定します。 注意：非常に高い信号対雑音比を有するスペクトルの場合、この値を小さくすることができます。スペクトル分解能は厳しく影響されない場合逆に、それは、ノイズの多い実験のために増加させることができました。 </li><li> PROCNO = 2（ 図10）で、コマンドライン型EFPとプロセスFID番号= 1（「オンレゾナンス」スペクトル）で。 </li><li> インタラクティブ位相補正bをクリックすることで、実験の位相を修正uttonは、2D実験として保存します。保存して終了（ 図11）。 </li><li> PROCNO 1に移動するためのコマンドラインを入力担当者1。 </li><li> PROCNO = 3（ 図12）で、コマンドライン型EFPとプロセスFID番号= 2（「オフレゾナンス」スペクトル）で。 </li><li>コマンドライン型.mdで、その後の両方に処理スペクトルを有する複数の表示ウィンドウを表示する担当者2：2（中央飽和の信号と1）と3（飽和パルス列が40 ppmに適用した1 ）（ 図13）。 </li><li>差スペクトルを計算し、PROCNO 4.終了し、複数の表示窓にそれを保存するために、デルタ記号（ 図13）でボタンをクリックします。 </li><li>左（による化学交換プロセスに彩度の移動が観察された信号）の信号の積分範囲を選択します。常にPROCNO 3とPROCNO 4に同じ領域を統合します。 <br/&gt;注： - 2.67 ppmで、この実験で用いた積分範囲は2.55でした。 </li><li>統合後は、実験のそれぞれに「積分」タブに移動し、「インテグラ[ABS]」（ 図14）の値をコピーします。 </li><li> 40秒（ηSSTD =スピン飽和移動差パラメータ）の飽和時間のためのηSSTDの値であることPROCNO 3の積分でPROCNO 4で積分を分割します。21 </li><li>異なる飽和時間と実験の残りの手順を繰り返します。 </li></ol></li></ol> 4.データ解析30 <ol><li>データの分析は、動態パラメータを取得します<ol><li>飽和時間対得ηSSTD値をプロットします。21 </li><li>式に得られた曲線を調整するために、指数フィットを実行 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq1.jpg" /> <img aLT = &quot;数2&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 54499 / 54499eq2.jpg&quot; /&gt; <img alt="式3" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq3.jpg" /> = <img alt="式4" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq4.jpg" />非常に長い飽和時 トン=時間</li><li> ηSSTD MAXの値を計算し、δと以下の式に従って速度定数（k）と緩和時間（Tの1A）の値を計算するためにそれらを使用します： <img alt="式（5）" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq5.jpg" /> スピンAのT 1A =縦緩和時間定数 K =相互サイト為替反応速度定数<ol><li>により一定の運動速度を取得します。 <img alt="式6" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq6.jpg" /></li></ol></li></ol></li><li>熱力学パラメータを取得するためにアイリングプロット<ol><li>プロットLN 1 / T対（K / T）（T =絶対温度）、雌牛の値を用い<html>異なる温度でチック率。 </li><li>アイリング式に得られたデータを調整するための線形フィットを実行します。 <img alt="式（7）" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq7.jpg" /> <img alt="式8" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq8.jpg" /> <img alt="式9" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq9.jpg" /> <img alt="式10" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq10.jpg" /> R =気体定数 k個のB =ボルツマン定数 T =絶対温度</li><li> ≠ΔH熱力学的パラメータを計算≠とΔS。 </li><li>以下の式を用いて、E A（298）とΔG≠（298）の値を計算します。 <img alt="式11" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq11.jpg" /> <img alt="式12" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq12.jpg" /> S / ftp_upload / 54499 / 54499eq13.jpg &quot;/&gt; <img alt="式14" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq14.jpg" /> </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

One of the more obvious advantages of this methodology is that the rate constants and the relaxation time for a given temperature can be obtained with a single set of experiments, with a robust pulse sequence (the same used for STD experiments to study protein-ligand interactions, which is typically found within the available set of experiments from the spectrometer manufacturer). This simplifies the experimental setup since there is no need to measure T1 or reach steady state saturation. Besides, it is remarkable that this method does not depend on the magnet strength, as coalescence methods. On the other hand, the main limitation is that this technique cannot be applied to chemical exchange processes too fast or too slow, which would depend on the temperature range of the NMR machine or the solvents used.
This new technique for the calculation of kinetic parameters can be applied to a great variety of substrates and its applicability has already been demonstrated with some interesting molecules.21 The kinetic parameters of the 4-N,N-dimethylamido[2.2]paracyclophane, a challenging substrate in which the signal of one of the methyl groups of interest is overlapped with other signals from the molecule, were successfully calculated using SSTD NMR. Interestingly, this methodology can be applied as long as one of the signals of study is isolated. SSTD NMR is also a useful protocol for the calculation of kinetic parameters in molecules in which the coalescence temperature is so high that the molecule decomposes before reaching it. This is the case with PtCl2(dimethylallene)(pyridine), in which the methodology was successfully applied without the need of reaching coalescence. The choice of solvents and temperatures is critical to obtain good results, since the chemical exchange rates can vary significantly with these parameters. Moreover, in addition to the criteria in a normal NMR experiment, key steps in a SSTD NMR experiment are the selectivity of the irradiation as well as the temperature control. Both factors have to be precise to guarantee the success of the experiment.
The representative results presented here are for the kinetics of intramolecular chemical exchange, but the technique can also be applied to study the kinetics of intermolecular chemical exchange and also ligand exchange, common processes in the dynamic behavior of transition metal complexes. 
Finally, providing a proper modification of the equations is made,32 this method could be extended to deal with multi-site exchange and unequal populations, as it has been done in former double resonance experiments,8-9 increasing the usefulness of this technique for the study of chemical exchange processes in challenging compounds.

化学交換は、一般的に、核がNMRパラメータ（化学シフト、スカラーカップリング、双極子カップリング、緩和速度）が異なっている別の環境から移動する任意の分子間または分子内のプロセスを指します。多数の有機および有機金属分子で化学交換の例（ビアリールで例えば、回転障壁、リングの障壁と立体配座平衡をひっくり返す、窒素反転、リガンド結合、縮退した配位子交換及び互変異性）があります。1-3化学交換レートが関連するに交換プロセスの障壁の熱力学ため、その研究は、これらの系の分子動力学を理解するために決定的に重要です。 NMRでの動的交換の古典的な兆候は、温度変化などのNMR信号のライン形状の劇的な変化です。低い温度では、プロセスは遅く、二つの異なる化学シフトobserありますVED。高い温度では、2つの信号は、「合体」として知られている一つの信号、合流します。中間温度では、信号が非常に広いとなります。化学交換にNMRスペクトルのこの感度は、NMR溶液中の分子のダイナミクスを研究するための非常に強力な方法になります。二つの方法は、主に、溶液中の動的プロセスの研究に用いられてきた：4-7、ライン状の分析をし、スピン飽和移動実験8-9のほかに、それはまた、反転転送方法10とのためのCIFITプログラム11を言及する価値があります単純なシステムでの交換測定のための比較的効率的なアプローチである速度定数の直接抽出。これらの方法は、ほとんどの場合、非常に良好な結果を与えるが、それらは、しかしながら、多くの欠点を有しています。線状分析の主な欠点は、いくつかのサンプルで合体に到達するのに必要な高温である。12 CA考慮すべき主な問題アウトrryingスピン飽和移動実験は、次のとおり交換部位の間の定常状態の飽和移動に到達するために必要な非常に長い飽和時間、困難であることができる一定の縦緩和時間T 1を決定する必要性が、異なるの重なりがある場合に研究の領域における信号。13 有機金属機構における我々の調査の一環として、14-16私たちのグループは、溶液中の白金-アレン錯体の流動挙動を検討しています。これは、少なくとも3つの異なるプロセス、アレン軸の1の周りに金属のπ-顔交換又は回転され、それらのいずれかを含む複雑な作業です。私たちは、の合一温度を作った私たちの白金-アレン錯体中の非常に遅い回転に起因し、17-19は、私たちの研究に適していなかった、通常のVT実験と同様のシステムで以前に使用されてきたライン状の解析技術ことを検出しましたSIG錯体の分解温度よりも高い興味のあるのNAL。 この制限を克服するために、我々が開発し、最近相互サイトの化学交換の過程を研究するための新しいNMRプロトコル（SSTD NMR）を報告した。20名がこの方法を用いて、小分子のために使用されるスピン飽和移動方法を組み合わせ通り飽和移動差NMR法は、化学交換を受けている小分子で飽和時間（ビルドアップ曲線）を増加させるに沿って過渡スピン飽和移動を測定することによって、タンパク質-リガンド相互作用の研究、21-24のために使用します。 この新しい方法（SSTD NMR）で私たちは、伝統的なアプローチを超えるいくつかの追加の利点を持つ小さな有機および有機金属分子における分子内化学交換の動力学的パラメーターを得ることができることを示している：信号の合体が必要とされていないので、より柔軟な温度範囲をに使える研究では、交換共振の少なくとも一つは分離する必要がありますが、信号のオーバーラップは、干渉しません。 T 1を測定したり、定常状態の飽和に到達する必要はありません。速度定数の値は、直接測定され、T 1の値は、実験の唯一のセットを使用して、同じ実験で得られます。 SSTD NMR方法の別の顕著な利点は、分析を線形とは対照的に、動力学的速度定数の決意を高磁場に関連付けられた凝集温度の上昇によって制限されない、ということです。したがって、私たちの方法論は、その後、非常によく、低および高磁場の両方のために充当されます。この記事は、新しいユーザーが化学交換を受けて自分のシステムにこの新しい方法を適用して、試料調製、実験のセットアップ、データ収集、および単純な有機分子におけるデータ処理および分析の例を説明するためのものです。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-dimethylacetamide</td><td>Aldrich</td><td>38840</td><td>Acute toxicity</td></tr><tr><td>Toluene-&lt;em&gt;d&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;&lt;/em&gt;</td><td>Fluorochem</td><td>D-005</td><td>Flammable and toxic</td></tr><tr><td>500 MHz 7&quot; Select Series NMR Tubes</td><td>GPE LTD</td><td>S-5-500-7</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 2.1</td><td>TopSpin program, Bruker Corp., http://www.bruker.com/products/mr/nmr/nmr-software/software/topspin/ (2015).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin 6.0</td><td>Origin 6.0 software, OriginLab Corp., http://originlab.com.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 500 MHz fitted with 5 mm broadband observed BBFOplus Z-gradient SmartProbeTM probe</td><td>&amp;nbsp;Bruker Corp., http://www.bruker.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance I 500 MHz Inverse Triple Resonance NMR spectrometer fitted with a 5 mm TXI Z-gradient probe</td><td>&amp;nbsp;Bruker Corp., http://www.bruker.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ceramic Spinner standardbore shimsystems (5 mm)</td><td>&amp;nbsp;Bruker Corp., http://www.bruker.com</td><td>H00804</td><td></td></tr></tbody></table>

spin saturation transfer difference nmr (sstd nmr): a new tool to obtain kinetic parameters of chemical exchange processes

この詳細なプロトコールは、最近、従来の方法によって分析することが困難な相互サイトの化学交換の過程を研究するために、当社グループで開発された新しいスピン飽和移動差核磁気共鳴プロトコル（SSTD NMR）を、説明します。名前が示すように、この方法では、ビルド（飽和時間を増加さに沿って過渡スピン飽和移動を測定することにより、飽和移動差タンパク質 - リガンド相互作用の研究のために用いられる（STD）NMR法を用いて、小分子のために使用されるスピン飽和移動方法を組み合わせ化学交換を受けて、小さな有機および有機金属分子で-up曲線）。 既存のものの上に、この方法の利点は次のとおりです。交換信号の合体に到達する必要はありません。この方法であれば交換部位の一方の信号が分離されているように適用することができます。 T 1を測定したり、定常状態の飽和に到達する必要はありません。速度定数v梅毒は、直接測定され、T 1の値は、実験の唯一のセットを使用して、同じ実験で得られます。 メソッドをテストするために、我々は多くのデータを比較するために提供されているN、N個の -dimethylamidesの束縛回転のダイナミクスを研究しています。 SSTDを用いて得られた熱力学的パラメーターは、報告されたもの（スピン飽和移動技術及び線状分析）と非常に類似しています。この方法は、従来の方法によって研究することができない多くの困難な基材に適用することができます。 私たちは、簡単な実験を設定することを想定し、基板の多種多様にする方法の広い適用は、このNMRにおける豊富な専門知識のない有機および有機金属化学者の間で一般的な技術になります。

SSTD NMR技術は、N、N-ジメチルアセトアミドのアミド結合の回転における動態パラメータの計算のために適用した。21これは比較のために大規模なデータが文献に見出すことができるための単純な例である。31 アミド結合の周りの束縛回転、共振による形の部分の二重結合文字に、1 H-NMRスペクトル（2.61と22.5℃で2.17 ppm以下）で2つの信号に両方のメチル基を区別します。 2.17 ppmの（ME B）におけるメチル基のシグナルのスピン飽和は、1 H NMRでのシグナルの消失をもたらします。ミーB、他のメチル基（ME A）の飽和移動の飽和時に、内部回転処理に2.61 ppmのシグナルの1 Hの強度の減少によって観察することができます。 magnituデこの減少は、飽和時間に依存する。 図15は、Nの1 H NMRスペクトルは、22.5℃でのNジメチルアセトアミドを示し、拡張（a）はせずメチルの（b）は、飽和でスペクトルを示します2.17 ppmの基、ならびにηのSSTDの値を計算するために使用される差スペクトル（C）。 ηのSSTD係数は（A）は、のように、プロトコルで説明したスペクトルで私Aの積分値によってSSTD NMRスペクトル（C）の私の積分値を除算計算されます。異なる温度でそれぞれ飽和時間のためのηSSTDの得られた値を表1にまとめられている。飽和時間対ηSSTDの得られた値のプロットは、高原が高い飽和時間で到達した指数関数曲線を与えました。一定の温度については、曲線の指数関数的な適合は、速度の計算を可能に定数（k）と測定された信号（T 1A）（ 図16）の1 Hの緩和時間。フィットで得られたkおよびT 1A値とともに図17に示す全ての得られた曲線を図 。 最後に、1 / Tに対するlnのプロット（K / T）及びアイリングの方程式に当てはめた （ 図18）は、活性化のエンタルピーおよびエントロピーを計算するために使用しました。決定起動パラメータが一緒に異なる方法を使用して計算し、以前に報告されたパラメータを用いて、 表2に示します。 表2に見られるように、活性化パラメータの値は、スピン飽和移動差法（SSTD NMR）を用いて得られたデータとよく一致している、以前にそのようなSST NMR又は他の技術を使用して報告線形状解析。 ΔS‡のために報告された値の広い範囲が原因でNMR技術を使用してこのパラメータの測定の難しさにある。活性化パラメータの残りの部分については31、私たちの方法で得られた値だけではなく、既に報告されたものには本当に似ていますしかし、より正確な、私たちの誤差（SD）は、すべての場合に小さいからです。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig1.jpg" /> 図 1：RPARを 入力した後、実験のリスト 。図は、STDDIFFESGPが選択されるべきであるその中の異なるパラメータセットを示している。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig2.jpg" /><br/&gt; 図2：取得パラメータボタンが赤い四角異なるパルスプログラムのリストにつながるで強調表示。。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig3.jpg" /> 図3： パルスプログラムの一覧図は実験（STDDIFF）で選択されたパルスプログラムを示し<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig3large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig4.jpg" /> 図4：ポップアップウィンドウが90°パルスのキャリブレーション後に出現した図は、較正された90の値を示しています。<html> ＃176;異なる電力レベルでのパルス。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig5.jpg" /> 図5： コマンドラインのスクリーンショットの図は、較正されたハードパルスの値を導入する方法を示しています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig6.jpg" /> 図6：。 整形されたパルスの長さの値は、図は、整形パルスの長さの値を導入する方法を示しています。<html> g6large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig7.jpg" /> 図7： 取得パラメータの図は、電力パラメータを示している。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig8.jpg" /> 図8：パルス状のパラメータ整形パルスの値がライン13に導入される<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig8large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <html> PLOAD / 54499 / 54499fig9.jpg &quot;/&gt; 図9：照射周波数の一覧図は、最初の3行で、以下のデータが含まれています。 行1. Pは、（以下のデータはppmであることを示す）; ppmで照射される信号の ロウ2 周波数、測定されます 。 3.1.1で、行3.40 ppmで （その周波数での照射がスペクトルに影響を与えないように遠く化合物の1 H信号からある周波数）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig9large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図10" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig10.jpg" /> 図10： 最初のFIDの処理図は、EFPを入力した後に表示されるポップアップウィンドウを示しています。<html> NK &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図11" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig11.jpg" /> 図11： 位相補正スクリーンショットマニュアル位相補正用のウィンドウを示す<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig11large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図12" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig12.jpg" /> 図12： 第FIDの処理は、図は、EFPを入力した後に表示されるポップアップウィンドウを示している。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig12large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図13「SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 54499 / 54499fig13.jpg&quot; /&gt; 図13：赤い四角で強調表示されたスペクトル2と3ボタンの複数の表示は、差スペクトルを計算するためのものである。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig13large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図14" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig14.jpg" /> 図14：積分]タブの図は、絶対的および相対積分の値を示している。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig14large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図15" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig15.jpg" /> 図15： 構造と 1 </stron<html>グラム&gt; N のH NMRスペクトル 、 トルエン-D 8で22.5℃、Nジメチルアセトアミド （a）は、照射前2.13 2.66 ppmでの地域の1 H NMR展開。 （b）は 2.17 ppmのメチル基の照射後の同じ領域の拡大を。 （c）の差スペクトル[（A） - （B）]。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig15large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図16" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig16.jpg" /> 図16：ηSSTD と化学の王立協会から許可を得て、参照21の支持情報から278 K.再現で、その指数関数フィット のプロットの例 。http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig16large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図17" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig17.jpg" /> 図 17：ηSSTD 対 のプロット 異なる温度での飽和時間が。図は、N、N-ジメチルアセトアミド、得られた速度定数と緩和時間を持つテーブルのプロットを示している。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig17large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図18" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig18.jpg" /> 図18： アイリングプロット図は、N、N-ジメチルアセトアミドのためのプロットを示しています。。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig18large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> 座っトン（秒） </td><td> SSTDη </td><td> SSTDη </td><td> SSTDη </td><td> SSTDη </td><td> SSTDη </td><td> SSTDη </td><td> SSTDη </td></tr><tr><td> （T = 278 K） </td><td> （T = 283 K） </td><td> （T = 285.5 K） </td><td> （T = 288 K） </td><td> （T = 290.5 K） </td><td> （T = 293 K） </td><td> （T = 295.5 K） </td></tr><tr><td> 40 </td><td> 0.2526 </td><td> 0.3957 </td><td> 0.4671 </td><td> 0.5461 </td><td> 0.626 </td><td> 0.6969 </td><td> 0.7535 </td></tr><tr><td> 20 </td><td> 0.2526 </td><td> 0.3957 </td><td> 0.4671 </td><td> 0.5461 </td><td> 0.626 </td><td> 0.6969 </td><td> 0.7535 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 0.2383 </td><td> 0.3806 </td><td> 0.4537 </td><td> 0.5355 </td><td> 0.6199 </td><td> 0.6969 </td><td> 0.7535 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 0.1904 </td><td> 0.3193 </td><td> 0.3919 </td><td> 0.481 </td><td> 0.5734 </td><td> 0.6638 </td><td> 0.7318 </td></tr><tr><td> 2.5 </td><td> 0.1263 </td><td> 0.2204 </td><td> 0.2812 </td><td> 0.3589 </td><td> 0.4449 </td><td> 0.5461 </td><td> 0.626 </td></tr><tr><td> 1.25 </td><td> 0.0761 </td><td> 0.1353 </td><td> 0.171 </td><td> 0.2247 </td><td> 0.2868 </td><td> 0.3732 </td> &lt;TD&gt; 0.4449 </td></tr><tr><td> 0.625 </td><td> 0.0467 </td><td> 0.0739 </td><td> 0.099 </td><td> 0.1327 </td><td> 0.171 </td><td> 0.2291 </td><td> 0.2758 </td></tr><tr><td> 0.3 </td><td> 0.0238 </td><td> 0.044 </td><td> 0.0472 </td><td> 0.0644 </td><td> 0.0847 </td><td> 0.1169 </td><td> 0.1463 </td></tr></tbody></table> 表1：ηSSTDの値の表では、N、温度278から295.5 Kの範囲内のN個のジメチルアセトアミドに異なる飽和時間で得られた値を示しています。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="585"><colgroup><col /><col span="5" /></colgroup><tbody><tr height="34"><td height="34" style="height:34px;width:145px;"> 方法 </td><td style="width:88px;"> SSTD NMR </td><td rowspan="2" style="width:88px;"> SST NMR 31 </<html> TD&gt; <td style="width:88px;"> 線状分析 </td><td style="width:88px;"> 線状分析 </td><td style="width:88px;"> 線状分析 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:145px;"> パラメーター </td><td style="width:88px;"> （この作品） </td><td style="width:88px;"> （1 H NMR）4 </td><td style="width:88px;"> （1 H NMR）5 </td><td style="width:88px;"> （13 C NMR）6 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:145px;"> E 298（KJのモル-1） </td><td style="width:88px;"> 79.7±0.1 </td><td style="width:88px;"> 73.1±1.4 </td><td style="width:88px;"> 70.5±1.7 </td><td style="width:88px;"> 82.0±1.3 </td><td style="width:88px;"> 79.5±0.4 </td></tr><tr height="21">21px;幅：145px; &quot;&gt;ΔH‡（KJモル-1） </td><td style="width:88px;"> 77.2±0.1 </td><td style="width:88px;"> 70.6±1.4 </td><td style="width:88px;"> 68 </td><td style="width:88px;"> 79.5±0.4 </td><td style="width:88px;"> 76.6±0.4 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:145px;"> ΔS‡（Jモル-1 K -1） </td><td style="width:88px;"> 11.5±0.4 </td><td style="width:88px;"> -10.5±5.0 </td><td style="width:88px;"> -15.0±5.1 </td><td style="width:88px;"> 13±8 </td><td style="width:88px;"> 3±4 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:145px;"> ΔG‡298（KJのモル-1） </td><td style="width:88px;"> 73.8±0.1 </td><td style="width:88px;"> 73.7±2.0 </td><td style="width:88px;"> 720.5 </td><td style="width:88px;"> 75.3±0.4 </td><td style="width:88px;"> 75.7±0.4 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:145px;"> 溶媒 </td><td style="width:88px;"> D 8 Tol- </td><td style="width:88px;"> D 8 Tol- </td><td style="width:88px;"> 四塩化炭素</td><td style="width:88px;">アセトン-d 6 </td><td style="width:88px;">ニート</td></tr></tbody></table> 表2： 活性化パラメータは、テーブルは、Nの内部回転の起動パラメータは、Nは、分析のための別のNMR法を用いて得られた同じパラメータと比較SSTD NMR法によって得られたジメチルアセトアミドを示し、この表の4,5,6エラー。標準偏差誤差（SD）を参照してください。 （ロイヤルのSocからの許可を得て、基準21から再生化学のiety）。

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Spin Saturation Transfer Difference NMR SSTD NMR: A New Tool to Obtain Kinetic Parameters of Chemical Exchange Processes

A detailed protocol describing the SSTD NMR method is presented here to help new users apply this new method to obtain the kinetic parameters of their own systems undergoing chemical exchange.

化学Exchangeプロセスの動力学的パラメーターを取得するために新しいツール：飽和移動差NMR（SSTD NMR）をスピン

This detailed protocol describes the new Spin Saturation Transfer Difference Nuclear Magnetic Resonance protocol (SSTD NMR), recently developed in our ...

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Spin Saturation Transfer Difference NMR (SSTD NMR): A New Tool to Obtain Kinetic Parameters of Chemical Exchange Processes

Advanced Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

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ビデオ: Spin Saturation Transfer Difference NMR SSTD NMR: A New Tool to Obtain Kinetic Parameters of Chemical Exchange Processes

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the propagation of neurodegenerative disorders. Such assemblies consist in multiple protein subunits organized in a non-covalent way to form large macromolecular objects that can execute a variety of cellular functions or cause detrimental consequences. Atomic insights into the assembly mechanisms and the functioning of those macromolecular assemblies remain often scarce since their inherent insolubility and non-crystallinity often drastically reduces the quality of the data obtained from most techniques used in structural biology, such as X-ray crystallography and solution Nuclear Magnetic Resonance (NMR). We here present magic-angle spinning solid-state NMR spectroscopy (SSNMR) as a powerful method to investigate structures of macromolecular assemblies at atomic resolution. SSNMR can reveal atomic details on the assembled complex without size and solubility limitations. The protocol presented here describes the essential steps from the production of 13C/15N isotope-labeled macromolecular protein assemblies to the acquisition of standard SSNMR spectra and their analysis and interpretation. As an example, we show the pipeline of a SSNMR structural analysis of a filamentous protein assembly.

Structures of supramolecular protein assemblies at atomic resolution are of high relevance because of their crucial roles in a variety of biological phenomena. Herein, we present a protocol to perform high-resolution structural studies on insoluble and non-crystalline macromolecular protein assemblies by magic-angle spinning solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy (MAS SSNMR).

固体核磁気共鳴分光法による高分子アセンブリの原子スケール構造の研究

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

生化学

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of metabolic transformations. Hyperpolarization via dissolution DNP circumvents part of the sensitivity issues thanks to the large out-of-equilibrium nuclear magnetization stemming from the electron-to-nucleus spin polarization transfer. The high NMR signal obtained can be used to monitor chemical reactions in real time. The downside of hyperpolarized NMR resides in the limited time window available for signal acquisition, which is usually on the order of the nuclear spin longitudinal relaxation time constant, T1, or, in favorable cases, on the order of the relaxation time constant associated with the singlet-state of coupled nuclei, TLLS. Cellular uptake of endogenous molecules and metabolic rates can provide essential information on tumor development and drug response. Numerous previous hyperpolarized NMR studies have demonstrated the relevancy of pyruvate as a metabolic substrate for monitoring enzymatic activity in vivo. This work provides a detailed description of the experimental setup and methods required for the study of enzymatic reactions, in particular the pyruvate-to-lactate conversion rate in presence of lactate dehydrogenase (LDH), by hyperpolarized NMR.

The sensitivity enhancement provided by dissolution dynamic nuclear polarization (DNP) enables following metabolic processes in real time by NMR and MRI. The characteristics and performances of a dedicated dissolution DNP setup designed for study enzymatic reactions are discussed.

NMRによるリアルタイム酵素反応速度測定のための溶解動的核分極計装

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

化学

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.

This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.

サイト監督スピン標識および五量体リガンド依存性イオンチャネルのEPR分光研究

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

In Situ Monitoring of Diffusion of Guest Molecules in Porous Media Using Electron Paramagnetic Resonance Imaging

A method is demonstrated to monitor macroscopic translational diffusion using electron paramagnetic resonance (EPR) imaging. A host-guest system with nitroxide spin probe 3-(2-Iodoacetamido)-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxy (IPSL) as a guest inside the periodic mesoporous organosilica (PMO) aerogel UKON1-GEL as a host and ethanol as a solvent is used as an example to describe the protocol. Data is shown from a previous publication, where the protocol has been applied to both IPSL and Tris(8-carboxy-2,2,6,6-perdeutero-tetramethyl-benzo[1,2-d:4,5-d&#8242;]bis(1,3)dithiole) methyl (Trityl) as guest molecules and UKON1-GEL and SILICA-GEL as host systems. 
A method is shown to prepare aerogel samples that cannot be synthesized directly in the sample tube for measurement due to a size change during synthesis. The aerogel is attached to sample tubes using heat shrink tubing and a pressure cooker to reach the necessary temperature without evaporating the solvent in the process. The method does not assume a clearly defined initial distribution of guest molecules at the start of the measurement. Instead, it requires a reservoir on top of the aerogel and experimentally determines the influx rate during data analysis.
The diffusion is monitored continually over a period of 20 hr by recording the 1d spin density profile within the sample. The spectrometer settings for the imaging experiment are described quantitatively. Data analysis software is provided to take the resonator sensitivity profile into account and to numerically solve the diffusion equation. The software determines the macroscopic translational diffusion coefficient by least square minimization of the difference between the experiment and the numerical solution of the diffusion equation.

In Situ Monitoring of Diffusion of Guest Molecules in Porous Media Using Electron Paramagnetic Resonance Imaging

A protocol for the in situ monitoring of the diffusion of guest molecules in porous media using electron paramagnetic resonance (EPR) imaging is presented.

電子常磁性共鳴イメージングを使用した多孔質体でゲスト分子の拡散の場の監視で

A method is demonstrated to monitor macroscopic translational diffusion using electron paramagnetic resonance (EPR) imaging. A host-guest system with ...

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important biological processes. Understanding how the balance between structure and dynamics governs biological function is a new frontier in modern structural biology and has ignited several technical and methodological developments. Among these, CPMG relaxation dispersion solution NMR methods provide unique, atomic-resolution information on the structure, kinetics, and thermodynamics of protein conformational equilibria occurring on the &#181;s-ms timescale. Here, the study presents detailed protocols for acquisition and analysis of a&#160;15N relaxation dispersion experiment. As an example, the pipeline for the analysis of the &#181;s-ms dynamics in the C-terminal domain of bacteria Enzyme I is shown.

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the  &#181;s-ms Timescale

Here, a detailed description of the protocol implemented in the laboratory for acquisition and analysis of 15N relaxation dispersion profiles by solution NMR spectroscopy is provided.

15μs-ms タイムスケールにおけるタンパク質コンフォメーションダイナミクスの研究のためのN CPMG緩和分散

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers and modulators. While these dynamic states remain hidden to most structural methods, R1&#961; relaxation dispersion (RD) spectroscopy allows the study of conformational dynamics in the micro- to millisecond regime at atomic resolution. The use of 1H as the observed nucleus further expands the time regime covered and gives direct access to hydrogen bonds and base pairing.
The challenging steps in such a study are high-purity and high-yield sample preparation, potentially 13C- and 15N-labeled, as well as setup of experiments and fitting of data to extract population, exchange rate, and secondary structure of the previously invisible state. This protocol provides crucial hands-on steps in sample preparation to ensure the preparation of a suitable RNA sample and setup of 1H R1&#961; experiments with both isotopically labeled and unlabeled RNA samples.

We present a protocol to measure micro- to millisecond dynamics on 13C/15N-labeled and unlabeled RNA with 1H R1&#961; relaxation dispersion nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. The focus of this protocol lies in high-purity sample preparation and setup of NMR experiments.

RNAの1H R1ρ緩和分散実験のサンプル調製とセットアップの実態

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan electron-paramagnetic-resonance (RS-EPR), which can provide quantitative information under in vivo conditions on oxygen concentration, pH, redox status and concentration of signaling molecules (i.e., OH&#8226;, NO&#8226;). The RS-EPR technique has a higher sensitivity, improved spatial resolution (1 mm), and shorter acquisition time in comparison to the standard continuous wave (CW) technique. A variety of phantom configurations have been tested, with spatial resolution varying from 1 to 6 mm, and spectral width of the reporter molecules ranging from 16 &#181;T (160 mG) to 5 mT (50 G). A cross-loop bimodal resonator decouples excitation and detection, reducing the noise, while the rapid scan effect allows more power to be input to the spin system before saturation, increasing the EPR signal. This leads to a substantially higher signal-to-noise ratio than in conventional CW EPR experiments.

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

A new electron paramagnetic resonance (EPR) method, rapid scan EPR (RS-EPR), is demonstrated for 2D spectral spatial imaging which is superior to the traditional continuous wave (CW) technique and opens new venues for in vivo imaging. Results are demonstrated at 250 MHz, but the technique is applicable at any frequency.

高速走査電子常磁性共鳴イメージング生理学的に重要なパラメータのための新しい道を開きます。<em&gt;インビボ</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

生物工学

High-Resolution Studies of Proteins in Natural Membranes by Solid-State NMR

Membrane proteins are vital for cell function and thus represent important drug targets. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) spectroscopy offers a unique access to probe the structure and dynamics of such proteins in biological membranes of increasing complexity. Here, we present modern solid-state NMR spectroscopy as a tool to study structure and dynamics of proteins in natural lipid membranes and at atomic scale. Such spectroscopic studies profit from the use of high-sensitivity ssNMR methods, i.e., proton-(1H)-detected ssNMR and DNP (Dynamic Nuclear Polarization) supported ssNMR. Using bacterial outer membrane beta-barrel protein BamA and the ion channel KcsA, we present methods to prepare isotope-labeled membrane proteins and to derive structural and motional information by ssNMR.

This work details robust basic routines on how to prepare isotope-labeled membrane protein samples and analyze them at high-resolution with modern solid-state NMR spectroscopy methods.

Membrane proteins are vital for cell function and thus represent important drug targets. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) spectroscopy ...

糖鎖-タンパク質相互作用解析のための高度なNMR技術

Disentangling Glycan-Protein Interactions: Nuclear Magnetic Resonance (NMR) to the Rescue

The interactions of glycans with proteins modulate many events related to health and disease. In fact, the establishment of these recognition events and their biological consequences are intimately related to the three-dimensional structures of both partners, as well as to their dynamic features and their presentation on the corresponding cell compartments. NMR techniques are unique to disentangle these characteristics and, indeed, diverse NMR-based methodologies have been developed and applied to monitor the binding events of glycans with their associate receptors. This protocol outlines the procedures to acquire, process and analyze two of the most powerful NMR methodologies employed in the NMR-glycobiology field, 1H-Saturation transfer difference (STD) and 1H,15N-Heteronuclear single quantum coherence (HSQC) titration experiments, which complementarily offer information from the glycan and protein perspective, respectively. Indeed, when combined they offer a powerful toolkit for elucidating both the structural and dynamic aspects of molecular recognition processes. This comprehensive approach enhances our understanding of glycan-protein interactions and contributes to advancing research in the chemical glycobiology field.

著者スポットライト:糖鎖分子認識の構造的および動的側面の解明

Here, we present a protocol detailing the acquisition, processing, and analysis of a series of NMR experiments aimed at characterizing protein-glycan interactions in solution. Most common ligand-based and protein-based methodologies are outlined, which undoubtedly contribute to the fields of structural glycobiology and molecular recognition studies.

糖鎖-タンパク質相互作用の解きほぐし:核磁気共鳴(NMR)による解決

The interactions of glycans with proteins modulate many events related to health and disease. In fact, the establishment of these recognition events and ...

化学Exchangeプロセスの動力学的パラメーターを取得するために新しいツール：飽和移動差NMR（SSTD NMR）をスピン

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固体核磁気共鳴分光法による高分子アセンブリの原子スケール構造の研究

NMRによるリアルタイム酵素反応速度測定のための溶解動的核分極計装

サイト監督スピン標識および五量体リガンド依存性イオンチャネルのEPR分光研究

電子常磁性共鳴イメージングを使用した多孔質体でゲスト分子の拡散の場の監視で

¹⁵μs-ms タイムスケールにおけるタンパク質コンフォメーションダイナミクスの研究のためのN CPMG緩和分散

^RNAの1H _R1ρ緩和分散実験のサンプル調製とセットアップの実態

高速走査電子常磁性共鳴イメージング生理学的に重要なパラメータのための新しい道を開きます。

High-Resolution Studies of Proteins in Natural Membranes by Solid-State NMR

糖鎖-タンパク質相互作用の解きほぐし:核磁気共鳴(NMR)による解決

糖鎖-タンパク質相互作用の解きほぐし:核磁気共鳴(NMR)による解決