This work was supported by "Spanish Ministry of Economy and Competitiveness" [grant number BIO2014-5258P], "European Commission" by the H2020 programs [grant numbers TBVAC2020 643381].

全てのマウスは、制御された条件下で維持し、疾患の徴候について観察しました。実験研究は、実験動物の保護のためのヨーロッパと国家の指令と一致し、有能な地元の倫理委員会から承認を得て実施しました。 BCGデンマークの定量化グリセロールストックと結核菌 H37Rvの調製注：記載のすべてのプロトコルは、BSL3の条件下で行いました。 <ol><li> BCGデンマークまたは菌H37Rv株の凍結グリセロールストックを融解し、トゥイーン80 0.05％（V / V）およびADC（アルブミン、ブドウ糖、カタラーゼ）を10％（v / v）を補充した7H9培地10 10mlに100μlの接種。 </li><li>培養物が対数増殖期になるまで、37℃で1週間の静的な条件下でインキュベートします。 </li><li>新鮮な培地の200ミリリットルに10 mlの文化を転送することにより、細菌培養をスケールアップ。さらに20インキュベートします静的な条件下での日。 </li><li>グラムのx 2500で15分間、50-ml遠心チューブと遠心分離機に移します。 </li><li>上清を捨て、残留量に細菌ペレットを再懸濁します。 （ - チューブ当たり15 10）を各チューブ無菌3 mmの直径のガラスビーズに追加します。 </li><li>細菌の塊を解離するために、1分の間に激しくボルテックス。トゥイーン80 0.05％を含むPBS 10ml中の各ペレットを再懸濁（v / v）です。 </li><li>最大の細菌の集合体とガラスビーズがダウンして沈降させ、10分間チューブを残します。 </li><li>単一の新鮮な50-ml遠心チューブ（最終回復容量38ミリリットル）に小さな塊と、単一の細菌や転送量を含む4のチューブのそれぞれからの上清の9.5ミリリットルを回復します。 400×gで10分間遠心分離します。 </li><li>単一の新鮮な50mlの遠心管に（主に単一の細菌を含む）上清の35ミリリットルを回復し、（v / v）のグリセロールを50％含むPBSの15ミリリットルを追加し、（v / v）で15％の最終グリセロール濃度を得ました。 </li><li>穏やかに混合そして凍結するための適切なチューブに1mlのアリコートで配布しています。 -80℃で保存（1ロットは約50アリコートのグリセロールストックを提供します）。 </li><li>グリセロールストックを定量化するために、凍結後にグリセロール1日を解凍し、PBSの900μLを含む別の1.5 mlチューブに7 10倍連続希釈を行います。 </li><li>プレート55 mmの直径のペトリ皿中で調製ADCの10％（v / v）を補充した7H10固体寒天培地10の各希釈液100μl。 </li><li>慎重に3ミリメートル径のガラスビーズ（プレート当たり約10）を追加し、穏やかに均等に寒天プレート上にボリュームを配布するためにプレートを振ります。ビーズを破棄し、パラフィルムで寒天プレートをシール。 </li><li> 37℃で21日間培養し、単一コロニーを正確に区別することができる希釈でコロニー形成単位（CFU）をカウントすることにより、細菌濃度を決定します。 </li></ol> 2.マウスのワクチン接種<ol><li>事前に定量BCGグリセロールを解凍し、分取にPBSでそれを希釈2懸濁液があります。動物当たりの投与量を考慮し、最終的な体積を計算すると、皮下投与のため、100μlの（皮下ワクチン接種のために、1mlあたり10 7 CFU）と鼻腔内投与（鼻腔内ワクチン接種のための2.5×10 7 CFU）のために40μlのです。 </li><li>イソフルランと酸素の混合物をマウスに麻酔する齧歯類のための専門の麻酔ワークステーションを使用してください。麻酔室でマウスを維持するために麻酔と2％を誘導するためにイソフルランに5％を使用してください。 （他の一般に認められた麻酔法を使用することができます）。 </li><li>皮下ワクチン投与のために細菌懸濁液の1ミリリットル（10 7 CFU / ml）で26 G針を1-mlの注射器を埋めます。気泡を除去。 </li><li>層流フードの内側腹臥位で平らな面に麻酔をかけたマウスを置き、バックマウスの脇腹にワクチンの皮下に100μlの（10 6 CFU /用量）を接種します。ケージにマウスを返し、それがプロペことを確認するために、それを監視しますRLY麻酔から回復します。 </li><li>各マウスの投与の間注射針を変更します。上記のように空気の泡を削除しました。 </li><li>鼻腔内投与のために、フードの内側仰臥位で麻酔をかけたマウスを置きます。 </li><li>マイクロピペットで2.5×10 7 CFU / mlの懸濁液20μLを取ります。マウスは、ボリュームを呼吸できるようにする液滴間の時間を残して、接種滴ずつのボリューム全体が堆積されるまで2鼻孔の間を置き注：マウスは、この手順の間に呼吸困難に苦しむことができ、それらはに委ねられる必要がありますので、できるだけそれを防ぐために、次のいずれかを管理する前に、各ドロップを同化。 </li><li>別の20μlのマイクロピペットを再充填し、操作を繰り返してください。マウスは最初の接種後麻酔から覚ますために起動した場合は、前第1に麻酔室に入れてください。ケージにマウスを返し、それが正常に回復していることを確認麻酔から。 </li></ol>菌H37Rv株3.マウスの鼻腔内チャレンジ<ol><li>事前に定量菌H37Rvグリセロールを解凍し、1mlあたり2,500 CFUの細菌懸濁液を調製し、PBSでそれを希釈します。動物当たりの投与量を考慮し計算し最終容量は40μlのです。 </li><li> 2.7から2.5に記載されているように菌H37Rvを鼻腔内接種します。マウス当たりファイナルチャレンジ用量は10 2 CFU /40μlのです。 </li></ol>肺で誘導される免疫応答の4解析<ol><li> 肺細胞懸濁液 注：肺におけるワクチン誘導適応免疫応答の評価は、単一細胞懸濁液の生成を必要とします。この目的のために、我々はそのようなGentleMACSなどの組織解離を使用します。 <ol><li>頸椎脱臼（または他の許容人道的な方法論）によってマウスを犠牲にし、マウスが瞬目反射の不在を確認するために、眼球に触れて死んでいることを確認します。 </li><li>層流フードの内部に、Lを抽出します滅菌はさみやピンセットを用いてungs、清潔な表面上に置きます。きれいな肺気管および結合組織を除去し、（処理まで氷上で維持）をPBSで1.5 mlチューブに肺を転送します。 </li><li> pH7.4の、150mMのNaCl、5mMの塩化カリウム、1mMのMgCl 2、1.8mMのCaCl 2を10 mMのHEPES-NaOHを5 mlを含む臓器解離（C-解離管）のために適切なチューブに肺を置き、細胞懸濁液を生成しますバッファ。 </li><li>コラゲナーゼD 100 mg / mlで100μlの（2ミリグラム/ mlの最終濃度）、およびDNAse I2万IU / mlを40μlの（160 IU / mlの最終濃度を追加します。 NOTE：コラゲナーゼDまたはDNアーゼIのストック溶液は、PBSまたはグリセロールで凍結乾燥された酵素を50％（v / v）を、20mMのトリス塩酸pH7.5でのyのMgCl 2、それぞれ1ミリメートル、溶解調製されます。 </li><li>組織解離にチューブを置き、肺の断片化のための事前定義されたプログラムm_lung_01を使用しています。 30分間、水浴中で37℃でチューブをインキュベートします。 </li><li>目を配置します解離の電子管及び単一の細胞懸濁液中に完全な肺の均質化のための事前定義されたプログラムm_lung_02を使用しています。 </li><li> 50mlの遠心管に取り付けられた70μmのナイロン細胞ストレーナーを通して細胞懸濁液を渡します。 RPMI 1640培地10mlでストレーナーを洗浄します。 </li><li> 400×gで5分間遠心分離細胞と上清を捨てます。 </li><li> 、バッファを溶解赤血球の1ミリリットルを加えボルテックスで混和し、室温で1分間インキュベートします。 </li><li> 400×gで5分間、RPMI 1640培地遠心細胞を10mlを加えます。 </li><li>完全RPMI 1640培地0.5mlに再懸濁細胞を、10％熱不活性化ウシ胎児血清（FCS）、2mMのL - グルタミン、100μg/ mlのストレプトマイシンを有する100 IU / mlペニシリンおよび50μMの2-メルカプトエタノールを補充しました。 注：FCS、30分間56℃でインキュベートすることにより不活性化されます。 </li><li>細胞を計数し、10 7細胞/ mlの最終細胞密度に到達するために、完全RPMI 1640培地を加えます。 注：細胞数のために、我々は、自動細胞カウンターを使用します。 </li><li> U底96ウェル滅菌プレート中の細胞懸濁液100μlを配布します（10 6細胞/ウェル）。 </li><li>商業菌H37Rv精製タンパク質誘導体の15μgの/ mlの（PPD）（5μg/ mlの最終濃度）で完全RPMI 1640培地の50μl/ウェルを追加します。 </li></ol></li><li> ELISAによるサイトカイン決意のために上清を収集 <ol><li> 4.1.14から37℃で48時間、5％CO 2静置します。 </li><li> 400×gで5分間遠心プレート100μlの上清を回収します。 </li><li> -80℃で保管してください。 </li><li>それぞれ、IFNγおよびIL17A決意のためのアッセイ緩​​衝液中の上清1/10と1/2に希釈します。メーカーの説明書（ELISA開発キット）によると、市販のELISAキットを用いてサイトカイン濃度を決定します。 </li></ol></li><li> サイトカインの決意のための細胞内染色フローサイトメトリーにより、CD4 +細胞を産生<ol><li> 4.1.14から37℃で18時間、5％CO 2静置します。 </li><li>各ウェル（10 / mlの最終濃度）にブレフェルジンA 1mg / mlの（DMSOに溶解した株）の1.5μlを添加して、6つの追加時間インキュベート。 </li><li> 3200×gで1分間4.3.2から、プレートを遠心し、上清を捨てます。 </li><li>抗マウスCD4-FITC50μlの再懸濁細胞を、10％FCS（1/500）を含むRPMI 1640に希釈し、4℃で10分間インキュベートします。 </li><li> 、3200×gで1分間4.3.4から、プレートを遠心上清を廃棄し、100μl/ウェルの固定液を追加します。 4℃で20分間インキュベートします。 </li><li>透過性溶液150μL/洗浄で細胞を2回洗浄します。 注：10倍濃縮ストックを1×作業溶液を調製し、脱イオン水で希釈されます。 </li><li>抗マウスIFNγ-APCとpermeabilで希釈した抗マウスIL17A-APC.Cy750μlの再懸濁細胞化ソリューション（1/250両抗体）。 </li><li> RTで1時間インキュベートします。 </li><li>透過性溶液150μL/洗浄で細胞を2回洗浄します。 </li><li>フローサイトメトリー取得のため200μlのPBSで細胞を再懸濁し。 </li></ol></li></ol>気管支肺胞洗浄中の免疫グロブリンの5分析（BAL） <ol><li> BALサンプルの取得 <ol><li>頸椎脱臼（または他の許容人道的な方法論）によってマウスを犠牲にし、マウスが瞬目反射の不在を確認するために、眼球に触れて死んでいることを確認します。 </li><li>適切な精度滅菌ピンセットやハサミを使って気管を露出させ、気管に小さなカットを行い、それを完全に切除しないように確認すること。 BALサンプルを汚染する可能性の出血を引き起こすことがないように注意してください。 </li><li>気管内に氷冷PBS800μlの滅菌1 mlシリンジに接続されたカニューレをご紹介します。 </li><li>肺にゆっくりPBSを接種してからR肺の崩壊を避けるために、非常にゆっくりと注射器のピストンを引き戻すエコベールBALのボリューム。 注：500〜600μlと回復が良好です。 </li><li> 1.5-mlチューブにBALボリュームを転送し、それは血液（処理まで氷上で維持）で汚染されていない示し、BALは無色のままであることを確認します。 </li><li>遠心分離機BALは、400×gで5分間のサンプル、および上清を新しいチューブに移します。 </li><li> -80℃で保存上清。 </li></ol></li><li> BAL上清中のIgAの決意 注：使用するすべての試薬は室温です。 <ol><li>コート高タンパク質はM.ため（の10μg/ mlで）をPBSで希釈したPPD100μlのポリスチレン平底96ウェルプレートに結合結核特異的なIgA決意、または合計のIgA決意をPBSで10倍に希釈したBAL上清100μlを持ちます。 </li><li> 4℃で一晩インキュベートします。 </li><li>上清を捨て、Dにペーパータオル上でプレートをタップRY。 200μlのPBS /ウェルで洗浄します。 </li><li> 200μL/ウェルのウシ血清アルブミン（BSA）、1％（v / v）の（ブロッキング緩衝液）PBS-ツイーン80 0.05％で（V / W）でブロック。 </li><li> RTで1時間インキュベートします。 </li><li> 200μlのPBS /トゥイーン80 0.05％（v / v）の（洗浄バッファー）のウェルで一回洗浄します。 </li><li> PPD被覆ウェルに希釈されていないBALの上清100μlを加えます。室温で2時間インキュベートします。 注：合計のIgA決意はPPD特異的IgAと並行して行われた場合、このインキュベーション中に100μlの洗浄緩衝液で総IgAの井戸を残します。 </li><li> 200μL/ウェルの洗浄buffer.0170004で3回洗浄</li><li>西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）の100μLを加えるには、バッファ（1 / 10,000）をブロックに希釈した抗マウスのIgAを抱合しました。 </li><li> 1時間RTをインキュベートします。 </li><li> 200μl/ウェルの洗浄緩衝液で5回洗浄します。 </li><li> 3,3の100μl/ウェルを追加 &#39;、5,5&#39;-テトラメチルベンジジン（TMB）。 Tで室温で20分間インキュベートします彼は暗いです。 </li><li> 100μl/ウェルのH 2 SO 4 0.5Nを追加します。波長450nmで分光光度計でプレートを読みます。 </li></ol></li></ol>肺6.細菌負荷の決意<ol><li> 肺の均質化およびメッキ <ol><li>チャレンジの4週間後、頸椎脱臼（または他の許容人道的な方法論）によってマウスを犠牲にし、マウスが瞬目反射の不在を確認するための眼球に触れて死んでいることを確認します。 </li><li>層流フードの内側に平坦な消毒表面上に固定された仰臥位でマウスを置きます。 </li><li>胸部領域を可視残すために切開を行い、胸部から肌を削除します。 </li><li>リブを切り出し、滅菌ハサミやピンセットを用いて、肺と心臓を収穫。きれいな表面に臓器を置きます。 </li><li>心臓、気管および結合組織を除去することにより、肺をきれいにし、脱イオン水1ミリリットルと1.5 mlチューブに肺を転送します（処理まで氷上で維持します）。 </li><li>脱イオン水1ミリリットルを含む、 - 臓器均質化（解離チューブM）のための適切なチューブに各マウスの肺を転送するために滅菌ピンセットを使用してください。 </li><li>組織解離にチューブを置き、肺を均質化するために事前に定義されたプログラムRNA_1を使用しています。 </li><li> 900μlの希釈された肺ホモジネートの100μlで始まる、1.5 mlチューブに5〜10倍連続希釈液を作ります。 </li><li> 1.11から1.14に記載されているようにプレート希釈液。 </li></ol></li><li> PCRによるBCGと菌H37Rvの区別 注：鼻腔内経路によってBCGでワクチン接種したグループに対応する6.1.6からのプレートでは、我々はワクチン付与防御効力を評価するために考えCFUが対応することを保証するために、BCGと菌H37Rvの間に目の肥えたPCRによってコロニーの代表的な数を分析しました一意菌H37Rvへ。 BCGおよびM. TUでRD9のこのPCR標的増幅、異なるゲノム領域berculosis、菌H37Rvのための2618塩基対、およびBCG 11のための465塩基対の断片を与えます。 <ol><li>示されるように、サンプルあたりのボリュームを持つすべてのサンプルについてマスターミックスの株式を準備し、その後、PCRチューブ（9μL/サンプル）で配布しています。 注：バッファ5X：2μlの。フォワードプライマー、25μM（GTGTAGGTCAGCCCCATCC）：0.32μlを、Taqポリメラーゼμlの5単位/：：0.04μlを、脱イオンH 2 O：6.32μlの0.32μlを、プライマー、25μM（GCCCAACAGCTCGACATC）を逆にします。 </li><li>滅菌爪楊枝でコロニーをタッチして、マスターミックスを含むPCRチューブ内のサンプルと爪楊枝を浸します。 </li><li> 10分95℃（このステップは、細菌の破壊をトリガーするためである）、10分95℃（このステップは、細菌の破壊をトリガーするためである）、35サイクル（95℃で30秒、1分：以下のプログラムでPCRを実行します。 58°Cと72°Cで4分）で。 </li><li>断片を可視化するために、臭化エチジウムおよび実行サンプルを1％アガロースゲルでPCRサンプルをロードします。 </l私&gt; </ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Although current vaccine against tuberculosis, BCG, is the most widely administered vaccine in history, tuberculosis remains one of the leading causes of death and morbidity from infectious diseases worldwide. This paradox is explained by the lack of protection of this vaccine against pulmonary tuberculosis, the responsible form of transmission. New vaccination approaches effective against pulmonary forms of the disease are urgently needed, as they would have the greatest impact on disease transmission globally.
<p c...

結核（TB）は、結核驚くべき世界的な健康問題が1になり、世界のHIVよりも関連の死亡を引き起こし大手感染症の一つであり、多剤耐性株の上昇を高めることと組み合わせています。新しい診断ツール、より効果的かつ毒性の少ない薬、新たな安全かつ効果的な結核ワクチンは、特に発展途上国では、緊急の必要性です。 弱毒生カルメット・ゲラン桿菌（BCG）は、現在、全世界で1970年代以降、出生時に皮内投与された結核に対する唯一の認可ワクチンです。 BCGは、子供の病気（髄膜炎や粟粒結核）の重症型の予防に有効であると考えられるが、病気の伝染2の責任肺結核に対する矛盾した有効性を示しています。 結核感染の自然経路を模倣肺ワクチン接種は、ローカルホストの免疫応答をプライミングするための魅力的なアプローチを表し秒。この点において、異なる関連するTBの動物モデルにおいて、様々な前臨床作品は、皮下または皮内経路3-6と比較して、肺の免疫後の大きいワクチンの有効性を実証しています。それにもかかわらず、肺のワクチン接種によってトリガ保護メカニズムはよく理解されていません。 IL17粘膜ワクチンによって誘導される防御効力欠損マウスモデルで7,8を損なわれているように最後の年では、いくつかの作品は、TB-特有の粘膜免疫応答の重要な要因として、IL17が媒介する応答に向かって指摘しています。 最近では、BCGの投与は、DBA / 2マウス、皮下BCGの予防接種9後の保護の欠如によって特徴づけられるマウス系統を保護鼻腔内を初めて実証しました。これらの結果は、皮内BCGをpulmonに対して効果がないとみなされる場合、呼吸TBワクチンは流行国でTBの速度を低下させる、より効果的であることが示唆しました進TB。

<table><tbody><tr><td>Middlebrook 7H9 broth</td><td>BD</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook ADC Enrichment</td><td>BD</td><td>211887</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Scharlau</td><td>TW00800250</td><td></td></tr><tr><td>3-mm diameter Glass Beads</td><td>Scharlau</td><td>038-138003</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H10 Agar</td><td>BD</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>1-ml syringe 26GA 0.45 x 10 mm</td><td>BD</td><td>301358</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>C tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>M tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088882001</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Applichem</td><td>A3778,0100</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 &amp;micro;m Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood Cell Lysing Buffer</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100x concentrated</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>100x concentrated</td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>Biological Industries</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter</td><td>Millipore</td><td>PHCC20040</td><td></td></tr><tr><td>Scepter Cell Counter Sensors, 40 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>PHCC40050</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium Tuberculosis - Tuberculin PPD</td><td>Statens Serum Institut (SSI)</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IFN-&amp;gamma; ELISA development kit&amp;nbsp;</td><td>Mabtech</td><td>3321-1H</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL17A ELISA development kit&amp;nbsp;</td><td>Mabtech</td><td>3521-1H</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse CD4</td><td>BD</td><td>553047</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Kit</td><td>BD</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Rat Anti-mouse IL-17A</td><td>BD</td><td>560821</td><td></td></tr><tr><td>APC Mouse Anti-mouse IFNg</td><td>BD</td><td>554413</td><td></td></tr><tr><td>LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0.60 x 30 mm. 23G x 1 1/4&amp;rdquo;</td><td>UNIMED</td><td>27.134</td><td>Used as trachea cannula for BAL</td></tr><tr><td>high-protein binding polystyrene flat-bottom 96-well plates MAXISORP</td><td>NUNC</td><td>430341</td><td></td></tr><tr><td>Albumin, from bovine serum</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgA (&amp;alpha;-chain specific)&amp;minus;Peroxidase antibody</td><td>Sigma</td><td>A4789</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;prime;,5,5&amp;prime;-Tetramethylbenzidine (TMB)&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td></td></tr><tr><td>MyTaq DNA Polymerase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21107</td><td>The kit Includes Buffer 5x</td></tr></tbody></table>

protective efficacy and pulmonary immune response following subcutaneous and intranasal bcg administration in mice

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data have encouraged pulmonary tuberculosis vaccines as a promising strategy to prevent pulmonary disease, which is responsible for transmission. In this work, we describe the methodology used to demonstrate in the mouse model the benefits of intranasal BCG vaccination when compared to subcutaneous. Our data revealed greater protective efficacy following intranasal BCG administration. In addition, our results indicate that pulmonary vaccination triggers a higher immune response in lungs, including Th1 and Th17 responses, as well as an increase of immunoglobulin A (IgA) concentration in respiratory airways. Our data show correlation between protective efficacy and the presence of IL17-producing cells in lungs post-Mycobacterium tuberculosis challenge, suggesting a role for this cytokine in the protective response conferred by pulmonary vaccination. Finally, we detail the global workflow we have developed to study respiratory vaccination in the mouse model, which could be extrapolated to other tuberculosis vaccines, apart from BCG, targeting the mucosal response or other pulmonary routes of administration such as the intratracheal or aerosol.

皮下および鼻腔内：この作品は、BCGの投与の2ルートの比較を説明します。皮下経路は、世界中のBCGのための現在の臨床経路である皮内、に匹敵します。ワクチン接種の鼻腔内経路は、Mの感染の自然経路を模倣することを目指して肺に直接免疫応答を誘導することを目的に、この病原体の主要な標的臓器と結核 、。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within...

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Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

防御効力および肺免疫応答は、マウスに皮下および鼻腔内BCG投与後の

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

protective-efficacy-pulmonary-immune-response-following-subcutaneous

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.5K ビュー.  University of Zaragoza. We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

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A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal titers. Studies of serum bactericidal titers in response to childhood vaccines have enabled us to develop and validate cut-off levels for protective immune responses and such cut-offs are in routine use. No such assays have been taken forward into the routine assessment of vaccines that induce primarily cell-mediated immunity in the form of effector T cell responses, such as TB vaccines. In the animal model, the performance of a given vaccine candidate is routinely evaluated in standardized bactericidal assays, and all current novel TB-vaccine candidates have been subjected to this step in their evaluation prior to phase 1 human trials. The assessment of immunogenicity and therefore likelihood of protective efficacy of novel anti-TB vaccines should ideally undergo a similar step-wise evaluation in the human models now, including measurements in bactericidal assays.
Bactericidal assays in the context of tuberculosis vaccine research are already well established in the animal models, where they are applied to screen potentially promising vaccine candidates. Reduction of bacterial load in various organs functions as the main read-out of immunogenicity. However, no such assays have been incorporated into clinical trials for novel anti-TB vaccines to date.
Although there is still uncertainty about the exact mechanisms that lead to killing of mycobacteria inside human macrophages, the interaction of macrophages and T cells with mycobacteria is clearly required. The assay described in this paper represents a novel generation of bactericidal assays that enables studies of such key cellular components with all other cellular and humoral factors present in whole blood without making assumptions about their relative individual contribution. The assay described by our group uses small volumes of whole blood and has already been employed in studies of adults and children in TB-endemic settings. We have shown immunogenicity of the BCG vaccine, increased growth of mycobacteria in HIV-positive patients, as well as the effect of anti-retroviral therapy and Vitamin D on mycobacterial survival in vitro. Here we summarise the methodology, and present our reproducibility data using this relatively simple, low-cost and field-friendly model.
Note: Definitions/Abbreviations
BCG lux = M. bovis BCG, Montreal strain, transformed with shuttle plasmid pSMT1 carrying the luxAB genes from Vibrio harveyi, under the control of the mycobacterial GroEL (hsp60) promoter. 
CFU = Colony Forming Unit (a measure of mycobacterial viability).

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

We describe an alternative approach to the enumeration of mycobacteria in vitro, which uses reporter-gene tagged mycobacteria instead of colony-forming units (CFU). &#x201C;Survival&#x201D; of organisms as well as host response-markers are measured simultaneously, providing a low-cost, versatile and functional system for studies of host/pathogen interactions in the context of tuberculosis.

BCGまたはM. TB（BCGタグレポーター遺伝子を用いて、抗酸菌の生存率を測定するための機能全血アッセイルクス / M. Tbをルクス）

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

免疫・感染学

Intralymphatic Immunotherapy and Vaccination in Mice

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of vaccine to lymph nodes where antigen presenting cells can interact with lymphocytes for generation of the wanted immune responses. The strength and the type of immune responses induced also depend on the density or frequency of interactions as well as the microenvironment, especially the content of cytokines. As only a minute fraction of peripherally injected vaccines reaches the lymph nodes, vaccinations of mice and humans were performed by direct injection of vaccine into inguinal lymph nodes, i.e.&#160;intralymphatic injection. In man, the procedure is guided by ultrasound. In mice, a small (5-10 mm) incision is made in the inguinal region of anesthetized animals, the lymph node is localized and immobilized with forceps, and a volume of 10-20 &#956;l of the vaccine is injected under visual control. The incision is closed with a single stitch using surgical sutures. Mice were vaccinated with plasmid DNA, RNA, peptide, protein, particles, and bacteria as well as adjuvants, and strong improvement of immune responses against all type of vaccines was observed. The intralymphatic method of vaccination is especially appropriate in situations where conventional vaccination produces insufficient immunity or where the amount of available vaccine is limited.

Prophylactic and therapeutic vaccination often fails to stimulate strong immune responses due to week drainage of the vaccine to lymph nodes and consequently poor involvement of immune cells. By direct injection of vaccine to lymph nodes, so-called intralymphatic injection, vaccine efficacy can be strongly improved and vaccine doses can be reduced.

マウスのリンパ管内免疫療法やワクチン

Vaccines are typically injected subcutaneously or intramuscularly for stimulation of immune responses. The success of this requires efficient drainage of ...

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been shown to effectively induce humoral and cellular responses at systemic and mucosal sites, namely the lungs and urogenital tract. Sublingual vaccination can promote protection against infections at the lower and upper respiratory tract; it can also promote tolerance to allergens and ameliorate asthma symptoms. Modulation of lung&#8217;s immune response by sublingual immunotherapy (SLIT) is safer than direct administration of formulations by intranasal route because it does not require delivery of potentially harmful molecules directly into the airways. In contrast to intranasal delivery, side effects involving brain toxicity or facial paralysis are not promoted by SLIT. The immune mechanisms underlying SLIT remain elusive and its use for the treatment of acute lung infections has not yet been explored. Thus, development of appropriate animal models of SLIT is needed to further explore its potential advantages. 
This work shows how to perform sublingual administration of therapeutic agents in mice to evaluate their ability to protect against acute pneumococcal pneumonia. Technical aspects of mouse handling during sublingual inoculation, precise identification of sublingual mucosa, draining lymph nodes and isolation of tissues, bronchoalveolar lavage and lungs are illustrated. Protocols for single cell suspension preparation for FACS analysis are described in detail. Other downstream applications for the analysis of the immune response are discussed. Technical aspects of the preparation of Streptococcus pneumoniae inoculum and intranasal challenge of mice are also explained.
SLIT is a simple technique that allows screening of candidate molecules to modulate lungs&#8217; immune response. Parameters affecting the success of SLIT are related to molecular size, susceptibility to degradation and stability of highly concentrated formulations.

The present work illustrates the convenience of using sublingual immunotherapy to boost the innate immune response in the lungs and confer protection against acute pneumococcal pneumonia in mouse.

代替として舌下免疫療法は、急性呼吸器感染症に対する保護を誘導するために

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

医学

A CFSE-based Assay to Study the Migration of Murine Skin Dendritic Cells into Draining Lymph Nodes During Infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph node (DLN). The mobilization of DCs to the DLN is complex and remains to be fully elucidated during infection. Herein described is the use of an innovative, simple assay that relies on the fluorochrome 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to track the migration of DCs during footpad infection with Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Gu&#233;rin (BCG) in C57BL/6 mice. This assay enables the characterization of skin DC sub-populations that actively relocate to the draining, popliteal LN in response to BCG. This protocol originates from a BCG model where migratory skin DCs were identified by flow cytometry. The assay is amiable to the study and identification of DCs or other cells that home to the popliteal LN after inoculation of microbes, their metabolites or other inflammatory stimuli in the footpad, and consequently to study factors that regulate the migration of these cells.

An assay in mice to track cell migration from skin to draining lymph node is described which enables the characterization of skin Dendritic cells mobilized to the lymph node after footpad infection with Bacille Calmette-Gu&#233;rin.

での感染の間に流入領域リンパ節へのマウスの皮膚樹状細胞の移動を研究するためにCFSEベースアッセイ<em&gt;マイコバクテリウム・ボビス</em&gt;カルメット - ゲラン

Dendritic cells (DCs) are important for initiating immune responses, in part through their ability to acquire and shuttle antigen to the draining lymph ...

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for protection against children&#39;s severe TB meningitis and some forms of disseminated TB, but fails to protect against pulmonary TB, which is the most prevalent form of the disease. Promising strategies to improve BCG currently rely either on its transformation with genes encoding immunodominant M. tuberculosis (Mtb)-specific antigens and/or complementation with genes encoding co-factors that would stimulate antigen presenting cells. Major limitations to these approaches include low efficiency, low stability, and the uncertain level of safety of expression vectors. In this study, we present an alternative approach to vaccine improvement, which consists of BCG complementation with exogenous proteins of interest on the surface of bacteria, rather than transformation with plasmids encoding corresponding genes. First, proteins of interest are expressed in fusion with monomeric avidin in standard E. coli expression systems and then used to decorate the surface of biotinylated BCG. Animal experiments using BCG surface decorated with surrogate ovalbumin antigen demonstrate that the modified bacterium is fully immunogenic and capable of inducing specific T cell responses. Altogether, the data presented here strongly support a novel and efficient method for reshaping the current BCG vaccine that replaces the laborious conventional approach of complementation with exogenous nucleic acids.

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

A novel technique for rapid antigen display on a bacterial surface is presented, which involves surface biotinylation followed by exposure to proteins of interest in fusion with monomeric avidin. Loading BCG with selected antigens successfully improves its immunogenicity, suggesting that surface decoration can replace traditional genetic approaches.

アビジン-ビオチン システムと非遺伝の表面装飾を介してウシ結核BCG ワクチンの外因性抗原の発現

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

勉強する人間の T 細胞のリコール反応体内吸引水疱プロトコル

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, including metabolites, lipids, proteins, and nucleic acids, several groups have evaluated either the native or recombinant versions of bEVs for their protective potency as subunit vaccine candidates. Unlike native EVs, recombinant EVs are molecularly engineered to contain one or more immunogens of interest. Over the last decade, different groups have explored diverse approaches for generating recombinant bEVs. However, here, we report the design, construction, and enrichment of recombinant mycobacterial EVs (mEVs) in mycobacteria. Towards that, we use Mycobacterium smegmatis (Msm), an avirulent soil mycobacterium as the model system. We first describe the generation and enrichment of native EVs of Msm. Then, we describe the design and construction of recombinant mEVs that contain either mCherry, a red fluorescent reporter protein, or EsxA (Esat-6), a prominent immunogen of Mycobacterium tuberculosis. We achieve this by separately fusing mCherry and EsxA N-termini with the C-terminus of a small Msm protein Cfp-29. Cfp-29 is one of the few abundantly present proteins of MsmEVs. The protocol to generate and enrich recombinant mEVs from Msm remains identical to the generation and enrichment of native EVs of Msm.

This protocol details the enrichment of native mycobacterial extracellular vesicles (mEVs) from axenic cultures of Mycobacterium smegmatis (Msm) and how mCherry (a red fluorescent reporter)-containing recombinant MsmEVs can be designed and enriched. Lastly, it verifies the novel approach with the enrichment of MsmEVs containing the EsxA protein of Mycobacterium tuberculosis.

マイコバクテリアの天然および組換え細胞外小胞の濃縮

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, ...

Micro-CFU法による結核判定の迅速化

Micro-Colony Forming Unit Assay for Efficacy Evaluation of Vaccines Against Tuberculosis

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during the 2019-2021 pandemic. The disease is caused by the bacterium Mycobacterium tuberculosis (M.tb). The Mycobacterium bovis strain Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG), the only TB vaccine, is the oldest licensed vaccine in the world, still in use. Currently, there are 12 vaccines in clinical trials and dozens of vaccines under pre-clinical development. The method of choice used to assess the efficacy of TB vaccines in pre-clinical studies is the enumeration of bacterial colonies by the colony-forming units (CFU) assay. This time-consuming assay takes 4 to 6 weeks to conclude, requires substantial laboratory and incubator space, has high reagent costs, and is prone to contamination. Here we describe an optimized method for colony enumeration, the micro-CFU (mCFU), that offers a simple and rapid solution to analyze M.tb vaccine efficacy results. The mCFU assay requires tenfold fewer reagents, reduces the incubation period threefold, taking 1 to 2 weeks to conclude, reduces lab space and reagent cost, and minimizes the health and safety risks associated with working with large numbers of M.tb. Moreover, to evaluate the efficacy of a TB vaccine, samples may be obtained from a variety of sources, including tissues from vaccinated animals infected with Mycobacteria. We also describe an optimized method to produce a unicellular, uniform, and high-quality mycobacterial culture for infection studies. Finally, we propose that these methods should be universally adopted for pre-clinical studies of vaccine efficacy determination, ultimately leading to time reduction in the development of vaccines against TB.

著者スポットライト:結核ワクチンの有効性と抗原提示分析の効率的な評価のためのCFU決定の最適化 

The determination of colony-forming units (CFU) is the gold-standard technique for quantifying bacteria, including Mycobacterium tuberculosis which can take weeks to form visible colonies. Here we describe a micro-CFU for CFU determination with increased time efficiency, reduced lab space and reagent cost, and scalability to medium and high throughput experiments.

結核ワクチンの有効性評価のためのマイクロコロニー形成ユニットアッセイ

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during ...

防御効力および肺免疫応答は、マウスに皮下および鼻腔内BCG投与後の

要約

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この動画の章

BCGまたはM. TB（BCGタグレポーター遺伝子を用いて、抗酸菌の生存率を測定するための機能全血アッセイルクス / M. Tbをルクス）

マウスのリンパ管内免疫療法やワクチン

代替として舌下免疫療法は、急性呼吸器感染症に対する保護を誘導するために

での感染の間に流入領域リンパ節へのマウスの皮膚樹状細胞の移動を研究するためにCFSEベースアッセイ

アビジン-ビオチンシステムと非遺伝の表面装飾を介してウシ結核BCG ワクチンの外因性抗原の発現

勉強する人間の T 細胞のリコール反応体内吸引水疱プロトコル

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

マイコバクテリアの天然および組換え細胞外小胞の濃縮

結核ワクチンの有効性評価のためのマイクロコロニー形成ユニットアッセイ

結核ワクチンの有効性評価のためのマイクロコロニー形成ユニットアッセイ

防御効力および肺免疫応答は、マウスに皮下および鼻腔内BCG投与後の

要約

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BCGまたはM. TB（BCGタグレポーター遺伝子を用いて、抗酸菌の生存率を測定するための機能全血アッセイルクス / M. Tbをルクス）

マウスのリンパ管内免疫療法やワクチン

代替として舌下免疫療法は、急性呼吸器感染症に対する保護を誘導するために

での感染の間に流入領域リンパ節へのマウスの皮膚樹状細胞の移動を研究するためにCFSEベースアッセイ

アビジン-ビオチン システムと非遺伝の表面装飾を介してウシ結核BCG ワクチンの外因性抗原の発現

勉強する人間の T 細胞のリコール反応体内吸引水疱プロトコル

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

マイコバクテリアの天然および組換え細胞外小胞の濃縮

結核ワクチンの有効性評価のためのマイクロコロニー形成ユニットアッセイ

結核ワクチンの有効性評価のためのマイクロコロニー形成ユニットアッセイ

アビジン-ビオチンシステムと非遺伝の表面装飾を介してウシ結核BCG ワクチンの外因性抗原の発現