私たちは便利な議論のためのモハンマドサリーム、ジン呉とクリシュナンRaghunathanに感謝したいと思います。また、撮影中に支援するためのプリヤBeganiに感謝します。この作品は、国立衛生研究所R01 AI071727（AO）と（SLV）はR01 GM110052を付与することによってサポートされています。

1日目：小麦胚芽溶解物ベースのin vitro転写・翻訳システムを用いたGagタンパク質の発現 HIV-1のGagの調製<ol><li>冷凍庫から商業小麦胚芽CECFキットの全ての試薬を取り外します（小麦胚芽溶解物を-80ºCで保存されている。-20ºCで他の試薬）。氷の上で解凍し、 表1に示す成分を混合。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> ミックス-1（摂食ミックス） </td><td></td></tr><tr><td>供給溶液</td><td> 900μlの</td></tr><tr><td>アミノ酸</td><td> 80μlの</td></tr><tr><td>メチオニン</td><td> 20μlの</td></tr><tr><td> 合計 </td><td> 千μlの </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> ミックス-2（溶解物ミックス） </strオング&gt; </td><td></td></tr><tr><td>小麦胚芽溶解物</td><td> 15μlの</td></tr><tr><td> RNaseを含まない水</td><td> 7μlの</td></tr><tr><td>アミノ酸</td><td> 4μlの</td></tr><tr><td>メチオニン</td><td> 1μlの</td></tr><tr><td> TE緩衝液中のプラスミドDNA（1μgの/μl）を** </td><td> 4μlの</td></tr><tr><td>反応緩衝液</td><td> 15μlの</td></tr><tr><td> RNasin * </td><td> 4μlの</td></tr><tr><td> 合計 </td><td> 50μlの </td></tr></tbody></table> 表1：コムギ胚芽反応に必要な混合物の組成物。 注：この実験は、GAG結合膜上のRNaseによるRNA除去の効果を調べるために設計されている場合は、RNaseフリー水でリボヌクレアーゼ阻害剤を交換してください。プラスミドDNAを、製造業者の指示に従って不純物から自由でなければなりません。しかし、Plasmids従来のではなく、エンドトキシンフリーを用いて調製し、プラスミド単離キットが正常に使用されてきました。製造元の指示はまた、ヌクレアーゼフリー水に溶解したDNAを使用することをお勧めします。 TE [1mMのEDTAを含む10mMトリス-HCl（pH7.4）]中に懸濁したDNAを使用する場合、TEにおけるEDTAの歩留まりに影響を与える可能性があるため、DNAの低濃度の使用を避けます。 0.8から1μgの/μlの濃度範囲でのTE緩衝液に溶解したプラスミドは、成功裡に使用されています。 <ol start="2"><li>最初の反応カセット（透明室）に供給混合物（ミックス-1）を追加します。その後、他のチャンバ（赤）に溶解液ミックス（ミックス-2）を追加します。それぞれの室に混合物を添加しながらそれは溶液成分の非効率的な交流につながるため、反応の効率を低下させる可能性があるため、任意の気泡を導入しないでください。 </li><li>キットに付属の接着フィルム付き室をカバーしています。 </li><li>カセットホルダーとincubaに反応カセットを挿入しますエッペンドルフサーモミキサーRに900rpmでの一定の振とう速度で24ºCで24時間のアセンブリをTE </li></ol> 2日目：電鋳と収穫小麦胚芽ライセートによってGUVsを準備 GUVsの調製<ol><li>このようなスクリューキャップテフロンライナーでライニングし、パラフィルムで包まれたガラスバイアル中のクロロホルムとメタノールのクロロホルムまたはこれらの混合物などの無機溶媒に溶解したアリコート脂質。ハミルトン型ガラスシリンジ、または利用可能な場合、クロロホルム-性プラスチックのヒントと脂質を扱います。 -20ºCの冷凍庫からGUVの調製のために使用される脂質を含有するガラスバイアルを取り出し。 <ol><li>バイアルを室温に平衡化されると、脂質懸濁液が明確であることを目視により確認してください。脂質の品質、このようなパルミトイル-オレオイルホスファチジルセリン（POPS）とPI（4,5）P 2として特に酸性脂質は、成功した実験のために重要です。ある脂質を使用しないでくださいより長い2ヶ月アリコートインチ</li></ol></li><li>所望の温度に加熱ブロックを事前に温めます。この温度は、最も高いT mを有する脂質（複数可）の融解温度（T m）よりも少なくとも5ºC高くなければなりません。 </li><li>所望のモル脂質比に応じて必要な脂質量を計算します。 表2に示すように、ここで結合HIV-1のGagを研究するために、以下のモル比を使用します。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 脂質ミックス </td><td> モル比 </td><td> 容量（μL中） </td><td> ストック濃度 </td></tr><tr><td> POPC + POPS +チョル</td><td> 46.​​6 + 23.3 + 30 </td><td> 19.74 + 10.18 + 6.57 </td><td> POPC、POPS、チョル：10 mg / mlで</td></tr><tr><td rowspan="2"> POPC + POPS +チョル+脳-PI（4,5）P 2 </td><tdROWSPAN = &quot;2&quot;&gt; 40 + 20 + 30 + 10 </td><td rowspan="2"> 16.11 + 8.3 + 6.25 + 58.19 </td><td> POPC、POPS、チョル：10 mg / mlで</td></tr><tr><td>脳-PI（4,5）P 2：1mg / mlの</td></tr></tbody></table> 表2：異なる脂質のボリュームはGUVsを得るために使用されます。 <ol start="4"><li>きれいなスクリューキャップガラスバイアル中の脂質の所望のボリュームを追加します。 </li><li>寸法25×50×1.1ミリメートル3と抵抗70から100Ω（カタログに記載されているように）の使用ITO被覆スライド。クリーンベンチ上の2つのITO被覆スライドを置きます。各エレクトロフォーメーションチャンバーは、二つのインジウムスズ酸化物（ITO）被覆ガラススライドを必要とします。スライドガラスの導電側はマルチメータを使用して抵抗をチェックすることにより、上を向いていることを確認します。これは、約200Ωの値を表示する必要があります。スライドの表面をやさしくリントフリーワイプを用いて70％エタノールで拭いてきれいであることを確認します。 </li><li>里によって注射器の針の外面を清掃してくださいクロロホルムでそれをnsingし、ヒートブロック上に注射器を置きます。 </li><li>上を向いて導電側をヒートブロック上に新しいITO被覆ガラススライドを置き、それは通常、約2〜3分所望の温度に平衡化することができます。ガラススライド上のITOコーティングが手続きを洗浄中に破損する可能性がある潜在的なリスクのためのITO被覆ガラススライドを再利用しないでください。 </li><li>均一でスライドガラス上の脂質の広がりはまだ迅速なため、各スライドの脂質混合物の40〜50マイクロリットルの容量を使用してください。クロロホルムなどの適当な有機溶媒との総容量を調整します。 <ol><li>スライドガラス上の脂質混合物の総体積の半分を置き、すぐに均一な脂質フィルム（スライド全体に針2-3回の移動）を残すために洗浄シリンジ（ステップ2.6）を使用して、脂質を広げます。薄いITOコーティングへの損傷を避けるために穏やかに脂質フィルムを広げて（ただし迅速に）。不均一な拡散またはサブ最適につながる可能性が広がるラフ利回りまたはGUVsの計算異質。 </li><li>そのため、後の次のステップに進む前に広がる脂質フィルムを検査することにより、均一な広がりを確保します。フィルムの不透明度が過度に不均一に表示された場合は、新しいスライドを使用して手順をやり直し。 </li></ol></li><li>コー​​ティングされた側を上に向けてペトリ皿の内側コートスライドを置きます。 </li><li>別のITO被覆スライドを用いて混合物の残りの手順を2.6から2.9を繰り返します。 </li><li>有機溶剤の痕跡を除去するために、60から90分間、従来の真空乾燥室​​でスライドの両方を含むペトリ皿を置きます。 </li><li>このプロセスの間に、ヒートブロック（ほとんどの場合、65ºC）とプリ暖かい300mMのインキュベーター中のスクロースの溶液と同じ温度にインキュベーターを設定します。 </li><li>乾燥させた後、ベンチにペトリ皿を持参し、清潔な表面上にスライドガラスを配置します。 </li><li>静かに70％エタノールとドライそれのcompleを使用して、PDMSガスケット（ 図1）をきれいにtely。 </li><li> 図1に示すように、脂質コーティングされたガラススライド上に置き、ゆっくりとしっかりとガスケットは水密シールを形成するように押してください。 PDMSガスケットとスライドとの間にギャップが存在しないことを確認してください。これは、蔗糖液を保持している浅い室が形成されます。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig1.jpg" /> 図1：電鋳のために使用されるITO被覆ガラススライドのレイアウトは、 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54293/54293fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="16"><li>気泡のない予熱したショ糖溶液でチャンバーを埋めます。 </li><li>気密シールを作るために上に他のコーティングされたスライドを配置します。気泡がないことを確認してください。 図2に示すように、最終的な組み立てが表示されます。チャンバーusinを固定しますGバインダークリップ。 </li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig2.jpg" /> 図2：エレクトロフォーメーション室（側面図）の概略図 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54293/54293fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="18"><li>吸引により過剰のスクロースを取り外し、リントフリーワイプを使用してスライドを清掃してください。導電性の側面では、バーと均一に接触するように銅バーにスライドを固定します。ガラススライドの一方のみ導電側は1つの銅棒に接触していることを確認してください。 </li><li>ワニ口クリップを使用して、関数発生器の出力に銅バーを接続します。アセンブリが​​所望の温度に平衡化することを可能にするインキュベーターの内側にアセンブリを配置します。 </li><li> 10ヘルツの正弦波周波数と90分間、1 Vの電位差を適用します。 Ensur図3に示すように、電圧をマルチメータにより1 Vであるeが。90分間の処理を続行します。 </li></ol><img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig3.jpg" /> 図3：マルチメーターの電極は周波数と電流を測定するために配置された位置 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54293/54293fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="21"><li> 90分後、ゆっくりと2 Hzまでの周波数を減少させ、さらに10分間電鋳を続けます。この間、 インビトロ翻訳反応における収穫は（3.1から3.2ステップ）。 </li><li>関数発生器のスイッチをオフにし、アセンブリは（インキュベーターをオフにすると、わずかに開いたインキュベータのドアを残して）ゆっくりと室温まで冷却することができます。 </li><li>冷却した後、発電機にケーブルを外しスライドアセンブリから。 GUVsは非常に壊れやすいこと、したがって、非常に穏やかに処理する必要があります。慎重にベンチにアセンブリをもたらします。 </li><li>優しく鉗子を使用して、トップスライドを除去することにより、チャンバーを分解します。きれいなチューブにカット千μlの先端と転送を使用して、スクロースを含む懸濁液GUVsを収穫。 GUVsの破壊を防止するために、穏やかにチューブを扱います。 </li><li>すぐにGUVsを使用してください。室温で保存した場合GUVs収穫後少なくとも90分間安定です。 </li></ol> 3.収穫インビトロ翻訳反応<ol><li>チューブにマイクロピペットを用いて赤チャンバーから所望のタンパク質を含むインビトロ翻訳反応を収穫。 </li><li> 、凝集したタンパク質を除去卓上遠心機で15分間、16,200×gで溶解物をスピンし、慎重に別のチューブに上清を転送します。 </li></ol> 4. GUV結合アッセイ<ol><li>切断されたチップを用いて、5を混在1;チューブに翻訳されたタンパク質とGUVsの5μLを含むin vitro翻訳反応のリットルと2-3分間室温でインキュベートします。 </li><li>きれいなカバースリップ上の小さな穴（3-4ミリの直径）とPDMSシートを取り付け、静かに、しっかりとカバーガラスに対してそれを押すことによって、気密シールを確保します。 </li><li>小さな穴にステップ4.1から10μlの混合物を配置します。 </li><li>画像室温で反転エピまたは共焦点蛍光顕微鏡下で混合物。 注：蒸発を防止するために、撮像チャンバは、カバースリップで覆うことができます。 </li></ol>

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	<li>Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+in+support+of+RNA-mediated+inhibition+of+phosphatidylserine-dependent+HIV-1+Gag+membrane+binding+in+cells.">Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells.</a> J Virol. 87 (12), 7155-7159 (2013).</li><li>Chukkapalli, V., Oh, S. 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G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimerizable+HIV+Gag+derivative+binds+to+the+liquid-disordered+phase+in+model+membranes.">Multimerizable HIV Gag derivative binds to the liquid-disordered phase in model membranes.</a> Cell Microbiol. 15 (2), 237-247 (2013).</li><li>Carlson, L. A., Hurley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+of+the+ordered+assembly+of+the+endosomal+sorting+complex+required+for+transport+at+membrane-bound+HIV-1+Gag+clusters.">In vitro reconstitution of the ordered assembly of the endosomal sorting complex required for transport at membrane-bound HIV-1 Gag clusters.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (42), 16928-16933 (2012).</li><li>Gui, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+minimal+in+vitro+system+for+analyzing+HIV-1+Gag-mediated+budding.">A novel minimal in vitro system for analyzing HIV-1 Gag-mediated budding.</a> J Biol Phys. 41 (2), 135-149 (2015).</li><li>Prevost, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRSp53+senses+negative+membrane+curvature+and+phase+separates+along+membrane+tubules.">IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules.</a> Nat Commun. 6, 8529 (2015).</li></ol>

We declare that we have no conflicting interests.

上記のようにGUV結合アッセイは、他のタンパク質 - 脂質相互作用アッセイは、その限界を持っているシナリオでは良い代替手段を提供します。このアッセイは、私たちは、脂質二重層の文脈における天然の長さのアシル鎖を有するミリストイル化​​完全長Gagおよび酸性脂質間の相互作用を検討およびGag-脂質の高密度ショ糖勾配または他のポスト結合処理により長い浮上遠心分離することな...

ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）は、組み立ておよび大部分の細胞型における原形質膜（PM）から芽エンベロープウイルスです。 HIV-1ウイルス粒子のアセンブリは、Pr55 ギャグ （GAG）と呼ばれる55 kDaのウイルスコアタンパク質によって駆動されます。ギャグは、4つの主要な構造ドメイン、すなわち、マトリックス、カプシド、ヌクレオカプシド、およびP6、ならびに2のスペーサーペプチドSP1およびSP2で構成される前駆体ポリタンパク質として合成されます。組み立て中、マトリックス（MA）ドメインは、組立現場にギャグのターゲティングのために責任がある、カプシド（CA）ドメインはギャグ・ギャグの相互作用を媒介する、ヌクレオカプシド（NC）ドメインは、ウイルスゲノムRNAを募集し、p6の新兵の宿主因子を助けます原形質膜からのウイルス粒子の切断。 GAGはまた、N末端に14炭素脂肪酸またはミリスチン部分の添加により、共翻訳後修飾を受けます。 ギャグの結合膜はメートル以来、ウイルスのアセンブリのために不可欠な要件でありますウイルス粒子を産生しない膜結合に欠陥があるutants。我々と他の人はギャグの結合膜はMAドメイン内の二部の信号によって媒介されることが示されている：脂質二重層や高塩基性領域（と呼ばMAドメイン内の塩基性残基のクラスターとの疎水性相互作用を媒介N末端ミリスチン酸部分PM 1-4上の酸性脂質と相互作用HBR）。ポリリン酸化イノシチド5-ホスファターゼIV（5ptaseIV）、PM-特定の酸性リン脂質ホスファチジルの加水分解を触媒する酵素の異所性発現を使用してギャグ-膜の相互作用の研究（4,5）-bisphosphate [PI（4,5）P 2]ホスファチジルイノシトール-4-ホスフェートに、細胞中のGag-PMの局在をPI（4,5）P 2 3,5によって媒介されることを示唆しました。しかし、in vitroでの研究はギャグ-PI（4,5）Pの複数のメカニズムの詳細を理解することを目指して2相互作用は、多くの理由のために挑戦することが証明されています。ために生化学的実験のために、例えば、完全長ミリストイル化​​HIV-1の精製ギャグが原因精製中に凝集するギャグの傾向に少なくとも部分的には技術的に困難でした。したがって、このようなマイア-MAまたはマイア-MA-CA、または非ミリストイル化形態のようなHIV-1のGagの切断型は、しばしばギャグ精製（ 例えば 、核磁気共鳴、タンパク質フットプリント、および表面を必要とする研究で使用されていますプラズモン共鳴6-9）。あるいは、 インビトロ転写-翻訳反応において結合された他の生化学的研究1,2-における全長ミリストイル化HIV-1のGagを生成するために使用されてきました。典型的には、このシステムでは、ギャグをコードするプラスミドは、任意の細胞膜とメッセンジャーRNAを欠いているが、転写および翻訳のための機械が含まれている真核生物の細胞溶解物（ 例えば 、ウサギ網状赤血球溶解物）で転写および翻訳されます。反応後、ギャグを含む細胞溶解物を私と一緒に混合されます脂質とギャグの相互作用を分析するためのmbranes。ギャグミリストイル全長の調製の容易さに加えて、in vitro転写翻訳系を使用する方法は、GAG合成およびその後の膜結合反応は、より良い生理的条件を表すことができる「真核生物の細胞質ゾルのような」環境で発生するという利点を有します。このプロパティは、MAドメインに結合したRNA分子は競合的1,2,10-12に酸性脂質に結合するギャグを調節することを示した研究に貢献しました。これらの細胞溶解物で得られたGagタンパク質の合計量は高くないので、放射性標識アミノ酸を有するタンパク質の代謝標識は、それらの検出のために必要です。 ギャグ - 脂質相互作用を測定する方法に依存して、膜調製物の様々な使用されてきました。これらの各メソッドは、その長所と短所があります。ほとんどのNMRベースのアッセイは、短いアシルと脂質の使用を必要とします水溶性である鎖（ 例えば 、C4-およびC8-PI（4,5）P 2）6,8。細胞に見られる長いアシル鎖を有する脂質へのギャグの結合を試験するためのNMR法が開発されているが、それらはこれまで8,13のみミリストイルまたはnonmyristoylated MAで使用されています。あるいは、天然の長さのアシル鎖を有する脂質から調製されたリポソームは、リポソーム浮遊または蛍光リポソームビーズ結合アッセイ2,3,10,14-16などの生化学的方法に使用されてきました。しかしながら、これらのアッセイにおいて使用されるリポソームは、小さな直径を有し、従って、それらの膜は、急な正の曲率を有しています。対照的に、HIV-1感染細胞における粒子アセンブリの初期段階の間、ギャグほぼたGagの規模で平坦であるPMに結合し、続いて出芽中負の曲率を誘導します。そのため、急な正の曲率を有するリポソーム膜はギャグ - 脂質相互作用を研究するための理想的な脂質二重層ではないかもしれません。リポソームFLOTについてエーションアッセイ、別の潜在的な注意点は、実験結果に影響を与える可能性が遠心分離中高張ショ糖勾配にギャグ脂質複合体の露出があります。これらの制限を緩和し、補完的な実験システムを提供すること、ギャグ巨大単層小胞（GUVs）への結合についてのアッセイは、近年開発されてきました。 GUVsは、その直径が数十μmまで延びる単一の脂質二重層小胞です。したがって、これらの膜の曲率は、ギャグの規模でPMに似ています。また、原因光学顕微鏡下で目視検査を可能にし、その大きなサイズに、混合時にこれらの小胞への蛍光タグ付きまたは標識Gagタンパク質を結合膜が容易にギャグ - 脂質複合体のその後の処理を行わずに決定することができます。 ここではエレクトロフォーメーション法から得られたGUVsを使用して結合HIV-1のGag膜を研究するためのプロトコルについて説明します。このような穏やかな水和、ゲルアシスト水和、マイクなどの様々な方法rofluidic噴射、及び電鋳17-22 GUVsを取得するために使用されてきました。ここで説明されたプロトコルのために、エレクトロフォーメーション法は、高価なセットアップを必要とせずに、酸性脂質およびその使用比較的容易にGUVsを形成する際に、その効率の主に使用されます。ギャグの可視化は、蛍光レポーターを必要とするので、黄色蛍光タンパク質（YFP）は、遺伝的にギャグ（GAG-YFP）のC末端に付加されています。ギャグ-YFPタンパク質は連続交換-連続フロー（CECF）技術に基づいた小麦胚芽溶解物におけるインビトロ転写および翻訳反応によって得られます。この技術では、反応は、反応基質およびエネルギー成分の供給の阻害副産物の両方の除去は、透析に基づく機構で達成されます。これらの反応のために、T7プロモーターの制御下のGag-YFPをコードするプラスミドを用いています。先に示したように注目すべきは、小麦胚芽溶解物は、追加のコンポーネント2なしミリストイル化をサポート3,24。この方法を使用して、GUV膜24上のGagの可視化のためのGag-YFPミリストイル全長の十分な量を得ることができました。ここでは、PIに結合したGag（4,5）P 2を含むGUV膜が結合反応、次の長い以降の処理を行うことなく検査し、この方法はギャグ-膜結合アッセイを既存の補完とすることができることを提案することができるHIV-1でのプロトコルを記述しますさらに、HIV-1のGag-膜結合を理解するように拡張。

<table><tbody><tr><td>Digital Multimeter</td><td>Meterman</td><td>30XR</td><td>A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose.</td></tr><tr><td>Function Generator</td><td>Instek</td><td>GFG-8216A</td><td>A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10 Hz and 1 V is sufficient.</td></tr><tr><td>ITO coated glass slides</td><td>Delta Technologies, Loveland, CO</td><td>CG-90IN</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Hoefer</td><td></td><td>Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient</td></tr><tr><td>Vacuum chamber</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Hamilton</td><td>80400</td><td>Gauge 22S, Syringe number 702</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning</td><td>Sylgard, 184</td><td></td></tr><tr><td>RTS 100 Wheat Germ CECF Kit</td><td>BiotechRabbit,&lt;br/&gt; Berlin, Germany</td><td>BR1401001</td><td></td></tr><tr><td>DiD</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA&amp;nbsp;</td><td>D7757</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL&amp;nbsp;</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>POPS</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840034C</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700041P</td><td></td></tr><tr><td>Brain-PI(4,5)P&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840046X</td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of hiv-1 gag binding to giant unilamellar vesicle (guv) membranes

HIV-1の構造タンパク質、Pr55 のGag（またはギャグ）は、ウイルスの組立プロセス中に細胞内で原形質膜に結合します。ギャグの膜結合は、ウイルス粒子産生の重度の障害でギャグ膜結合結果の欠陥以来、ウイルス粒子形成に必須の工程です。ギャグ脂質膜との相互作用のメカニズムの詳細は、NMRに基づくインビトロ方法を得るために、タンパク質フットプリント、表面プラズモン共鳴、リポソーム浮遊遠心分離、又は蛍光脂質ビーズ結合は、これまで開発されてきました。しかし、これらのin vitroの方法の各々は、その限界を有します。これらの制限の一部を克服し、以前に確立された方法に相補的なアプローチを提供するために、我々は、 インビトロアッセイを開発したHIV-1 Gagおよび脂質膜との相互作用」とは、細胞のような」環境で行われます。このアッセイでは、脂質膜に結合したGag目視YFP-taggeを用いて分析しますDのギャグは、電鋳技術により調製インビトロ翻訳システムとGUVs に小麦ベースの胚芽で合成します。ここでは、アッセイのために必要なミリストイル化​​完全長Gagタンパク質とGUV膜を得るために、およびGag-GUVは顕微鏡によって結合を検出するために、背景とプロトコルについて説明します。

<html>上記のプロトコルを使用して、我々は、POPC + POPS +チョルから成るGUVsを用意し（モル比：4.66：2.33：3）。この組成物は、約PMのPSおよびコレステロール濃度を反映するために選ばれました。ギャグの堅牢かつ効率的な結合は、脳-PI（4,5）P 2は、POPC + POPS + Cholの混合物（POPC + POPS +チョル+脳-PI（4,5）P 2 [モル比に含まれていた場合にのみ観察されまし?...

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Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

巨大単層ベシクル（GUV）膜への結合HIV-1のGagの可視化

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

visualization-hiv-1-gag-binding-to-giant-unilamellar-vesicle-guv

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

8.8K ビュー.  University of Michigan Medical School. We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. 

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Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

HIVとライブ共焦点顕微鏡の蛍光クローンを使用して、HIVの可視化細胞間伝達

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

免疫・感染学

Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) <a href="http://www.usaid.gov">(www.usaid.gov)</a>. The virus infects and destroys CD4+ T-cells thereby crippling the immune system, and causing an acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) 2. Infection begins when the HIV Envelope glycoprotein "spike" makes contact with the CD4 receptor on the surface of the CD4+ T-cell. This interaction induces a conformational change in the spike, which promotes interaction with a second cell surface co-receptor 5,9. The significance of these protein interactions in the HIV infection pathway makes them of profound importance in fundamental HIV research, and in the pursuit of an HIV vaccine.
The need to better understand the molecular-scale interactions of HIV cell contact and neutralization motivated the development of a technique to determine the structures of the HIV spike interacting with cell surface receptor proteins and molecules that block infection. Using cryo-electron tomography and 3D image processing, we recently demonstrated the ability to determine such structures on the surface of native virus, at &tilde;20 &Aring; resolution 9,14. This approach is not limited to resolving HIV Envelope structures, and can be extended to other viral membrane proteins and proteins reconstituted on a liposome. In this protocol, we describe how to obtain structures of HIV envelope glycoproteins starting from purified HIV virions and proceeding stepwise through preparing vitrified samples, collecting, cryo-electron microscopy data, reconstituting and processing 3D data volumes, averaging and classifying 3D protein subvolumes, and interpreting results to produce a protein model. The computational aspects of our approach were adapted into modules that can be accessed and executed remotely using the Biowulf GNU/Linux parallel processing cluster at the NIH <a href="http://biowulf.nih.gov">(http://biowulf.nih.gov)</a>. This remote access, combined with low-cost computer hardware and high-speed network access, has made possible the involvement of researchers and students working from school or home.

The protocol describes a high-throughput approach to determining structures of membrane proteins using cryo-electron tomography and 3D image processing. It covers the details of specimen preparation, data collection, data processing and interpretation, and concludes with the production of a representative target for the approach, the HIV-1 Envelope glycoprotein. These computational procedures are designed in a way that enables researchers and students to work remotely and contribute to data processing and structural analysis.

低温電子断層撮影と自動化されたサブ断層アベレージングを使用して、HIVエンベロープ糖タンパク質の分子構造の決定

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

合成脂質二重膜上でHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスとシグナリングのイメージング

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

細胞ベースのELISAアッセイを使用して、HIV-1エンベロープ糖タンパク質三量体の構造評価

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.

HIV-1に感染したライブ初代ヒトマクロファージで測定ファゴソームの移行と速度

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

A High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. An HIV-1 reporter virus (HIV-1 Gag-iCre) is generated by inserting Cre recombinase into the HIV-1 genome between the matrix and the capsid proteins of the Gag polyprotein. This results in a packaging of Cre recombinase into virus particles, which is then released into a target cell line stably expressing a Cre recombinase-activated red fluorescent protein (RFP) to GFP switch cassette. In the basal state, this cassette expresses RFP only. Following the delivery of Cre recombinase into the target cell, the RFP, flanked by loxP sites, excises, resulting in GFP expression. This assay can be used to test any inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems and has been used to identify a class of purinergic receptor antagonists as novel inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion.

We describe a cell-based assay to report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein detectable by flow cytometry or fluorescence microscopy. It can be used to test inhibitors of viral entry (specifically at the fusion step) in cell-free and cell-to-cell infection systems.

高スループットの Cre Lox 活性化ウイルスの膜融合アッセイの HIV-1 ウイルス膜融合阻害剤を識別するために

This assay is designed to specifically report on HIV-1 fusion via the expression of green fluorescent protein (GFP) detectable by flow cytometry or ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

蛍光によるウイルスRNAの検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

生物学

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs)

Robust in vitro investigations of the structure and function of integral membrane proteins has been a challenge due to the complexities of the plasma membrane and the numerous factors that influence protein behavior in live cells. Giant unilamellar vesicles (GUVs) are a biomimetic and highly tunable in vitro model system for investigating protein-membrane interactions and probing protein behavior in a precise, stimulus-dependent manner. In this protocol, we present an inexpensive and effective method for fabricating GUVs with the human serotonin 1A receptor (5-HT1AR) stably integrated in the membrane. We fabricate GUVs using a modified hydrogel swelling method; by depositing a lipid film on top of a mixture of agarose and 5-HT1AR and then hydrating the entire system, vesicles can be formed with properly oriented and functional 5-HT1AR incorporated into the membrane. These GUVs can then be used to examine protein-membrane interactions and localization behavior via microscopy. Ultimately, this protocol can advance our understanding of the functionality of integral membrane proteins, providing profound physiological insight.

Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors GPCRs

This protocol utilizes agarose swelling as a powerful and generalizable technique for incorporating integral membrane proteins (IMPs) into giant unilamellar lipid vesicles (GUVs), as described here for the reconstitution of the human 1A serotonin receptor protein (5-HT1AR), one of the classes of pharmacologically important G protein-coupled receptors.

Gタンパク質共役受容体(GPPC)を組み込んだモデル脂質膜の構築

Robust in vitro investigations of the structure and function of integral membrane proteins has been a challenge due to the complexities of the plasma ...

生物工学

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many different proteins associate with curved membranes because of their ability to sense or induce membrane curvature. Typically, these processes involve a multitude of proteins making them too complex to study quantitatively in the cell. We describe a protocol to reconstitute a curved membrane in vitro, mimicking a curved cellular structure, such as the endocytic neck. A giant unilamellar vesicle (GUV) is used as a model of a cell membrane, whose internal pressure and surface tension are controlled with micropipette aspiration. Applying a point pulling force on the GUV using optical tweezers creates a nanotube of high curvature connected to a flat membrane. This method has traditionally been used to measure the fundamental mechanical properties of lipid membranes, such as bending rigidity. In recent years, it has been expanded to study how proteins interact with membrane curvature and the way they affect the shape and the mechanics of membranes. A system combining micromanipulation, microinjection, optical tweezers, and confocal microscopy allows measurement of membrane curvature, membrane tension, and the surface density of proteins, concurrently. From these measurements, many important mechanical and morphological properties of the protein-membrane system can be inferred. In addition, we lay out a protocol of creating GUVs in the presence of physiological salt concentration, and a method of quantifying the surface density of proteins on the membrane from fluorescence intensities of labeled proteins and lipids.

Many proteins in the cell sense and induce membrane curvature. We describe a method to pull membrane nanotubes from lipid vesicles to study the interaction of proteins or any curvature-active molecule with curved membranes in vitro.

巨大リポソームの膜カーボンナノ チューブを引っ張ってください。

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that enable sensitive and simultaneous labeling of viral nucleic acid and protein. Conventional DNA fluorescence in situ hybridization (FISH) methods are often not compatible with immunostaining. We have therefore developed an imaging approach, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA and protein), which enables simultaneous single-cell visualization of DNA, RNA, and protein. Compared to conventional DNA FISH, MICDDRP utilizes branched DNA (bDNA) ISH technology, which dramatically improves oligonucleotide probe sensitivity and detection. Small modifications of MICDDRP enable imaging of viral proteins concomitantly with nucleic acids (RNA or DNA) of different strandedness. We have applied these protocols to study the life cycles of multiple viral pathogens, including human immunodeficiency virus (HIV)-1, human T-lymphotropic virus (HTLV)-1, hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), Zika virus (ZKV), and influenza A virus (IAV). We demonstrated that we can efficiently label viral nucleic acids and proteins across a diverse range of viruses. These studies can provide us with improved mechanistic understanding of multiple viral systems, and in addition, serve as a template for application of multiplexed fluorescence imaging of DNA, RNA, and protein across a broad spectrum of cellular systems.

Presented here is a protocol for a fluorescence imaging approach, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), a method capable of simultaneous fluorescence single-cell visualization of viral protein and nucleic acids of different type and strandedness. This approach can be applied to a diverse range of systems.

ウイルスの核酸とタンパク質を視覚化し、HIV、HTLV、HBV、HCV、ジカウイルス、インフルエンザ感染を監視するためのシングルセルマルチプレックス蛍光イメージング

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that ...

巨大単層ベシクル（GUV）膜への結合HIV-1のGagの可視化

要約

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HIVとライブ共焦点顕微鏡の蛍光クローンを使用して、HIVの可視化細胞間伝達

低温電子断層撮影と自動化されたサブ断層アベレージングを使用して、HIVエンベロープ糖タンパク質の分子構造の決定

合成脂質二重膜上でHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスとシグナリングのイメージング

細胞ベースのELISAアッセイを使用して、HIV-1エンベロープ糖タンパク質三量体の構造評価

HIV-1に感染したライブ初代ヒトマクロファージで測定ファゴソームの移行と速度

高スループットの Cre Lox 活性化ウイルスの膜融合アッセイの HIV-1 ウイルス膜融合阻害剤を識別するために

蛍光によるウイルスRNAの検出

Gタンパク質共役受容体(GPPC)を組み込んだモデル脂質膜の構築

巨大リポソームの膜カーボンナノチューブを引っ張ってください。

ウイルスの核酸とタンパク質を視覚化し、HIV、HTLV、HBV、HCV、ジカウイルス、インフルエンザ感染を監視するためのシングルセルマルチプレックス蛍光イメージング

巨大単層ベシクル（GUV）膜への結合HIV-1のGagの可視化

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HIVとライブ共焦点顕微鏡の蛍光クローンを使用して、HIVの可視化細胞間伝達

低温電子断層撮影と自動化されたサブ断層アベレージングを使用して、HIVエンベロープ糖タンパク質の分子構造の決定

合成脂質二重膜上でHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスとシグナリングのイメージング

細胞ベースのELISAアッセイを使用して、HIV-1エンベロープ糖タンパク質三量体の構造評価

HIV-1に感染したライブ初代ヒトマクロファージで測定ファゴソームの移行と速度

高スループットの Cre Lox 活性化ウイルスの膜融合アッセイの HIV-1 ウイルス膜融合阻害剤を識別するために

蛍光によるウイルスRNAの検出

Gタンパク質共役受容体(GPPC)を組み込んだモデル脂質膜の構築

巨大リポソームの膜カーボンナノ チューブを引っ張ってください。

ウイルスの核酸とタンパク質を視覚化し、HIV、HTLV、HBV、HCV、ジカウイルス、インフルエンザ感染を監視するためのシングルセルマルチプレックス蛍光イメージング

巨大リポソームの膜カーボンナノチューブを引っ張ってください。