This project was supported by Midwestern University, IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) and Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).

1. HSV株及び取扱い注：組換え非拡散HSV-1（KOS）gL86およびHSV-2（KOS）333gJを- V. Twiari 36,37によって提供された使用β-ガラクトシダーゼレポーター活性を有します。 <ol><li> 1で-80℃での単一のロットとストアからウイルスを使用してください：20％ウシ胎児血清（FBS）とダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の1の比率、使用するまでスキムミルク。ウイルスロット保存前、 入出力 -nitrophenyl-β-D-ガラクトピラノシド（ONPG）および5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-ガラクトピラノシド（X-GAL）アッセイによりウイルス濃度を決定します。 </li><li>前述のように、レポーターウイルス侵入アッセイを使用して各実験アッセイの実行のためのX-Gal染色により、感染のウイルス生存率および多重度（MOI）を決定する（ 図1）14。 </li><li>希望のMOIに（オプトMEM）のウイルスを希釈します。染色の前に、単層（/ウェル0.5ミリリットルパラホルムアルデヒド）を修正しました。別々のmicroti中のウイルスの生存能力のコントロールを配置複数菌アッセイプレートと平行にタープレート。 </li></ol> 2.のHeLa 299細胞の取扱い<ol><li> 4.5g / Lグルコース、10％熱不活化ウシ胎児血清（FBS）、ゲンタマイシン（50μg/ ml）およびL-グルタミンを含むDMEM中で37℃、5％CO 2で成長します。トリプシン溶液で80％コンフルエンスで継代細胞（エチレンジアミン四酢酸、0.53 M EDTA、0.05％トリプシン; 5ミリリットル/フラスコ）。 </li></ol> 3. C.取り扱いアルビカンス 注：C.臨床検査源から得アルビカンス媒体約2倍のスキムミルクRemmelに-80℃で保存します。 <ol><li>文化はサブローデキストロース培地（37℃）に株式を凍結しました。 24時間のサブカルチャーC.後Fungisel媒体へアルビカンス （37°C、48時間）の使用のため。 </li><li>発芽管（GT）の形を生成（; 3ミリリットルFBSを、代表的なコロニーを選ぶ3時間、37℃、腹筋600、0.3）。インキュベーション後、GT洗浄（HBSSを、2倍、4,000×gでの）。 （37＆温めHBSSに洗浄GTを追加します。＃176; C; 0.32のAbs 600）。 GT形態は、血球計数によって決定されるように観察された細胞の99％であるべきです。 </li><li>代表Fungiselコロニーピッキングによって酵母形（YF）株式懸濁液を作る（HBSS、3ミリリットルを、0.32のAbs 600）。 /微視的に血球計数器を使用して、mlのYFのフォームの数をカウントします。 YF形態は、血球計数によって決定されるように観察された細胞の99％であるべきです。 </li><li>作業の真菌株（; 37℃; 10 5 CFU / mlの25ミリリットルHBSS中のGTまたはYF株式の250μl）を作ります</li></ol> 4. S.球菌取り扱い<ol><li>ストアS.黄色ブドウ球菌 ATCC 25923（-80°C; Remmelは牛乳の2倍を脱脂）。ヒツジ血液寒天培地（; 37℃、24時間、5％）上に培養。代表的なコロニーを選択し、株式のために2日以内に培地塩をマンニトールへの転送（37℃、18時間）。 </li><li> S.を作ります黄色ブドウ球菌ストック懸濁液（3ミリリットルHBSS; 1.32腹筋600; 10 8 CFU / ml）を<ol><li> S.作業してください黄色ブドウ球菌株（100μlの25ミリリットルのHBSSの株式の。 10 5 CFU / mlで）。 </li></ol></li></ol> 5. カンジダとS.球菌懸濁液<ol><li>メイク混合C.アルビカンスおよびS.黄色ブドウ球菌懸濁液（250μlのYFまたはGTの株式と25ミリリットルHBSS中の100μlの黄色ブドウ球菌株 ）。 </li></ol> 6.複数菌バイオフィルムアッセイ<ol><li> 2×10 5 HeLa細胞/ mlの200μlの（85％のコンフルエンスのレベル）でシード96ウェルプレート。ロックプレート（30から45分、37℃）インキュベーション前（37℃、5％CO 2インキュベーター; 18時間）。ウォッシュ単層（1×;オプトMEM）をHSVにシード（HSV-1（KOS）gL86またはHSV-2（KOS）33 GJ - 100μl中のOpt-MEM; MOI 50及び10）。プレートをインキュベート（3時間、37℃、5％CO 2）。 1日に1回だけウイルス株を使用してください。 </li><li>感染した単層（; Mgの2及びCa 2を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）;100μlの1×）で洗浄します。 25＆＃残し暖かいHBSSでPBSを交換してください181;各ウェルのリットル。 <ol><li> YF、GTおよび/ ​​またはSを追加します。 表1に示されるように平板培養する（静的に、30分間、37°C、5％CO 2） 黄色ブドウ球菌ワーキング懸濁液（N = 16; 1、100μlの細胞比の目標= 5）。 </li></ol></li><li>インキュベーション後、一度に吸引1列には、すぐにマグネシウム2およびCa +2で300μlのPBSで再充填します。ラジオ免疫沈降アッセイ溶解バッファー（;濾過滅菌; 1:50希釈の200μlのRIPA）を追加し二回、この手順を繰り返します。 </li><li>急速にHeLa細胞溶解物は、次いでマンニトール塩（MS）及び/又はFungisel（F）培地（ 図2）の上に50μlのを配置し粉砕します。 90°の角度でガラス棒を曲げを使用して溶解液を広げます。 （37℃で18時間）培養します。手動でプレートあたりのコロニー数をカウントします。コントロールは、Sから成り黄色ブドウ球菌および/ ​​またはC. HSV-非感染HeLa細胞へアルビカンス付着 。 </li></ol> 7.イメージング研究&lt;/ P&gt; <ol><li>各ラウンドガラスカバースリップを洗ってください（12ミリメートル、50ミリリットルのアセトンミリリットルビーカー100中）。乾燥及び滅菌カバースリップ（キムワイプ;ガラスシャーレ）。アルコール火炎滅菌鉗子で滅菌24ウェルプレートのウェルに、乾燥、滅菌カバースリップを置きます。 </li><li>洗浄滅菌ラウンドガラスカバースリップを含む24ウェルプレートのウェルに、HeLa細胞（96ウェルプレートに使用される5倍の体積1ミリリットル）を追加します。上記の手順6.4に6.2.1で説明したように、その後インキュベートし、プロセス、5×96ウェルプレートに使用する音量でテンプレート（表2）によれば、ウイルス、細菌および真菌を追加します。 </li><li>最終洗浄後、メタノールでスライドをフラッディングし、それを蒸発させることにより、顕微鏡検査のために細胞を固定します。染色まで室温でプレートを保管してください。 </li><li>明視野顕微鏡（1,000倍、最終的な元の倍率）のために脱イオン水でメタノール固定カバースリップを含むウェルを埋めます。すぐに水を吸引。グラムクリスタルバイオレットで各カバースリップをカバー。ウォッシュは、非結合染色（脱イオン水）の自由カバースリップ。 その場で乾燥したカバースリップは、その後、標識されたスライドにメディアをマウントハードセット（図3）とそれらを接着します。 </li><li>蛍光顕微鏡（100倍の対物; 1,000倍、最終的な元の倍率）のためにステップ7.4で説明したように、洗浄は、基本的にメタノールの自由カバースリップ。ウェル中のカバースリップを乾燥させます。 <ol><li>乾燥させた後、カバースリップを削除し、ラベルされたスライド上に置きます。 （ - 5μL1）次に、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合単純ヘルペスウイルスのタイプの1：20希釈のカバースリップをカバーするために1 + 2のgD抗体を十分な量を追加します。 </li><li> 30分間、37℃で湿気チャンバー内でスライドをインキュベートします。インキュベーション後、PBSの4変化​​でカバースリップを洗います。 </li><li>最終洗浄後、標識されたスライドにカバースリップを返します。 4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（;湿度室、30分間、37°C​​ DAPI）で染色。インキュベーション後4ちゃんにカバースリップを洗いますPBSのGESは、その後、メディアをマウントハードセットで標識されたスライドに貼り付けます。 </li><li>マウンティング培地は暗所で室温で24時間硬化させます。 FITCおよびDAPIカットオフフィルターで明視野顕微鏡や蛍光顕微鏡のいずれかで油浸対物レンズの下にカバースリップを調べます。共局在（ 図4）のために少なくとも50フィールド（生物ごとに最低100個の細胞）の写真を調べます。 </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

現在のところ情報は、原核生物、真核生物およびウイルスの複数の分類学上のドメイン、 すなわち 、交差ホストmicrobiomeの半永久的なメンバーに永久の間の複雑な相互作用に利用できません。したがって、我々はSでバイオフィルムの開始を研究するためのインビトロモデルシステムで小説を開発しましたaureusおよびC. HSV-1またはHSV-2上アルビカンス?...

<html>人間microbiomeは、体内の地理的領域を共有する複数の分類学上の王国からの多様な生物が含まれます。細胞表面への付着はmicrobiomeの植民地化プロセスの一部であるバイオフィルム形成に不可欠な最初のステップです。 microbiomeに含まれては、慢性かつ持続的な感染症を引き起こすウイルスであることができます。これらのウイルスによる慢性細胞感染は推定受容体の可用性における変化を引き起こす可能性があります。また1,2、細胞内病原体による細胞エントリも順番に細菌や真菌などの他のmicrobiomeメンバーの添付ファイルを、変更することができるホスト膜流動性/疎水性に影響を与える可能性があります。ヒト宿主の同じ地域に共局在これらの複数の病原体との間で発生する可能性があります相互作用を理解するために、我々は、粘膜表面に存在する分類学上の王国のスペクトルを表し、病原体の相互作用を研究することができなければなりません。 tは&quot;&gt;ヘルペスウイルスはmicrobiome 3,4の永久的なメンバーとしてのヒトの100％に存在する微生物のファミリーである。加えて、それらはまた、永続的両方の症状の存在下および非存在下で流すことができる。具体的には、単純ヘルペスウイルス1および単純ヘルペスウイルス2（HSV-1およびHSV-2、それぞれ）HSV-1およびHSV-2の原因の歯肉口内炎の両方、免疫適格個体で。oronasopharynx及び生殖管におけるmicrobiomeの永久的なメンバーであるだけでなく、性器ヘルペス5-8。これらのサイトでは、HSVは、慢性持続nectins、ヘパラン硫酸、脂質ラフトとヘルペスウイルスエントリーメディエーターの表面発現の変化における細胞の結果にHSVの9。エントリを流しウイルス無症候性/腫瘍壊死によって特徴づけ潜伏感染を引き起こします因子受容体（HVEM / TNFR）10月25日 。これらは、潜在的に日和見病原体ながら、いくつかの細菌および真菌のための共有の受容体を表す例えば黄色ブドウ球菌およびカンジダ・アルビカンス、これ、またoronasopharynx 26,27の粘膜microbiomeのメンバーとして常駐することができます。 oronasopharynx S.内aureusおよびC.アルビカンスは植民地化のの2つの異なる部位を占めます。天然歯を持つホストでは、口腔粘膜は、HSV-1およびCによって共有されていますアルビカンス、前部鼻鼻孔はS.によって占有されている間黄色ブドウ球菌 28。しかし、にもかかわらず、in vitroでの知見そのS.黄色ブドウ球菌は、口腔上皮細胞に付着し、29,30 S.正常組織29,30存在する場合球菌はまれ経口標本から単離されます。リトルは、臨床所見ものを超える生殖管の共同植民地化のニッチについて知られているS.黄色ブドウ球菌は C.ながら、性器の炎症、放電および性交疼痛症によって特徴づけられる、好気性膣炎に関連していますアルビカンスは、口腔31〜35で観察されたものと同様の粘膜の病変を生成します。このように、経口および生殖器microbiのこれらのメンバーが、分類学的王国少しOMEクロスは、宿主細胞表面5への接着を介してバイオフィルムの形成を開始することが影響能力としてのそれらの相互作用について知られています。このプロトコルは、効果的に、共コロニー形成/感染の機能的結果を判定するために適用されています。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;C.albicans&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BBL Sabouraud Dextrose</td><td>BD</td><td>211584</td><td></td></tr><tr><td>Fungisel Agar</td><td>Dot Scientific</td><td>7205A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;S.aureus&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mannitol Salt Agar</td><td>Troy Biologicals</td><td>7143B</td><td></td></tr><tr><td>Sheep blood agar</td><td>Troy Biologicals</td><td>221239</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Hela cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x DMEM (Dubelcco&#039;s Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin 50 mg/ml</td><td>Sigma</td><td>1397</td><td>50 &amp;micro;g/ml final concentration in the complete DMEM</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53 M EDTA)Solution 1x</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>10% final concentration in the complete DMEM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other medium and reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Thermo Scientific</td><td>34055</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Pure X gal</td><td>Invitrogen</td><td>15520-018</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS (Hanks&#039; Balanced Salt Solution)</td><td>Corning</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Dot Scientific</td><td>30042-500</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lysis</td><td>Life Technologies</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A433P-4</td><td></td></tr><tr><td>HSV 1&amp;amp;2, specific for gD</td><td>ViroStat</td><td>196</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D8417-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Gram Crystal Violet</td><td>Troy Biologicals</td><td>212527</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 100 x 15</td><td>Dot Scientific</td><td>229693&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 150 x 15</td><td>Kord Valmark</td><td>2902</td><td></td></tr><tr><td>96-Well plates</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8030-01F</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8044-01F</td><td></td></tr><tr><td>Culture tubes 100 x 13</td><td>Thomas Scientific</td><td>9187L61</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip circles, 12 mm</td><td>Deckglaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr></tbody></table>

determination of biofilm initiation on virus-infected cells by bacteria and fungi

真菌、細菌やウイルスを含む分類学上の王国全体で複数菌相互作用の研究は、以前microbiomeのウイルスのメンバーは、これらのウイルスに感染した宿主細胞とそれに続く微生物相互作用をどのように影響するかに関して検討されていません。細菌および真菌とのウイルスの共居住は、主に口腔及び生殖管の粘膜表面上に存在します。粘膜細胞、持続性の慢性または持続性ウイルス潜伏感染症、特にものは、発現された受容体の数とタイプでウイルス改変を通じてmicrobiomeのメンバーに重大な影響を与える可能性があります。宿主細胞膜のアーキテクチャの変更は、バイオフィルム形成の最初のステップを開始するための正常細菌叢と日和見病原体のその後のメンバーの変更された能力、 すなわち 、密着性をもたらすであろう。この研究は、biofilの開始時にHSVの効果の定量化および目視検査のための方法を説明しS.のm個の形成（付着） aureusおよびC.アルビカンス 。

このレポートに記載されているシステムから得られるデータの堅牢性のレベルは、 図2のaf 38に示されています。このシステムを使用することによりウイルス感染細胞や互いの密着性に及ぼす影響とブドウ球菌と真菌の相互作用の変調が描写することができます。多菌相互作用が同じ細胞で発生しているかどうかを決定するために、 図3</stron...

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Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

細菌や真菌によってウイルス感染細胞上のバイオフィルムの開始の決意

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

determination-biofilm-initiation-on-virus-infected-cells-bacteria

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.6K ビュー.  Midwestern University. A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

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Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

S. cerevisiaeの接着と寒天の侵略のためのアッセイ

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

生物学

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

細菌性病原体によるヒト細胞の浸潤

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

免疫・感染学

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

研究のための方法論<em&gt; B。枯草菌</em小分子バイオフィルム阻害剤を特徴付けるためのモデルとしての&gt;バイオフィルム

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオ フィルム形成の可視化

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic matter, as well as regulation of nutrient levels. There they also find numerous opportunities to interact with a variety of other microbes such as bacteria or other fungi. Studying fungal interactions at the cellular level, however, can be challenging owing to the black box-like nature of soil. New microfluidic tools are being developed for the study of fungal interactions; two platforms designed to study bacterial-fungal and fungal-fungal interactions are highlighted. Within these microchannels, fungal-microbial interactions can be monitored in controlled physico-chemical environments at higher temporal and spatial resolution than previously possible. Application of these tools have yielded numerous novel biological insights, such as the observation of bacterial polar attachment to hyphae or revealing uncharacterised fungal-fungal antagonisms. A key feature of these methodologies regards the ease of use of this tool by non-experts, yielding highly translatable technologies for use in microbiology labs.

Owing to the opacity of soil, interactions between its constituent microbes cannot easily be visualised with cellular resolution. Here, two microfluidic tools are presented, which offer new opportunities for investigating fungal-microbial interactions. The devices are versatile and simple to use, enabling high spatiotemporal control and high-resolution imaging at the cellular level.

細胞レベルで真菌 - 微生物相互作用をプロービングするためのマイクロ流体ツール

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

生物工学

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their nature would be beneficial in facilitating their characterization. Currently, most studies focus only on one specific characterization method; however, the isolation and identification of microorganisms from the host is a continuous process and usually requires several combinatorial characterization methods. Herein, we describe methods of identifying the microbial biofilm-forming ability, the microbial respiration state, and their chemotaxis behavior. The methods are used to identify five microbes, three of which were isolated from the bone tissue of Sprague-Dawley (SD) rats (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus, and Enterococcus faecalis) and two from the American Type Culture Collection (ATCC)-Staphylococcus aureus ATCC 25923&#160;and Enterococcus faecalis V583. The microbes isolated from the SD rat bone tissue include the gram-positive microbes. These microbes have adapted to thrive under stressful and nutrient-limiting environments within the bone matrix. This article aims to provide the readers with the specific know-how of determining the nature and behavior of the isolated microbes within a laboratory setting.

<meta charset="utf8"></head><body>さまざまな細菌の移動とバイオフィルム形成の測定

Here, we present a practical method for the isolation and identification of microorganisms within the host. In this way, the physicochemical properties of microorganisms and possible ways of living in the host are clearly described.

さまざまな細菌の移動とバイオフィルム形成の測定

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their ...

Candida albicans Biofilm Formation in an In Vivo Mouse Model

Source: Kuchar&#237;kov&#225;, S., et al.&#160; <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/52239">Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates the development of an in vivo mouse model to study the biofilm formation of Candida albicans in subcutaneous tissue. The experiment involves implanting Candida-infected devices in the animal&#39;s back region for biofilm development.

カンジダIn vivoマウスモデルにおけるバイオフィルム形成

1. C. albicans Growth

	Twenty-four hours before the initiation of the animal experiment, prepare yeast extract peptone dextrose, YPD plates by adding 10 ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫学

免疫診断

In Vitro および In Vivo モデル

A Method for Sample Preparation to Visualize Biofilm Forming Bacteria on Fungal Hyphae

Source: Guennoc, Cora Miquel, et al, <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54771">A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video describes a method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae using microscopy. Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and involve numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation.

菌糸上のバイオフィルム形成細菌を可視化するための試料調製法

1. Preparation of an In Vitro Biofilm of Bacteria on the Fungal Colony

	Centrifuge the bacterial culture at 5,000 x g for 3 min and suspend the pellet in ...

細菌や真菌によってウイルス感染細胞上のバイオフィルムの開始の決意

要約

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S. cerevisiaeの接着と寒天の侵略のためのアッセイ

細菌性病原体によるヒト細胞の浸潤

研究のための方法論

共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオフィルム形成の可視化

細胞レベルで真菌 - 微生物相互作用をプロービングするためのマイクロ流体ツール

さまざまな細菌の移動とバイオフィルム形成の測定

さまざまな細菌の移動とバイオフィルム形成の測定

カンジダIn vivoマウスモデルにおけるバイオフィルム形成

菌糸上のバイオフィルム形成細菌を可視化するための試料調製法

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自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオ フィルム形成の可視化

細胞レベルで真菌 - 微生物相互作用をプロービングするためのマイクロ流体ツール

さまざまな細菌の移動とバイオフィルム形成の測定

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自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオフィルム形成の可視化