This work was supported, in part, by NIAID, NIH, DHHS federal research grants R01 AI036525 and U19 AI082655 (CCHI) to MBS and by NIH grant DK048373 to AF. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institute of Allergy And Infectious Diseases or the National Institutes of Health.

倫理の声明：すべての血液標本は、プロトコル番号HP-00040025から1に参加したボランティアから採取しました。メリーランド大学施設内倫理委員会は、このプロトコルを承認し、この原稿に含まれた研​​究のための健康なボランティアからの血液標本のコレクションを承認しました。本研究の目的は、ボランティアに説明した、そしてすべてのボランティアが知らさ与えた、採血前に同意書に署名しました。 注：培地補充の準備については、 表1を参照してください。 3-D培養培地の調製のための表2を参照されたいです。 培養容器の調製<ol><li> （ 例えば 、RPMI）50ミリリットル、容器の充填ポートのキャップを外し、無菌培養培地50mlで埋めます。層流フード内で無菌状態の下ですべての手順を実行します。 </li><li>キャップを交換し、70％エタノールで任意の表面上の任意のこぼれたメディアを拭きます。 </li><li>容器はincubを許可します室温でO / Nに少なくとも15分間食べました。 </li><li>培地を廃棄し、3次元培養液の30ミリリットルを追加するために充填ポートを使用します。 </li><li> 70％エタノールで任意の表面上の任意のこぼれた培地を拭いてください。 </li></ol>細胞の調製<ol><li>ヒト上皮細胞株（HCT-8）24,40。 <ol><li> RPMIで培養細胞、100 U / mlのペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、50μg/ mlのゲンタマイシン、2mMのL-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、10mMのHEPES緩衝液及び10％熱不活性化ウシ胎児血清（FBS ）（ 補足1）。 5：70％の密集度、1の割合で分割する細胞で。 </li></ol></li><li>ヒト結腸線維芽細胞（CCD-18Co細胞 ）24,41。 <ol><li> サプリメント1で強化された基礎イーグル培地で培養細胞密集度で、1の割合で分割する細胞：。3。 </li></ol></li><li>ヒト臍帯静脈内皮（HUVEC）細胞<suP&gt; 24,42。 <ol><li> 100μg/ mlのヘパリン、3 / mlの内皮細胞成長サプリメント（ECGS）、およびサプリメント1で強化された内皮基礎培地で培養細胞（EBM）媒体1の比率で70％の密集度、分割細胞で：。2。 </li></ol></li><li>リンパ球/単球<ol><li>標準的な技術43を用いた密度勾配遠心分離により血液から末梢血単核細胞（PBMC）を単離します。 <ol><li>簡単に言えば、10ミリリットルピペットを使用して、慎重に希釈した血液の30ミリリットルを追加し（1：1の血液：リン酸緩衝食塩水（PBS））密度遠心分離培地の10ミリリットルを含む50ミリリットルコニカルチューブに。遠心分離工程の後、リンパ球および単球は、密度遠心分離媒体とプラズマ層との間の「白」層内に存在します。 </li><li>トランスファーピペットを用いて、白色層を収集します。密度遠心分離メディアのコレクションを制限することにより、顆粒球汚染を避けます。 43を洗浄した後、Uそれ自体PBMCであるか、または液体N 2中で凍結保存。 注：PBMCが大きく、樹状細胞および他の細胞型の小さな割合で、リンパ球および単球からなることを強調することが重要です。 </li></ol></li></ol></li><li> 5％CO 2の雰囲気中、37℃で、標準的な培養条件下ですべての細胞を増殖させます。 </li></ol>コラーゲン埋め込まれた細胞の調製<ol><li> -セットアップする実験条件の数に基づいて、必要な挿入の数を決定します。 6ウェルプレートのウェルに挿入物の適切な数を配置します。 </li><li> HUVECおよび線維芽細胞の懸濁液を準備します。 <ol><li> PBS中で2回フラスコを洗浄し、0.05％トリプシン四ナトリウムエチレンジアミン（トリプシンEDTA）でトリプシン、0.25％（1×）を使用して細胞を剥離。細胞培養表面領域の全体をカバーするのに十分なトリプシン溶液を加えます。剥離は、通常15分に5以内に起こります</li><li>収集しますダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）-30％FBS培地30mlを含む50ミリリットルチューブで剥離した細胞。 </li><li> 10分間、500×gでチューブを遠心。 </li><li> DMEM-30％FBS培地30mlに細胞を再懸濁。 </li><li>トリパンブルー色素20μlの再懸濁した細胞を20μlを希釈することにより生存細胞の総数をカウントします。細胞混合物で血球計数器をロードします。生存PBMCを明確に白になります。非生存PBMCは、色素を取得し、青になります。 <ol><li> 8×10 7細胞ミリリットル- - 5の濃度でDMEM-30％FBS培地中で再懸濁し、各細胞型1。 </li></ol></li></ol></li><li>細胞含有コラーゲンゲルを準備 注：各容器は、細胞含有コラーゲンゲルの〜5ミリリットルの準備が必要になります。 <ol><li> 50 mlのコニカルチューブに50μg/ mlのゲンタマイシン、2mMのL-グルタミンおよび10％熱inactivatを補った1×DMEM培地を添加することにより、コラーゲンの混合物を調製エドFBSプラスに3mg / mlのウシコラーゲンI、10 / mlのラミニン、40 / mlのコラーゲンIV、10 / mlのフィブロネクチン、2 / mlのヘパリン硫酸プロテオグリカンおよび15mMのNaOHで（生理的pHに到達します）。 </li><li>チューブを閉じて、混合物を完全に均質化されるまで、数回転倒混和します。気泡の形成を避けます。 重要：ゲル化を防止するために、氷上で混合物を保管してください。 <ol><li> 重要なステップ：混合物は酸性外観（黄色がかった色）を開発する場合は、混合物を中和するために、無菌の1N NaOH数滴を追加します。 </li></ol></li><li>それぞれ濃縮されたコラーゲン混合物（上記）に、2.0×10 6細胞/ ml - 1.2および1.5から1.0の密度で濃縮されたHUVECおよび線維芽細胞を追加します。チューブを閉じて、混合物を完全に均質化されるまで、数回転倒混和します。気泡の形成を避けます。重要：ゲル化を防止するために、氷上で混合物を保管してください。 </li><li>細胞含有コラーゲンの5ミリリットル - 4を追加します。各インサートのゲルは、以前に6ウェルプレートにロードされ、1時間、ほとんど、あるいはまったく動きとフードにgelifyすることができました。 </li><li>さらに2時間- 1時間後、1 37℃、5％CO 2インキュベーターに6ウェルプレートに移します。 </li><li>フードに6ウェルプレートを返し、そして滅菌ピンセットの助けを借りてとメス無菌的にカットオフ膜を膜から細胞含有ゲルを取り外し、挿入から。小さな正方形に切り離さゲル（〜5×5 mm）をカットします。 </li><li>充填ポートを使用して50-mlのHARVに小細胞含有正方形を追加します。 </li></ol></li><li> HCT-8上皮細胞の懸濁液を準備します。 <ol><li> PBS中で2回フラスコを洗浄し、トリプシンEDTA処理でトリプシン、0.25％（1×）を使用して細胞を剥離。細胞培養表面領域の全体をカバーするのに十分なトリプシン溶液を加えます。剥離は、通常10〜15分以内に起こります。 </li><li> DMEM-30％FBS培地30mlに剥離した細胞を収集します。 </li><li> Centrif10分間、500×gでチューブを含むUGE DMEM-30％FBS培地。 </li><li> DMEM-30％FBS培地30mlに細胞を再懸濁。 </li><li> 3.2.5で説明したように生存細胞の総数をカウントします。 </li><li> 10 7細胞mlの濃度でDMEM-30％FBS培地中のHCT-8上皮細胞を再懸濁する- 1。 </li><li>充填ポートを使用して50-mlのHARVに濃縮されたHCT-8上皮細胞の1ミリリットルを追加します。 </li></ol></li><li>容器がほぼ一杯になるまで、充填ポートを使用して、（〜20ml）でさらに3-D培養培地を加えます。 </li><li>キャップを交換し、70％エタノールで充填ポートの唇を拭いてください。 </li><li> RWVの各シリンジポートに注射器を置き：場所3を含む5ミリリットルシリンジ - 4つのポートでの3次元培養培地1mlと他のポートで5ミリリットル、空のシリンジを。 </li><li>媒体のほぼ同じボリュームが他のシリンジポートを介して注入されている間、空の注射器に引っ張ることによって、目に見える気泡を除去。 </li><li> VESを配置SELSバイオリアクターで、電源をオンにし、毎分約13〜14回転に速度を設定。 注：重要なステップ：回転速度は、それによって血管壁との接触を避け、容器内の旋回細胞を維持するために、実験中に数回に調整する必要があるかもしれません。 </li><li> RWVバイオリアクターが提供する37°C、微小重力下での5％のCO 2での培養細胞、。 </li><li>新鮮な3-D培養培地で約30 mlで置き換えることにより、4日 - すべての3変化培地。 </li><li> 4日（±1日）の後、バイオリアクターから血管を除去し、（2×10 7 /容器）容器にリンパ球/単球を追加します。 </li><li>さらに5日（±1日）、37℃、5％CO 2で戻ってバイオリアクター内の血管を置きます。 </li><li>さらに5日（文化の日の9）の後、（2×10 7 /容器）容器にリンパ球/単球を追加して、最大12の追加日間培養を続けます。 </l私&gt; <li>新鮮な3-D培養培地で約30 mlで置き換えることにより、4日 - すべての3変化培地。 </li></ol>組織学のため4.収穫は、3次元培養<ol><li>トランスファーピペット採取の補助各小ゲル断片と、現在の10％ホルマリン緩衝液10mlを含有する6ウェルプレートに「構築物」と呼ばれます。 RTで3時間のままにするか、12 - 4℃で16時間。 </li><li>標識し、各カセットに生検フォームパッドを2枚追加することで、組織処理および包埋カセットを準備します。 </li><li> 10％ホルマリン緩衝液中にカセットを浸します。 </li><li>鉗子の助けを借りて2フォームパッドとの間に固定された構築物を配置します。 </li><li> 10％ホルマリン緩衝液中にカセットを浸します。 </li><li>埋め込 ​​み切片、および44を染色するための標準的な手順を進めます。 </li></ol>

The authors declare that a US Non-Provisional Patent Application has been filed in the U.S.Patent and Trademark Office (Number: 13/360,539).

本稿では、一次ヒトリンパ球、線維芽細胞、および内皮細胞、ならびに腸上皮細胞株24を含む倍数細胞型から成る、ヒト腸粘膜の生物工学モデルの開発を記載します。この3次元モデルでは、細胞は、微小重力条件下24の下で、コラーゲンが豊富な細胞外マトリックス内で培養されます。 前述したように、このモデルの主な特徴は次の通りである：（...

改善するために、最初の3-Dモデルを構築する画期的な科学者は、足場の異なるタイプの調査を開始したときに、1980年代の初頭に報告された（ 例えば 、ラミニン、コラーゲンタイプI、コラーゲンIV、およびフィブロネクチン）および成長因子のカクテル「静的」3次元モデル1-7の細胞と細胞とECMの相互作用。それ以来、これらのモデルの主な問題点は、媒体および組織の構築8内の栄養と酸素の転送の制限となっています。血管のネットワークを周囲から栄養と酸素の定常流を受ける生体内環境での細胞とは対照的に、これらのモデルの静的な性質は、細胞へのそれらの効果的な分散を妨げます。例えば、 インビトロで生成された細胞凝集体のサイズは数ミリを超える静的モデルは常に低酸素性、壊死性コア9を開発します。 RWVバイオリアクターは、この問題を回避する可能性があります栄養素および酸素10〜12の効率的な拡散を可能にする流体力学を提供することによって。しかし、今日まで、RWVバイオリアクターを使用して作業は、1つまたは2つの細胞型13〜17を含むことに限定されています。また、代わりにネイティブの組織に似た空間的配向の、それらの細胞は、細胞凝集体を形成しました。これらの制限の主な理由は、一元的に細胞を組み込むことができる足場の欠如となっています。現在までにRWVバイオリアクターで使用される足場は、主に合成マイクロビーズ、チューブ状の円筒又は小シート13-15,19-23のいくつかの例外を除い16-18、で、構成されています。これらは、その組成や柔軟性に操作することができず、その細胞がその表面に結合して硬い材料です。したがって、一体的に、そのようなことだ間質細胞（ 例えば 、線維芽細胞、免疫細胞および内皮細胞）のような種々の細胞成分、これらのモデルを評価するには、システムを提供するとは考えにくいですhouldは密接にヒト組織を模倣するために、足場内に分散します。 ここでは、腸上皮細胞株および一次ヒトリンパ球、内皮細胞からなるヒト腸粘膜の多3次元器官型モデルの開発について説明し、線維芽細胞24。これらの細胞は、RWVバイオリアクター13,25-30によって提供微小重力下で培養しました。我々の3-Dモデルでは、ECM（ 例えば 、培養中に、無視できる拡散拘束）は、培地に類似オスモル濃度などの多くの異なる特性を有し、細胞および他の関連する細胞外マトリックスタンパク質を取り込む能力、ならびにバイオリアクター24において使用される適切な剛性。生物学的システムは非常に複雑であり、過去数年間、isolatioでそれらを勉強するのではなく、その周囲との細胞の相互作用の検討に向けて粘膜研究の焦点のずれがありましたn個。具体的には、腸細胞の生存および分化に影響を与えるで細胞-細胞相互作用の重要性はよく31-34に記載されています。具体的には、上皮細胞とそのニッチとの間の通信は、上皮細胞の増殖と分化35に多大な影響を与えています。実際、それは広く受け入れられていることだけでなく、細胞間だけでなく、細胞 - ECM相互作用が3次元培養モデルにおける上皮細胞の維持および分化に重要です。以前の研究は、コラーゲンI 24,36,37、ラミニン38およびフィブロネクチン39は、ネイティブの粘膜に似た空間的配向を獲得するために腸上皮細胞に影響を与えることに尽力しているとして、その腸のECMタンパク質を実証しました。したがって、腸の表現型の多様性を模倣することができ、当社の3次元モデル24、のような新しい技術の開発が必要とされている研究者は、複雑な細胞及び構造のアーキテクチャを再作成する場合および腸の微小環境の機能。これらのモデルは、新しい経口薬やワクチン候補の開発および評価における重要なツールを表します。

<table><tbody><tr><td>Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor&amp;nbsp;</td><td>Synthecon</td><td>RCCs-4DQ</td><td>For up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available.</td></tr><tr><td>Disposable 50 ml-vessel</td><td>Synthecon</td><td>D-405</td><td>Box with 4 vessels</td></tr><tr><td>HCT-8 epithelial cells&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-244</td><td></td></tr><tr><td>CCD-18Co Fibroblasts&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CRL-1459</td><td></td></tr><tr><td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1730</td><td>HUVEC</td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor-Basic&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>bFGF</td></tr><tr><td>Stem Cell Factor&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7901</td><td>SCF</td></tr><tr><td>Hepatocyte Growth Factor&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H1404</td><td>HGF</td></tr><tr><td>Endothelin 3</td><td>Sigma</td><td>E9137</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td>Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor</td></tr><tr><td>Vascular Endothelial Growth Factor&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>V7259</td><td>VEGF</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-4377</td><td>(LIF</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma</td><td>A2786</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I-6634</td><td></td></tr><tr><td>3,3&#039;,5-triiodo-L-thyronine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T-6397</td><td>T3</td></tr><tr><td>Cholera Toxin</td><td>Sigma</td><td>C-8052</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>BD</td><td>354008</td><td>Isolated from human plasma</td></tr><tr><td>apo-Transferrin</td><td>Sigma</td><td>T-1147</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Heparan sulfate&amp;nbsp; proteoglycan</td><td>Sigma</td><td>H4777</td><td>Isolated from basement membrane of mouse&amp;nbsp; Engelbreth-Holm-Swarm tumor</td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td>Isolated from human placenta</td></tr><tr><td>Heat-inactivated fetal bovine serum&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM, powder</td><td>Invitrogen</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>10% formalin&amp;ndash;PBS&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>Bovine type I collagen&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A1064401</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Invitrogen</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomincin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Ham&#039;s F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>Basal Medium Eagle</td><td>Invitrogen</td><td>21010-046</td><td>BME</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Basal Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td>EBM-2</td></tr><tr><td>Endothelial cell growth supplement</td><td>Millipore</td><td>02-102</td><td>ECGS</td></tr></tbody></table>

development of a multicellular three-dimensional organotypic model of the human intestinal mucosa grown under microgravity

三次元（3-D）環境中で増殖する細胞は、多数の2次元環境における細胞培養の隙間（ 例えば 、フラスコまたはディッシュ）をブリッジする可能性があるからです。実際には、広くフラスコまたはディッシュで増殖した細胞は、脱分化し、それらが由来する組織の特殊な機能を失う傾向があることが認識されます。 （a）は、静的モデルとバイオリアクターを用いて（b）のモデル：現在、天然の細胞外マトリックス（ECM）を模倣する細胞が足場に播種される3-D培養系の2種類が主に存在します。最初のブレークスルーは、静的な3次元モデルでした。このような回転-壁容器（RWV）バイオリアクターなどのバイオリアクターを用いた3次元モデルは、より最近開発されています。 RWVバイオリアクターのオリジナルのコンセプトは、1990年代初頭にNASAのジョンソン宇宙センターで開発された、そのような低酸素性、壊死性コアの開発のような静的なモデルの限界を克服すると考えられています。 RWVバイオリアクターは、番目のを回避する可能性があります栄養と酸素の効率的な拡散を可能にする流体力学を提供することによって、問題です。これらのバイオリアクターは、彼らの曝気源の種類によって異なる培養容器の二つの異なるフォーマットをサポートし、回転させるのに役立つローテータベースで構成されています。中心部に同軸人工肺で（1）スローターニング横船舶（STLVsを）、または（2フラット、シリコーンゴムガス転写膜を介して酸素との）高アスペクト比の船舶（HARVs）。バブル形成とその結果としての乱流を回避しながら、これらの血管は、効率的なガス移動を可能にします。これらの条件は、モデルは、培養容器内部の重力（重力）を低減し、層流と最小限のせん断力が生じます。ここでは、RWVバイオリアクターが提供する腸上皮細胞株および一次ヒトリンパ球、微小重力下で培養内皮細胞および線維芽細胞から成るヒト腸粘膜の多細胞3次元器官モデルの開発について説明します。&lt;/ P&gt;

<html>これまで我々は、腸上皮細胞株および一次ヒトリンパ球、微小重力条件24（ 図1）で培養内皮細胞および線維芽細胞からなるヒトの腸粘膜の多細胞3次元器官モデルを設計してきました。線維芽細胞および内皮細胞は、追加の腸基底膜タンパク質45（ すなわち 、ラミニン、コラーゲンIV、フィブロネクチン及びヘパリン硫酸プロ?...

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Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

三次元（3-D）環境中で増殖する細胞は、2-D環境（ 例えば 、フラスコまたはディッシュ）で細胞培養上顕著な改善を示します。ここでは、回転-壁容器（RWV）バイオリアクターが提供する微小重力下で培養ヒト腸粘膜の多細胞3次元器官モデルの開発について説明します。

微小重力下で増殖させたヒト腸粘膜の多細胞三次元器官型モデルの開発

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

development-multicellular-three-dimensional-organotypic-model-human

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.8K ビュー.  University of Maryland School of Medicine. 三次元（3-D）環境中で増殖する細胞は、2-D環境（ 例えば 、フラスコまたはディッシュ）で細胞培養上顕著な改善を示します。ここでは、回転-壁容器（RWV）バイオリアクターが提供する微小重力下で培養ヒト腸粘膜の多細胞3次元器官モデルの開発について説明します。 

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Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to preoperative weights within 40 days.1 In humans, massive small bowel resection can result in short bowel syndrome, a functional malabsorptive state that confers significant morbidity, mortality, and healthcare costs including parenteral nutrition dependence, liver failure and cirrhosis, and the need for multivisceral organ transplantation.2 In this paper, we describe and document our protocol for creating tissue-engineered intestine in a mouse model with a multicellular organoid units-on-scaffold approach. Organoid units are multicellular aggregates derived from the intestine that contain both mucosal and mesenchymal elements,3 the relationship between which preserves the intestinal stem cell niche.4 In ongoing and future research, the transition of our technique into the mouse will allow for investigation of the processes involved during TESI formation by utilizing the transgenic tools available in this species.5The availability of immunocompromised mouse strains will also permit us to apply the technique to human intestinal tissue and optimize the formation of human TESI as a mouse xenograft before its transition into humans. Our method employs good manufacturing practice (GMP) reagents and materials that have already been approved for use in human patients, and therefore offers a significant advantage over approaches that rely upon decellularized animal tissues. The ultimate goal of this method is its translation to humans as a regenerative medicine therapeutic strategy for short bowel syndrome.

This article and the accompanying video present our protocol for generating tissue-engineered intestine in the mouse, using an organoid units-on-scaffold approach.

マウスモデルにおける腸のティッシュエンジニアリング

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

生物工学

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of the crypt region. IESCs include active stem cells, which self-renew and differentiate into various epithelial cell types, and quiescent stem cells, which serve as the reserve stem cells in the case of injury. Regeneration of the intestinal epithelium is controlled by the self-renewing and differentiating capabilities of these active IESCs. In addition, the balance of the crypt stem cell population and maintenance of the stem cell niche are essential for intestinal regeneration. Organoid culture is an important and attractive approach to studying proteins, signaling molecules, and environmental cues that regulate stem cell survival and functions. This model is less expensive, less time-consuming, and more manipulatable than animal models. Organoids also mimic the tissue microenvironment, providing in vivo relevance. The present protocol describes the isolation of colonic crypts, embedding these isolated crypt cells into a three-dimensional gel matrix system and culturing crypt cells to form colonic organoids capable of self-organization, proliferation, self-renewal, and differentiation. This model allows one to manipulate the environment-knocking out specific proteins such as claudin-7, activating/deactivating signaling pathways, etc.-to study how these effects influence the functioning of colonic stem cells. Specifically, the role of tight junction protein claudin-7 in colonic stem cell function was examined. Claudin-7 is vital for maintaining intestinal homeostasis and barrier function and integrity. Knockout of claudin-7 in mice induces an inflammatory bowel disease-like phenotype exhibiting intestinal inflammation, epithelial hyperplasia, weight loss, mucosal ulcerations, epithelial cell sloughing, and adenomas. Previously, it was reported that claudin-7 is required for intestinal epithelial stem cell functions in the small intestine. In this protocol, a colonic organoid culture system is established to study the role of claudin-7 in the large intestine.

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The present protocol describes establishing a murine colonic organoid system to study the activity and functioning of colonic stem cells in a claudin-7 knockout model.

腸幹細胞機能をex vivoで研究するためのマウス結腸陰窩の三次元培養

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

がん研究

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

病原体、共生生物、およびホストの腸上皮間の相互作用を研究する人間 Colonoid 単分子膜

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

免疫・感染学

Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, and metabolism of nutrients and xenobiotics while facilitating a symbiotic relationship with microbiota and restricting the invasion of microorganisms. Functional interaction between various cell types and their physical and biochemical environment is vital to establish and maintain intestinal tissue homeostasis. Modeling these complex interactions and integrated intestinal physiology in vitro is a formidable goal with the potential to transform the way new therapeutic targets and drug candidates are discovered and developed.
Organoids and Organ-on-a-Chip technologies have recently been combined to generate human-relevant intestine chips suitable for studying the functional aspects of intestinal physiology and pathophysiology in vitro. Organoids derived from the biopsies of the small (duodenum) and large intestine are seeded into the top compartment of an organ chip and then successfully expand&#160;as monolayers while preserving the distinct cellular, molecular, and functional features of each intestinal region. Human intestine tissue-specific microvascular endothelial cells are incorporated in the bottom compartment of the organ chip to recreate the epithelial-endothelial interface. This novel platform facilitates luminal exposure to nutrients, drugs, and microorganisms, enabling studies of intestinal transport, permeability, and host-microbe interactions.
Here, a detailed protocol is provided for the establishment of intestine chips representing the human duodenum (duodenum chip) and colon (colon chip), and their subsequent culture under continuous flow and peristalsis-like deformations. We demonstrate methods for assessing drug metabolism and CYP3A4 induction in duodenum chip using prototypical inducers and substrates. Lastly, we provide a step-by-step procedure&#160;for the in vitro modeling of interferon gamma (IFN&#947;)-mediated barrier disruption (leaky gut syndrome) in a colon chip, including methods for evaluating the alteration of paracellular permeability, changes in cytokine secretion, and transcriptomic profiling of the cells within the chip.

Biopsy-derived intestinal organoids and organ-on-a-chips technologies are combined into a microphysiological platform to recapitulate region-specific intestinal functionality.

ヒトオルガノイドと臓器オンチップ技術を組み合わせて腸領域特異的機能をモデル化

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

マウス胎児腸全体培養システム<em&gt;生体外</em&gt;シグナル伝達経路の操作と絨毛開発の3次元ライブイメージング

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

生物学

イヌIBD腸内チップシステムにおける3D形態形成の確立

Three-Dimensional Morphogenesis in Canine Gut-on-a-Chip Using Intestinal Organoids Derived from Inflammatory Bowel Disease Patients

Canine intestines possess similarities in anatomy, microbiology, and physiology to those of humans, and dogs naturally develop spontaneous intestinal disorders similar to humans. Overcoming the inherent limitation of three-dimensional (3D) organoids in accessing the apical surface of the intestinal epithelium has led to the generation of two-dimensional (2D) monolayer cultures, which expose the accessible luminal surface using cells derived from the organoids. The integration of these organoids and organoid-derived monolayer cultures into a microfluidic Gut-on-a-Chip system has further evolved the technology, allowing for the development of more physiologically relevant dynamic in vitro intestinal models.
In this study, we present a protocol for generating 3D morphogenesis of canine intestinal epithelium using primary intestinal tissue samples obtained from dogs affected by inflammatory bowel disease (IBD). We also outline a protocol for generating and maintaining 2D monolayer cultures and intestine-on-a-chip systems using cells derived from the 3D intestinal organoids. The protocols presented in this study serve as a foundational framework for establishing a microfluidic Gut-on-a-Chip system specifically designed for canines. By laying the groundwork for this innovative approach, we aim to expand the application of these techniques in biomedical and translational research, aligning with the principles of the One Health Initiative. By utilizing this approach, we can develop more physiologically relevant dynamic in vitro models for studying intestinal physiology in both dogs and humans. This has significant implications for biomedical and pharmaceutical applications, as it can aid in the development of more effective treatments for intestinal diseases in both species.

著者スポットライト:3D腸の形態形成研究のための犬のIBD腸内チップモデルの開発と応用 

Integration of canine intestinal organoids and a Gut-on-a-Chip microfluidic system offers relevant translational models for human intestinal diseases. Protocols presented allow for 3D morphogenesis and dynamic in vitro modeling of the gut, aiding in the development of effective treatments for intestinal diseases in dogs and humans with One Health.

炎症性腸疾患患者由来の腸管オルガノイドを用いたイヌ腸チップの3次元形態形成

Canine intestines possess similarities in anatomy, microbiology, and physiology to those of humans, and dogs naturally develop spontaneous intestinal ...

医学

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

腸オルガノイドモデルを用いたアプリカル特異的相互作用を研究する培養法

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

マウス腸陰窩および単一幹細胞からのオルガノイドの3D培養

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine small intestinal crypts can form organoids that mimic the intestinal epithelium when cultured in a 3D extracellular matrix. The organoids are composed of all cell types that fulfill various intestinal homeostatic functions. These include Paneth cells, enteroendocrine cells, enterocytes, goblet cells, and tuft cells. Well-characterized molecules are added into the culture medium to enrich the intestinal stem cells (ISCs) labeled with leucine-rich repeats containing G protein-coupled receptor 5 and are used to drive differentiation down specific lineages; these molecules include epidermal growth factor, Noggin (a bone morphogenetic protein), and R-spondin 1. Additionally, a protocol to generate organoids from a single erythropoietin-producing hepatocellular receptor B2 (EphB2)-positive ISC is also detailed. In this methods article, techniques to isolate small intestinal crypts and a single ISC from tissues and ensure the efficient establishment of organoids are described.

著者スポットライト:オルガノイド研究のためのマウス腸管陰窩からのオルガノイドと単一幹細胞の3D培養  

We describe a protocol to isolate murine small intestinal crypts and culture intestinal 3D organoids from the crypts. Additionally, we describe a method to generate organoids from a single intestinal stem cell in the absence of a sub-epithelial cellular niche.

オルガノイド研究のためのマウス腸陰窩および単一幹細胞からのオルガノイドの3D培養

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

微小重力下で増殖させたヒト腸粘膜の多細胞三次元器官型モデルの開発

要約

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マウスモデルにおける腸のティッシュエンジニアリング

腸幹細胞機能をex vivoで研究するためのマウス結腸陰窩の三次元培養

病原体、共生生物、およびホストの腸上皮間の相互作用を研究する人間 Colonoid 単分子膜

ヒトオルガノイドと臓器オンチップ技術を組み合わせて腸領域特異的機能をモデル化

マウス胎児腸全体培養システム

炎症性腸疾患患者由来の腸管オルガノイドを用いたイヌ腸チップの3次元形態形成

炎症性腸疾患患者由来の腸管オルガノイドを用いたイヌ腸チップの3次元形態形成

炎症性腸疾患患者由来の腸管オルガノイドを用いたイヌ腸チップの3次元形態形成

腸オルガノイドモデルを用いたアプリカル特異的相互作用を研究する培養法

オルガノイド研究のためのマウス腸陰窩および単一幹細胞からのオルガノイドの3D培養