The work was in part funded by UK Medical Research Council project grant G0601253 to G.S.B. and R.W.B.

マウスの死後の組織の収穫が承認された倫理的な方法を使用する必要があります。英国では、頸椎脱臼は、成体マウス（英国動物の上場スケジュール1の方法（科学的手続）法、1986年から欧州指令63分の2010 / EU）のための政府承認された方法です。この法律は、以下のプロトコルで使用されるすべての手順を検討し、承認された動物福祉と倫理審査委員会によって、アバディーン大学で局所的に適用されます。 注：これらの方法は、銀行らに報告された研究で使用した7。 電気生理学1.準備耳<ol><li>解剖前に、このようなLileyの（1956）などの標準的な生理食塩水を調製し、90％O 2/5％CO 2でそれを飽和。 NaHCO 3（12）のKCl（4）、KH 2 PO 4（1）、塩化ナトリウム（138.8）のMgCl 2（1） の CaCl 2（2）及びグルコース：Lileyの生理食塩水（MM）が構成され（11）。 </li><li>人道的に耳の近くに頭蓋骨を損傷することなく、成体マウスを安楽死させます。ここでは、C57 / Bl6JとMF1マウスを使用していますが、任意の標準的な実験用マウス系統を使用することができます。理想的には、電気的記録が大きく、マウスにおける標識は信頼性が低いとして、スチリル色素標識と組み合わせることである場合は、&lt;25グラムであるマウスを使用し、多くの場合にのみ限定さ外接地域で発見されています。 </li><li>大きなはさみや骨ハサミで頭を削除します。 </li><li>ステレオ解剖顕微鏡のステージ上で（50センチメートルが通常便利である）は、広い底解剖皿に毒ガスLileyの中で頭の背側を上に置きます。定期的に（〜10分）水門や毒ガス生理食塩水で頭を沈めます。 </li><li>慎重外耳道（EAM）の軟骨を露出させ、springbowはさみと＃3鉗子で外耳（耳介）の付け根に皮膚を切開し、分離します。彼らはFをemergeとして三叉神経の枝（下顎部門、MDV）と大きな耳介神経を特定ROM軟骨ベースを介して、顎関節やプロジェクトの裂け目で頭蓋骨はそれぞれ、凹（前方）と凸（後部）耳介皮膚の側面を支配します。 </li><li>頭蓋骨の近く、どこ顎および乳様突起のプロセス間の溝内の2つの神経枝出口を識別します。静かに頭蓋骨から耳介を引いて、その長さを最大化し、可能な限り頭蓋骨に近い神経を切断します。 </li><li>分割された神経の遠位断端を避けるように注意しながら、除去される耳の付け根に密な毛の量を最小限に抑え、springbowはさみで頭から耳介を削除します。 </li><li>柔軟なシリコーンゴム（PDMS）毒ガスLileyの流体で満たさ-lined皿に耳介を転送します。最も狭い（最前方）の時点でそれを分割してEAMを開きます。 〜6-8との縁で慎重にPDMSに耳介、前方皮膚（凹）ダウンサイドピンを平らにし、定期的に（〜0.2ミリメートルの直径）昆虫ピン非常に微細な間隔を置いて配置。 </li><li>レム耳介の後面の皮オベ完全および部分的に＃3鉗子で鈍的切開により耳介軟骨を除去し、前方の皮膚がそのまま残されている保証します。 </li><li>細かい虫ピンの点で軽く肌とEAM軟骨の間に後方に現れるMDVの枝（通常は2）を拡張、＃3鉗子で把持。その切断端ではなく、神経幹自身に隣接する結合組織を突き刺す、可能な限り微細昆虫ピンでPDMSにこれらをピン。 </li><li>慎重に引っ張っ過剰または切断による損傷を避けること、彼らの周りの周囲の結合組織の大部分を削除してください。 </li></ol> 2.電気生理学的記録の設定<ol><li>に（記録のために一から二の吸引電極に近い耳の付け根で洗浄神経を配置し、（〜耳あたり6-8）エッジの周りに細かい虫ピンで記録チャンバーのPDMS-並ぶベースに耳介皮膚をピン神経を取る）とOT彼女の不関電極（7を参照して 、差動増幅器にニュートラル信号を提供します）。 </li><li>記録電極の場合は、慎重に絞りと2神経の合計の厚さへの開口部の内径に一致するので、可能な限り、できるだけ大きい長さとしてぴったりとフィット。 </li><li>シリコーンゴム管と他の端部に取り付けられた2ミリリットルの注射器から穏やかな吸引によって電極に神経を描画します。折り畳まれたまたはダブルアップしていない、神経がまっすぐであることを確認してください。 </li><li>しっかりと神経の周りの開口部を封止するプラグを形成するために、結合組織や脂肪組織を描画するために強力な吸引力を利用して高電気抵抗/インピーダンスフィットを開発します。 </li><li> （それは毛管作用によって充填することができる）、必要に応じて吸引することにより、生理食塩水と他の（無関心）電極を埋めます。 </li><li>生理食塩水と神経に接触するように記録電極の内部ボア内に同一の記録ワイヤー（銀や白金）を配置電極の（記録）または狭め、火災研磨終了（無関心）。各電極は、2芯シールドケーブルの異なるコアに個別にはんだ付けされています。浴中に浴（アース）電極（銀/塩化銀ペレット）を配置し、記録電極に接続された2つのコアケーブルの画面に、それを接地してください。 </li><li>オシロスコープの画面上の差動アンプ、フィルタ（バンド渡さ0.2-2 kHzの）、およびビューの別々のチャンネルに二つの電極からの電気的活動をフィード。電気ノイズレベルが似ているチャネルA（記録）とチャネルB（無関心）を確認してください。この段階では、2つの電極がバランスする前に、チャネルAにおける通常の自発的活動電位を見ることができない場合があります。 </li><li>記録（チャネルA）または無関心（チャネルB）電極のインピーダンスを増加させることにより、電極間のバックグラウンドノイズの違いを是正。いずれかの電極へのさらなる乳輪（脂肪）結合組織を吸引することでこれを行い、および/または50 mlシリンジに大きな吸引力を加えます。 <ol><li>このように「バランスのとれた」後は、（AB）記録を微分し、トレースに、またはとき耳介の縁に毛をなでる自発的な活動電位（APS）を探しに切り替えます。通常より厳しい（高抵抗）シール及び2におけるより平等インピーダンス - アクティビティ（スパイク）が見られない場合は、記録電極における神経のタイトなフィット感と不関電極で疎性結合組織を再確認電極、より良いです。信号：ノイズ比：練習では​​、これは良い品質の（1&gt; 2）を実現します。 </li></ol></li><li>コンピュータ上で実行されているラボインターフェースと電気生理学ソフトウェアを介しelectroneurogramを記録します。スパイクのオーディオ出力は、非常に有用であり、オーディオアンプと関連オーディオスピーカーを通して神経像を供給することによって達成することができます。ちょうど白-nが存在しないことによって特定されたベースラインノイズ（上になるように閾値を調整オワーズ）「ヒス」。 </li><li>披針形の語尾に薬物または蛍光スチリル色素のアクセスを向上させるために、慎重に卵胞の真皮とベースをさらすのx 5ミリメートル（ 図1A、B〜5mmの窓を開け、耳介マージンの近くに皮下脂肪層をはがします）。 </li><li> （該当する場合は、単に生産窓のレベルで）並置スキン層の間に明確な生理食塩水で満たされたギャップを残して、前余白で脂肪クリア耳皮膚の〜1ミリメートルの折り目を背面端子です。ゆっくりストローク毛がオシロスコープで最大AP出力の領域を見つけるために、皮膚に触れることなく、ピンまたは接地された微細な鉗子で折られた縁部に沿って突出して独特の「クリック」し、オーディオ出力に「ポップ」。 </li></ol> 3.録音刺激誘発活動電位<ol><li>位置機械的刺激プローブ - セラミに取り付けられた火造り10cmのホウケイ酸微小電極ガラスCの圧電アクチュエータは、 - そのように動きが皮膚のひだに平行です。それは毛ではなく、肌に触れるので、皮膚のひだから先端約0.5〜1ミリメートルを置きます。ゆっくりとスパイクを聞く/毛を偏向し、観察するために、手動でプローブ先端を移動させることにより、効果的な刺激を確認します。 </li><li> 1-3毛の機械的な刺激駆動するためのソフトウェアを使用します（5 Hzの正弦波で例えば 3秒、10秒毎に。変位200-500ミクロンの探査）、および神経における刺激誘発応答を記録。 </li><li> 10秒間隔で複数の同一の機械的刺激列を与えます。その後、（ 例えば、30秒に10秒からリピート率を落とす）実験プロトコルに従って、刺激の頻度を減らす、再現するためのプローブの位置を最適化します。 </li><li>高周波ノイズの振幅と最大APの〜25％〜2倍に設定し、単純なしきい値を使用して、 例えば AP-様活性を区別するためにソフトウェアを使用してください。 </li><li>しきい値を超えるAPをカウント生産APの頻度や特性を定量化する「イベント」、。 </li></ol> 4.録音刺激誘発N-（3-triethylammoniumpropyl）-4-（4-（ジブチルアミノ）スチリル）と組み合わせることで焼成ピリジブロマイドラベリング<ol><li>刺激誘発求心性発射と末端標識上のスチリル色素の影響を調べるために、入浴液に、選択肢のスチリル色素の適切な濃度を追加し、電気的記録を続行します。 </li><li>必要な露光時間（通常は少なくとも30分）した後、卵胞を表示するための準備を準備します。保持ピンを除去することにより、皮膚弁を展開し、末端標識を明らかにクリア真皮領域を露出させます。 </li><li>生理食塩水の3完全な変更を行う、無染料の生理食塩水で外部染料を洗い流します。 </li><li>最も永続的な色素汚染が露出/外部膜から浸出することを可能にするために10〜15分間毒ガス無染料の生理食塩水の最終的な変更でインキュベートします。 </li><li>金属イオン封鎖剤（スルホブチルβ-シクロデキストリン、1 mMの、5分）、生理食塩水のある膜上に残りの非内在化色素を除去。 </li><li>直立落射蛍光顕微鏡のステージに記録チャンバーを転送し、ステージ/スライド移動機構を備えたチャンバに係合します。 </li><li>スチリル色素の励起光の適切なと準備を照らします。卵胞標識（ 図1）を観察するために10Xや25X蛍光顕微鏡の対物レンズを使用してください。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

ここで、我々は急速に解剖することができ、比較的簡単な準備を開発した、低毛包の密度を有しており、毛包の少数の比較的選択機械的刺激を可能にします。これは、機械的に刺激し、毛包、定義された電気生理学的応答を持つ、すなわちイメージング包を可視化するアプリケーションを染色するための応答を含む電気生理学的記録および生細胞蛍光イメージングのために容易にアクセス可能です。我々が行っていないが、このシステムは、単一のユニットのための感覚神経（単一感覚軸索）記録および形態を終了感覚の端末を可視化するための標的とGFP-式を用いて細分に容易に適しているようです。 私たちは、内在化および蛍光膜スチリルpridinium染料7のリリースの特性を調査するためにローカライズされたvesicを研究するために独自に開発した技術を耳の皮膚の準備を使用していましたシナプス終末8におけるル膜のリサイクル。シナプスでは、イメージングも容易に識別端子8,9における応答の同時電気生理学的記録と組み合わされます。それは我々が最初に述べた染料はまた、機械刺激終末10によって内在化されたこれらの初期の研究でした。文化および蝸牛の有毛細胞における感覚ニューロンの場合は、スチリルピリジニウム色素によって標識化の多くは、彼らはその後、11,12をブロックする機械刺激チャネルを通過する色素を含んでいるようです。染料は、その後、細胞内膜にラベルを付け、この標識は不可逆的です。しかし、ではない有毛細胞に機械的に13,14を刺激し、そのようなIaの終末としてその場で完全に分化した一次感覚神経終末における筋紡錘で15、ここで7披針形の語尾に、スチリル色素標識は、膜のエンドサイトーシスを反映しているようです標識は可逆的であり、機械刺激解像度をブロックしないので、ponses 7,15,16。これらの終末におけるチャネル透過による一部の染料内在化を完全に排除できないが、 その場で差別端末での標識の大部分はリサイクル小胞に内在化によるものであることを染料インキュベーションの間継続焼成およびラベリングの可逆性から明らかです膜。したがって、この単純な手法は、容易にエクスビボ組織における機械刺激端末機能の範囲の複合電気的および光学的監視のために使用されます。 最も実用的な技術と同様に、再現性が反復と練習が必要になります。特に注目に値する重要なポイントのいくつかを説明します。解剖と記録セッションを通して、準備が常に完全に95％O 2/5％CO 2で飽和食塩水で灌流さを保証することによって、組織の生存率と生存率を最大化します。毛包がこのプロセスの間に変位されていないことを確認し、WHICHは、感覚終了発射を刺激します。いずれかの準備からの距離で罰金チューブ付き器官槽を通して連続、層流灌流システム、または慎重にバブルガスを使用するか、慎重にすべての回で生理食塩水の表面の下準備を保​​ち、ソリューションごとに20-30分を更新します。吸引記録電極は、通常、細胞内記録用の鋭い電極ホウケイ酸ピペットを変更することによって作製されます。まず、慎重に（2.4および2.5を参​​照）ブンゼンバーナーの炎に非常に短い（&lt;1秒）の暴露によって神経や火ポリッシュに合わせて適切な内径を与えるために＃3鉗子で鋭い先端を断ちます。記録良好な信号対雑音比を得るために、これら2つの電極における電気インピーダンス（抵抗）が最大と同等の両方であることが必須です。二つの電極に、以下に注意を払ってこれを行います。記録電極の場合、内径は、神経のためにぴったりとフィットし、NEの最大の長さであることを確認RVEは、記録電極に引き込まれます。効果的に電極チップを封止するために神経を周囲の結合組織を使用してみてください。あるいは、またはさらに、神経と一緒に脂肪組織の適切な大きさ、テーパーピースの狭い方の端を描画します。その後、チューブに取り付けられた50ミリリットルの注射器で約1分間の強力な吸引を適用することによって、電極先端を差し込みます。しっかりと密封されて先端部については、強力な吸引を適用することは、単にプラグインの有効性を強化し、より多くの液体または神経に描画されません。神経損傷を避けるために、しかし、結合組織が周囲の材料とEAM軟骨に圧縮から神経を緩衝されていることを確認。不関電極はできるだけ記録電極の抵抗/インピーダンスを模倣する必要があります。これは慎重に火研磨実際にそれを封止することなく、可能な限り小さな開口部に先端をすることによって助けられます。さらに抵抗が必要な場合、脂肪と不関電極の端部を差し込み記録電極のための上記のようにそれ自体結合組織、。 電子セラミックは、空間的にも時間的にも、機械的変位を超える絶妙に制御することができます。しかし、電気的な接続を行う世話をする - 高温がそれらを破壊する、とても暑いはんだを使用しないでください。金属配合エポキシ接着剤を使用するか、または供給業者が推奨する専門家押し込み型ソケットを使用しています。これは、両方しっかりとそれを保持し、電気的な接続を確立します。標準的なエポキシ樹脂と電子セラミックにガラス刺激プローブを接続します。組織損傷のリスクを最小化するために電気生理学的記録のためのパッチまたは鋭い電極を製造するために使用される耐火研磨標準10cmの端部は、x直径1.5mmのホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブ。単一の毛包の刺激が必要な場合は、火ポリッシュ先端は、単一の毛に合わせて、絞り開放内側単一毛でプローブを位置決めします。これは、単一の毛の上に絶妙に制御することができます。スチリルDYのため電子ラベルは、それが一般的に若い動物からの組織においてより均一です。これは、なぜ、必ずしも明らかではないが、これはおそらくあまり機械的​​外傷と若い組織からのより効果的な深部組織の除去を反映しています。毛包の拠点を覆う泡状層類似する発泡ポリスチレンを除去するのに十分なこと。これは神経叢層と関連披針形端子を取り外すリスクしかし、激しすぎることを避けます。ほとんど、あるいはまったく電気毛包の動きに応じ、及びスチリル色素のアプリケーションがある場合は、（オレンジ/黄色）むしろ披針形語尾より毛幹の基部の明確な自家蛍光と、（/黄色白）皮脂腺の主なラベリングにつながりますオーバー熱狂的なクリアランスが下にある組織を損傷しています。最後に、非常に撮像前染料キレート剤を使用して、最終的な画像の画像コントラスト及び品質を向上させます。 この技術は、さらなる研究の範囲内で有用であり得ます。これらの共ULDは、候補チャネルに対する選択的な薬理学的リガンドと準備をインキュベートまたは遺伝的に削除されたようなチャネルを有するマウス系統をスクリーニングすることにより、ストレッチ誘発反​​応を担う機械刺激チャネル（複数可）についてのスクリーニング、例えば、含まれています。後者はNpy2rにリンクされたGFP発現17で例えばマウス系統における遺伝的操作に端子形態の変更、の蛍光評価と組み合わせることができます。最後の例では、ストレッチ誘発反応及びスチリル色素の取り込みに対するSLVの売上高（カルシウム、マグネシウム、ラトロトキシン、グルタミン酸受容体リガンド）のモジュレーターの効果を調べることによって、これらの披針形端子におけるシナプスのような小胞（SLVS）7の役割を調査することができます/リリース。したがって、この新しい技術はmechansensory神経科学の研究の潜在的に興味深い道の範囲を開きます。

感覚軸索の披針形端子は、哺乳動物における毛包が毛シャフト上皮の周りに柵を形成する神経支配します。その目的は、それらが取り囲む毛の機械的変位を検出することです。彼らは急速に、ゆっくりと、主に髪の動きに応じて活動の短いバーストを生成語尾を適応が混在しています。動きが停止したときに活性があっても継続的な変位の存在下で、非常に迅速に停止します。ここでは、披針形端子における構造と機能の相関研究のため、このネズミの耳介モデルの開発について説明します。耳介は、これらの語尾を研究するための多くの有利な特徴を持っています。まず、耳介は、本質的に皮膚の二つの層は、卵胞や端末へのアクセスを妨害する間にほとんど他の組織で、背中合わせに並置されています。皮膚は非常に薄く、簡単に起因するタフな結合組織の最小量に解剖です。神経支配は、簡単にアクセスし、識別可能です。ヘアfolliclながら、ESが存在する場合、それらは比較的まばらに機械的に卵胞の個人または小グループの刺激を容易に分散されています。薄い下層の真皮層は、薬理学的薬剤や染料による神経終末への良好なアクセスを提供します。これは、蛍光顕微鏡を用いて画像化研究のために特に最適です。イメージングは​​、いずれかの生きている端末で、または固定し、さらに組織学的処理の後にすることができます。 機械刺激ニューロンの応答は、毛包が伝統的に孤立した皮膚の準備3,4に、より少ない程度に、1,2鼻毛げっ歯類で研究されている支配します。これらは私たちに、毛幹の周囲の神経終末における機械刺激生理学の一般原則について多くを教えてきました。感覚毛の準備は、単一の毛包の動きの上に絶妙なコントロールを可能にします。しかし、感覚毛のように、その複雑さのために出力を解読することは困難です卵胞は、解剖学的に明確な機械刺激エンディング5の少なくとも8つの異なる種類が含まれており、特定の電気生理学的応答にこれらの形態学的なタイプのマッチングは依然として論争の問題です。マウス皮膚/伏在神経の準備は、ほとんどの場合、タッチ及び疼痛応答を調査するために、その脱毛状態で使用されます。そのような製剤中の毛包の神経支配はそれほど複雑ではなく、毛包の密度は、プラス、このような近接6 3つの異なる毛包タイプ（ガード、AWL / aucheneとジグザグ毛）の存在は、特定の応答を研究する意味しますエンディングの単一卵胞または単一の型が再び困難です。また、この製剤は、複雑な解剖を伴います。最後に、感覚毛および他の皮膚製剤の両方では、ex vivoでの製剤がまだ生きている間関与終末を視覚化することは困難です。したがって、組織切片であっても、GFPを発現するマウス系統に必要とされます。 Alternatively、そのような免疫蛍光のための固定および/または抗体のインキュベーションなどのさらなる組織学的/免疫学的処理を必要とします。 したがって、我々は、耳介の準備を開発し、毛包の求心性神経の制限された集団からの電気録音を行い、膜のサイクリングは、スチリルピリジニウム色素の取り込みによって証明される、これらの披針形の語尾で起こることを示すためにそれを使用しています。最後に、我々は色素が、それがメカノチャネルをブロックしませんを示す、機械的感受性を妨害しないことを示しました。単純な刺激と分析プロトコルの結果が示されています。

<table><tbody><tr><td>PDMS - Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Flexible, inert, translucent solid silicone polymer.</td></tr><tr><td>No. 3 Dumont forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>Austerlitz Insect pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage.</td></tr><tr><td>AC Differential Preamplifier</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL104A</td><td>Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>High/Low-pass Filter</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL125</td><td>Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio.</td></tr><tr><td>Spike Trigger</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL201</td><td>Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Audio Amplifier &amp;amp; speakers</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL120S</td><td>Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Digitimer</td><td>PM3380A</td><td>We use this old model but any standard oscilloscope will suffice.</td></tr><tr><td>Piezo electroceramic&amp;nbsp; wafer</td><td>Morgan Electroceramics, Southampton UK</td><td>PZT507</td><td>Electrophysiology/computer interface</td></tr><tr><td>Piezo electroceramic&amp;nbsp; powersupply</td><td>Home made</td><td></td><td>0-200 V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface.</td></tr><tr><td>Electrophysiology Software</td><td>Cambridge Electronic Design (CED)</td><td>Spike2 v7</td><td>Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software</td></tr><tr><td>Laboratory interface</td><td>Cambridge Electronic Design (CED)</td><td>1401 micro</td><td>Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement.</td></tr><tr><td>FM1-43/Synaptogreen C4</td><td>Biotium/Cambridge Bioscience</td><td>BT70020</td><td>Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis.</td></tr><tr><td>Advasep 7</td><td>Biotium/Cambridge Bioscience</td><td>BT70029</td><td>A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (&amp;amp; other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence.</td></tr><tr><td>Retiga Exi Fast 1394</td><td>Qimaging</td><td></td><td>Monochrome, cooled CCD camera - basic model</td></tr><tr><td>Volocity 3D Image Analysis Software</td><td>Perkin Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>Image capture and analysis software.</td></tr></tbody></table>

combined recording of mechanically stimulated afferent output and nerve terminal labelling in mouse hair follicle lanceolate endings

新規解剖記録技術は、マウスの耳介における毛の機械的変位によって引き起こさ求心性発火を監視するために記載されています。技術は非常に費用対効果の高い、容易に一般的にほとんどの電気生理学研究室で見つかった物質で行われ、または容易に購入です。解剖は、独自のソフトウェアによって制御される一般的な電気セラミックウェハが提供する機械的変位で、シンプルで早いのが特長です。同ソフトウェアは、レコードとelectroneurogram出力を分析します。誘発神経活動の記録は、火災研磨標準ガラス微小電極に接続されている商業用差動アンプを介して行われます。役立つヒントを準備刺激および記録品質を最適化する記録条件の品質を向上させるために与えられます。システムは、だけでなく、毛包の柵終末の披針形端子の電気生理学的および光学的特性を測定するのに適していますそれらの薬理学的および/または遺伝子操作からの結果。スチリルピリジニウム生体色素で機械的刺激とラベリングして電気的記録を組み合わせた例が与えられています。

電気生理学的記録装置は、毛包を露出するために除去し、皮下の脂肪組織で、 図1Aに示されています。この露出領域の一部が、図1Bに明視野照明でより高い倍率で示されています。このエリアにアップし、バック自体に耳介のマージンを折ることは、表皮表面を露出させます。これは、折り目の端に毛が鈍いプローブ（図示せず）と機械的刺激のための理想的な状況では、水平方向に突出するように配置する。 図1Cは、染料の暴露後にし、再び展開された位置に余裕を返すことを示し、刺激卵胞この位置でスチリルピリジニウム色素で標識されています。製剤からElectroneurogramsは、典型的には、最大サイズ（ 図2AのAPを含む、偶数ガラスファイバープローブの課さ運動の不在下で進行中のAP活性を示します<strオング&gt; I〜III）。活動は、刺激の期間の間の間隔の自動相関は非常に平坦であるように、張性のない構造や兆しを見せない、約10〜20インパルス/秒（「スパイク」のトレース）の割合で発生します。 5 Hzの時には、毛幹の100μmの機械的刺激は、全体の出力は、一般的に20から50インパルス/秒、または正弦波サイクル当たり4-10に上昇します。サイクルヒストグラムの建設は、その後の応答（ &#39;相ロックいわゆる&#39;）強い巻き込みを明らかにする（ 図2BI-III））。応答がロックされるときの波形の位相、 すなわち毛運動のどの点振動プローブそれ接点で、それらの位置に依存するが、これは、非常に再現性があります。 （水平線は、A（I-III）における神経像トレースを横切る）単純な閾値検出は、この分析のために使用されてきました。しかし、記録ソフトウェア機能は、多くの場合に、より洗練された方法で使用することができますスパイクの大きさ及び形状の特徴を識別する。そして、これは擬似シングルユニット記録の分析を行うことができるようにするために、これらの特性により、特定の求心性線維の応答を分離することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53854/53854fig1.jpg" /> 図1：耳介を示す電気生理学的実験のために設定電気生理学的記録の配置とN-（3-triethylammoniumpropyl）-4-（4-（ジブチルアミノ）スチリル）毛包求心性披針形の語尾のピリジブロマイドラベリング （A）Aの耳介の準備方位、神経の位置、記録電極と脂肪組織の除去後の毛包神経支配の露出面積。 （B）複数の毛包が真皮にまで上層の脂肪組織のクリアエリア内の明視野照明に表示されます。暗い、通常bilobed、形状は皮脂腺です。 （ <st栄&gt; C）スチリル色素N-（3-triethylammoniumpropyl）-4-（4-（ジブチルアミノ）スチリル）ピリジニウムブロミドと落射蛍光顕微鏡による機械的刺激後に撮像されたで標識された2つの披針形語尾を示すBで箱入りの領域）の拡大図。 7からは、許可を得て。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53854/53854fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53854/53854fig2.jpg" /> 図2：マウス耳介から録画（A）刺激誘発活動。標準Lileyの生理食塩水溶液中介からの連続neurogramsからのアクティビティの、3つの異なる実験から採取した（ 愛-iii）の例としては、。各レコードは、の正弦波変位の3秒の期間を含む記録開始後5秒区間約5分を示しています毛幹のモールの数。機械的刺激は、通常、1〜2時間続いた連続記録、全体で30秒毎に繰り返しました。カスタムスクリプトファイルは、水平カーソル（スパイク）によって設定された閾値と、各正弦波の周期（期間）の発症を交差させ、個々のイベントをマーク。 （AIV）正弦波変位する指令信号。 （B）刺激誘発スパイク活動の分析。 3°のビンで（ バイiii）のサイクルヒストグラムは、ガラスプローブによって毛幹の5 Hzの正弦波変位による機械的刺激に対する推測披針形の語尾の応答を示す、（ 愛-iii）は 、それぞれ神経像サンプルから構成される。機械的プローブの開始位置への相対的な位置に応じて、周期の異なる段階で、マークされた位相ロックに注意してください。 （BIV）正規化されたプローブの変位正弦波;実際の振幅は約100でした1;メートル<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53854/53854fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.

マウスの毛包披針形エンディングで機械的に刺激された求心性の出力および神経ターミナルラベリングの複合記録

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

combined-recording-mechanically-stimulated-afferent-output-nerve

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.4K ビュー.  University of Aberdeen. A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.

ビデオ: Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the postsynaptic activity of a single ribbon synapse 1-4. Ribbon synapses of sensory cells release neurotransmitter continuously, the rate of which is modulated in response to graded changes in IHC membrane potential 5. Ribbon synapses have been shown to operate by multivesicular release, where multiple vesicles can be released simultaneously to evoke excitatory postsynaptic currents (EPSCs) of varying amplitudes 1, 4, 6-11. Neither the role of the presynaptic ribbon, nor the mechanism underlying multivesicular release is currently well understood.
The IHC is innervated by 10-20 auditory nerve fibers, and every fiber contacts the IHC with a unmyelinated single ending to form a single ribbon synapse. The small size of the afferent boutons contacting IHCs (approximately 1 &mu;m in diameter) enables recordings with exceptional temporal resolution to be made. Furthermore, the technique can be adapted to record from both pre- and postsynaptic cells simultaneously, allowing the transfer function at the synapse to be studied directly 2. This method therefore provides a means by which fundamental aspects of neurotransmission can be studied, from multivesicular release to the elusive function of the ribbon in sensory cells.

Whole-cell patch-clamp recordings from auditory nerve fiber dendrites at the inner hair cell ribbon synapse in the mammalian cochlea.

蝸牛内有毛細胞に接触求心性樹状突起でのシナプス後録音：リボンシナプスでのモニタリングの多胞体のリリース

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

神経科学

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials and Electrocorticograms in Response to Nociceptive Laser Stimuli from Freely Moving Rats

Electrocortical responses, elicited by laser heat pulses that selectively activate nociceptive free nerve endings, are widely used in many animal and human studies to investigate the cortical processing of nociceptive information. These laser-evoked brain potentials (LEPs) consist of several transient responses that are time-locked to the onset of laser stimuli. However, the functional properties of the LEP responses are still largely unknown, due to the lack of a sampling technique that can simultaneously record neural activities at the surface of the cortex (i.e., electrocorticogram [ECoG] and scalp electroencephalogram [scalp EEG]) and inside the brain (i.e., local field potential [LFP]). To address this issue, we present here an animal protocol using freely moving rats. This protocol is composed of three main procedures: (1) animal preparation and surgical procedures, (2) a simultaneous recording of ECoG and LFP in response to nociceptive laser stimuli, and (3) data analysis and feature extraction. Specifically, with the help of a 3D-printed protective shell, both ECoG and LFP electrodes implanted on the rat&#39;s skull were securely held together. During data collection, laser pulses were delivered on the rat&#39;s forepaws through gaps in the bottom of the chamber when the animal was in spontaneous stillness. Ongoing white noise was played to avoid the activation of the auditory system by the laser-generated ultrasounds. As a consequence, only nociceptive responses were selectively recorded. Using the standard analytical procedures (e.g., band-pass filtering, epoch extraction, and baseline correction) to extract stimulus-related brain responses, we obtained results showing that LEPs with a high signal-to-noise ratio were simultaneously recorded from ECoG and LFP electrodes. This methodology makes the simultaneous recording of ECoG and LFP activities possible, which provides a bridge of electrocortical signals at the mesoscopic and macroscopic levels, thereby facilitating the investigation of nociceptive information processing in the brain.

We developed a technique that simultaneously records both electrocorticography and local field potentials in response to nociceptive laser stimuli from freely moving rats. This technique helps establish a direct relationship of electrocortical signals at the mesoscopic and macroscopic levels, which facilitates the investigation of nociceptive information processing in the brain.

大脳皮質の局所電界電位と自由行動ラットから侵害受容のレーザー刺激への応答で Electrocorticograms の同時録音

Electrocortical responses, elicited by laser heat pulses that selectively activate nociceptive free nerve endings, are widely used in many animal and ...

行動学

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Understanding vestibular hair cells function under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this function is a vital step in the development of preventative approaches and/or novel therapeutic strategies. However, the majority of studies looking at abnormal vestibular function have not been at the cellular level but focused primarily on behavioral assays of vestibular dysfunction such as gait analyses and vestibulo-ocular reflex performance. While this work has yielded valuable data about what happens when things go wrong, little information is gleaned regarding the underlying causes of dysfunction. Of the studies that focus on the cellular and subcellular processes that underlie vestibular function, most have relied on acutely isolated hair cells, devoid of their synaptic connections and supporting cell environment. Therefore, a major technical challenge has been access to the exquisitely sensitive vestibular hair cells in a preparation that is least disrupted, physiologically. Here we demonstrate a semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium that retains the local micro-environment including hair cell/primary afferent complexes.

Analysis of vestibular hair cell function is complicated by their location deep within the hardest part of the skull, the petrous temporal bone. Most functional hair cell studies have used acutely isolated hair cells. Here we describe a semi-intact preparation of mouse vestibular epithelium for electrophysiological and two-photon microscopy studies.

電気生理学および高分解能二光子顕微鏡用マウス前庭感覚上皮の切り抜き半無傷準備

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

マウス皮膚や毛包パターニングおよび感覚軸索形態の解析への応用のフラットマウントイメージング

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

アン<em&gt;体外</em筋求心性神経の焼成特性を研究するための&gt;成体マウス筋肉神経の準備

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The approach allows unbiased identification and functional characterization of individual colorectal afferents. Extracellular recordings of propagated action potentials (APs) that originate from one or a few afferent (i.e., single-fiber) receptive fields (RFs) in the colorectum are made from teased nerve fiber fascicles. The colorectum is removed with either the pelvic (PN) or lumbar splanchnic (LSN) nerve attached and opened longitudinally. The tissue is placed in a recording chamber, pinned flat and perfused with oxygenated Krebs solution. Focal electrical stimulation is used to locate the colorectal afferent endings, which are further tested by three distinct mechanical stimuli (blunt probing, mucosal stroking and circumferential stretch) to functionally categorize the afferents into five mechanosensitive classes. Endings responding to none of these mechanical stimuli are categorized as mechanically-insensitive afferents (MIAs). Both mechanosensitive and MIAs can be assessed for sensitization (i.e., enhanced response, reduced threshold, and/or acquisition of mechanosensitivity) by localized exposure of RFs to chemicals (e.g., inflammatory soup (IS), capsaicin, adenosine triphosphate (ATP)). We describe the equipment and colorectum&#8211;nerve recording preparation, harvest of colorectum with attached PN or LSN, identification of RFs in the colorectum, single-fiber recording from nerve fascicles, and localized application of chemicals to the RF. In addition, challenges of the preparation and application of standardized mechanical stimulation are also discussed.

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.

マウス大腸求心性終末の体外機能解析では、

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

医学

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

の毛包披針形語尾に神経末端標識リビングの光監視<em&gt; ex vivoで</em&gt;マウスの耳皮膚

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

Afferent nerves not only convey information concerning normal physiology, but also signal disturbed homeostasis and pathophysiological processes of the different organ systems from the periphery towards the central nervous system. As such, the increased activity or &#39;sensitization&#39; of mesenteric afferent nerves has been allocated an important role in the pathophysiology of visceral hypersensitivity and abdominal pain syndromes.
Mesenteric afferent nerve activity can be measured in vitro in an isolated intestinal segment that is mounted in a purpose-built organ bath and from which the splanchnic nerve is isolated, allowing researchers to directly assess nerve activity adjacent to the gastrointestinal segment. Activity can be recorded at baseline in standardized conditions, during distension of the segment or following the addition of pharmacological compounds delivered intraluminally or serosally. This technique allows the researcher to easily study the effect of drugs targeting the peripheral nervous system in control specimens; besides, it provides crucial information on how neuronal activity is altered during disease. It should be noted however that measuring afferent neuronal firing activity only constitutes one relay station in the complex neuronal signaling cascade, and researchers should bear in mind not to overlook neuronal activity at other levels (e.g., dorsal root ganglia, spinal cord or central nervous system) in order to fully elucidate the complex neuronal physiology in health and disease.
Commonly used applications include the study of neuronal activity in response to the administration of lipopolysaccharide, and the study of afferent nerve activity in animal models of irritable bowel syndrome. In a more translational approach, the isolated mouse intestinal segment can be exposed to colonic supernatants from IBS patients. Furthermore, a modification of this technique has been recently shown to be applicable in human colonic specimens.

In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments

Mesenteric afferent nerves convey information from the gastrointestinal tract towards the brain regarding normal homeostasis as well as pathophysiology. Gastrointestinal afferent nerve activity can be assessed by mounting isolated intestinal segments with attached afferent nerves into an organ bath, isolating the nerve, and assessing basal as well as stimulated activity.

マウス空腸および結腸セグメントにおける腸間膜求心性神経活動のin vitro記録で

Afferent nerves not only convey information concerning normal physiology, but also signal disturbed homeostasis and pathophysiological processes of the ...

Terminal H-reflex Measurements in Mice

The Hoffmann reflex (H-reflex), as an electrical analog to the stretch reflex, allows electrophysiological validation of the integrity of neural circuits after injuries such as spinal cord damage or stroke. An increase of the H-reflex response, together with symptoms like non-voluntary muscle contractions, pathologically augmented stretch reflex, and hypertonia in the corresponding muscle, is an indicator of post-stroke spasticity (PSS).
In contrast to rather nerve-unspecific transcutaneous measurements, here, we present a protocol to quantify the H-reflex directly at the ulnar and median nerves of the forepaw, which is applicable, with minor modifications, to the tibial and sciatic nerve of the hindpaw. Based on the direct stimulation and the adaptation to different nerves, the method represents a reliable and versatile tool to validate electrophysiological changes in spasticity-related disease models.

The clinical evaluation of spasticity based on the Hoffmann reflex (H-reflex) and using electrical stimulation of peripheral nerves is an established method. Here, we provide a protocol for a terminal and direct nerve stimulation for H-reflex quantification in the mouse forepaw.

マウスにおける終末H反射測定

The Hoffmann reflex (H-reflex), as an electrical analog to the stretch reflex, allows electrophysiological validation of the integrity of neural circuits ...

生物学

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicles

Source: Bewick, G. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53854">Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the combined recording of mechanically stimulated afferent output and nerve terminal labeling in the hair follicles of a mouse pinna. It outlines the steps involved in the mechanical stimulation of hair follicle nerve terminals before and after exposure to a fluorescent membrane dye, electrophysiology recording of the generated action potentials, and visualization of the nerve terminal labeling in the hair follicles.

マウス毛包における機械的に刺激された求心性出力と神経終末標識の複合記録

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Electrophysiological Recording ...