この研究は、国立科学財団の助成金IOS-1025642（GBM）によってサポートされていました。我々はARqua1株を提供するためのマリア・ハリソンに感謝します。

1.ガイドRNAの設計とベクター構築<ol><li>目的の遺伝子のための標的配列を同定します。このステップ13,14に適したオンラインCRISPRターゲット発見の様々なプログラムがあります。 注：ここでは、GN 20 GGの標的モチーフを使用していますが、他の設計は、使用するアプリケーションまたはベクターシステムに応じて適切であり得ます。 </li><li> DNAの組み立てに必要とされる5 &#39;および3&#39; 20-ntの配列が隣接標的モチーフのGN 19の部分を含むようにデザイン60-merのgRNAオリゴ。最終的な60マーモチーフはある：5&#39;-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN 19 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3」。 注：標準、脱塩したプライマーは正常に動作します。 </li><li>アセンブリのための4つのDNA（ 図1）を準備します。 DNA配列のための補足ファイルを参照してください。 <ol><li> 2時間37℃で1×緩衝液4中の制限酵素のSpeIとCas9 10プラスミド：p201N5μgの- 1ダイジェスト。ダイジェスト列は、浄化します製造元の指示にccording。 〜10 mMトリス - 塩酸15μlのを中に再懸濁し、UV分光光度法により定量化します。 </li><li>第2時間、25℃で1×緩衝液3.1に制限酵素SWA Iで消化を行います。完全な消化を確認するために、0.8％アガロースゲル上でngの200から100を確認してください。 注：正しく消化されたプラスミドは、14313塩基対で単一のバンドを持っています。注：酵素や脱リン酸化の熱不活性化は必要ありません。消化されたプラスミドは、-20℃で保存することができます。 </li><li> PCRは、それぞれ、プライマーSWA I_MtU6F / MtU6RとScaffoldF / Speを I_ScaffoldRを使用してのpUC gRNAシャトル10プラスミドからのMedicago truncatula（MT）U6プロモーターと足場のDNAを増幅します。 PCR条件と高忠実度ポリメラーゼ使用：3分間95℃。 （15秒、30秒、72℃20秒間、98℃、60℃）を31サイクル;そして5分間72℃。 <ol><li> PCR PRの〜3μlのアリコートを可視化増幅を確認するために1％アガロースゲル上でoducts。 MtU6アンプリコンは377 bpであり、足場のアンプリコンは106 bpです。 -20℃でUV分光光度法およびストアによって定量化、製造者の指示に従って、残りのPCR産物をカラム精製します。 </li></ol></li><li>実験室グレードの水中で100μMのgRNAオリゴの管全体を再懸濁します。バッファー（1x）2.1の500μlに100μMオリゴの1μLを加えます。よく混ぜます。複数のオリゴをプールする場合は、バッファー（1x）2.1管に各100μMのオリゴの1μlを添加します。希釈されたオリゴは、-20℃で保存することができます。 </li></ol></li><li>加熱蓋を使用して、50℃で保持するためのサーマルサイクラーをプログラムします。 MtU6プロモーターの線形化ベクター100ng（0.011ピコモル）、50 ngの（0.2ピコモル）、12 ngの足場の（0.2ピコモル）、希gRNAオリゴ（複数可）の1μL（0.2ピコモル）、および水の体積にコンバイン5μlの。 、2倍の高忠実度DNAアセンブリマスターミックスの5μLを加え、よく混ぜるとスピンダウン。 60分間反応をインキュベート50°Cサーマルサイクラー。その後、氷上で反応を置きます。 注：反応容量は低いDNA収量を収容するように増加させることができます。 </li><li>コンピテントE.への反応の2μLを変換します50 mgのLを-1カナマイシン（菅50）を補充したLB上の標準的な技術やプレートを使用して大腸菌細胞。 37℃で一晩平板培養細胞を成長させます。 -20℃で、残りのDNA集合反応を保存します。 </li><li>プライマーStUbi3P218RとISceIRを用いたPCRによるコロニー画面。 5：水1で、残りのDNAアセンブリ反応のアリコートを希釈します。無挿入制御などCas9プラスミド：陽性コロニー画面の制御と円形p201N 1ngのよう1μLを使用してください。 <ol><li> PCR条件で増幅します。 3分間95°C; 31サイクル（30秒95℃、30秒間58℃、30秒間72°C）。そして5分間72℃。 1％アガロースゲル上でPCR産物を可視化します。正しい挿入は725 bpおよびベクトルウィットでバンドを持っていることを確認してくださいハウトインサート（ 例えば 、切断されていないベクトル）310-bpのバンドを持っています。 </li></ol></li><li> 37℃で一晩LB菅50液体培養で陽性コロニーを成長させ、製造元の指示に従ってプラスミドを精製します。サンガーシーケンスはStUbi3P218Rプライマーとプラスミドとエラーがクローニング中に導入されなかった確実にするためにMtU6プロモーター、ターゲット、および足場配列にクロマトグラムを揃えます。 </li><li> エコ RVおよびSTY Iでプラスミドの〜1μgのを消化することによってダイジェスト診断を実行します0.8％アガロースゲル上で可視化します。 （塩基対で）断片は、以下のとおりです。4192、2001、1743、1544、1381、995、831、702、460、423、318、および174。 </li><li>複数gRNAsでベクターを構築するためにDNAのアセンブリを使用してください。 <ol><li> 2 gRNAカセットを有するベクターを構築するために、PCRは、それぞれの各1 ngのからUNS1_MtU6F / Speを I_ScaffoldRプ ​​ライマーを用いてプライマーSWA I_MtU6F / UNS1_ScaffoldRと第2の位置gRNAで最初の位置gRNAを増幅します1.8 - 手順1.1で構築したプラスミド。ステップ1.3.3でPCR条件を使用してください。増幅を確認するために1％アガロースゲル上でPCR産物の〜3μlのアリコートを視覚化します。アンプリコンは〜500bpです。 </li><li>合わせて、200μlの管に未精製のPCR産物のほぼ等量を混合（典型的には3 - 各4μlの）。アセンブリのために、PCR産物を組み合わせた1μlを添加、SWA IおよびSpeの50 ngのは、私がp201N直線化：2.5μlのと2倍の高忠実度DNAアセンブリマスターミックスの2.5μlにCas9、実験室グレードの水を。 15分間50℃でサーマルサイクラーでインキュベートします。 注：DNA組立マニュアル2のための15分間のインキュベーションをお勧めします - 3断片を。 </li><li>コンピテントE.に2μlの- 1を変換しますLBカン50上の大腸菌細胞とプレート。 37℃で一晩播種した細胞を成長させます。 -20℃で残りの反応を保存します。 </li><li>ステップ1.6と同様の条件でプライマーStUbi3P218RとISceIRを用いたPCRによるコロニー画面。正しいClonesは1200 bpのアンプリコンを持つことになります。 LB館で陽性コロニー50の液体培養物を、一晩増殖し、プラスミドを精製します。 </li><li>プライマーStUbi3P218R（最初の位置gRNAをカバー）とp201R（第2位置gRNAをカバー）とサンガーシーケンスプラスミド。 MtU6プロモーター、ターゲット、および足場配列にクロマトグラムを合わせます。 エコ RVおよびSTYと診断ダイジェスト私は（塩基対で）以下の断片になります：4192、2476、1743、1544、1381、995、831、702、460、423、318、174太字の断片は、第二gRNAが含まれています。 </li></ol></li><li>すべての品質管理の期待に応えた後、 アグロバクテリウム・リゾゲネス株ARqua1 15にプラスミドを形質転換します。 2.4 kVの、25μF、および200Ω：設定で1ミリメートルのキュベット内のエレクトロ細胞とエレクトロポレーションの50μlに、プラスミドプレップの1μlを添加します。 SOCの〜500μlの中で細胞を回収し、2時間28℃で振とうします。 LB菅50とグラム上のプレート2日間28℃で行。 1.3.3と同じプライマー及びPCR条件を用いたコロニー画面を実行します。陽性クローンからグリセロールストックを作ります。 </li></ol> 2.毛状根形質転換<ol><li>一定に混合しながら、15分間、20％の家庭用漂白剤でのトマトの種子を滅菌します。層流フード中で、漂白剤を除去し、無菌実験室グレードの水で3回洗浄します。 </li><li> ½MS培地（2.22グラムのL -1 MS塩+ガンボーグビタミン、10グラムのL -1スクロース、3グラムL -1ジェランガム、pHは5.8）を含むGA-7ボックス内のプレート30の種子。光にGA-7ボックスを移動した後、暗所で〜2日間発芽。光の中で〜4日分以上の苗を育てます。 </li><li>変換前の日、ストリークアウトA.固体LBカン50の文化をリゾゲネス 、一晩28℃で成長します。 </li><li>変態の日、層流フード内で無菌の材料組み立てる：12ミリリットル培養管を、50mlコニカルチューブ1/2 MS液体（無ゲラングラムUM）、200μMのアセトシリンゴン、濾紙、ペトリ皿、ピンセットやメス、ピペット及びピペットチップ。 1/2 MS 50mlにアセトシリンゴンの25μlを添加して、各培養チューブに〜6ミリリットルを注ぎます。 </li><li> A.をこすりするために曲がった200μlのチップを使用します½MS液体の6ミリリットル中にプレートを再懸濁からリゾゲネス細胞 。ボルテックスチューブは完全に細胞を再懸濁します。各ベクターからの細胞を再懸濁した後、600 nMでの固定波長で細胞を1mlの光学密度（OD）を測定します。 ODが0.2と0.4の間であることを確認します。希釈又は、必要に応じて複数のセルを追加します。各構築物について、この手順を繰り返します。 </li><li>滅菌ろ紙でペトリ皿にの1/2 MS液体〜2ミリリットルを追加します。湿らせたろ紙上の苗木と場所から消費税子葉。一旦全ての子葉は、2つの切断端部を有する子葉片で、その結果、子葉のオフ遠位〜1cmにカットし、収集されました。 A.に外植片を追加します。 リゾゲネス溶液は、混合し、20分間インキュベート時折反転しています。 注意：構造物あたり約12の外植片が日常的に使用され、多くの80として外植片をA. 6mlに接種されているもののリゾゲネスソリューション 。 </li><li> A.間、 リゾゲネスのインキュベーション、1あたりの構築物は、形質転換、ペトリ皿にろ紙を追加します。また、乾燥する層流フードで、½MS固形培地、抗生物質なしを設定します。 </li><li> A.から子葉をスクープ乾燥ろ紙上の滅菌ピンセットと場所とリゾゲネスソリューション 。次の変換処理中に、組織が乾燥しないようにペトリ蓋でカバーしています。 MS培地を1/2にろ紙と転送、背軸側を上にブロット子葉、。外科手術用テープでプレートをラップし、2日間室温で暗所での共同開拓。 </li><li>共培養した後、子葉を転送し、背軸側を上に、残油の成長を防止するために、300 mgのLを添加したMS培地-1チカルシリン/クラブラン酸（ティム300を 、1/2にUALのA.リゾゲネス ）とカン50（植物選択用）および外科テープで包みます。 16時間の光周期で、室温で蛍光灯の下での培養を維持します。 </li><li>長さは2週間の根2cm以上滅菌ピンセットやメスを使用して、子葉から切り出し、MSカン50ティム300メディアを1/2に転送されます- 〜1.5後。単一のプレートに10〜15の根を転送します。マーク・マーカーと根の先端の位置、外科手術用テープでラップし、培養室で維持します。 </li><li>一週間後、形質転換された根は、選択培地上で成長が見られます。好適なDNA抽出法を用いて、DNA抽出のための形質転換根のサブサンプルを収穫。注：子葉を持つプレートは2のために保つことができる - もつれた混乱に成長し、単離することが困難である根を指した後3週ごとの収穫、。非収穫根組織を無期限に維持することができます。種々のアッセイは、単離されたDNA試料に対して実施することができますDNA変異の頻度及び種類を決定することです。いくつかのこのようなアッセイの結果を以下に記載します。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

Since DNA assembly is used to recombine any overlapping DNA sequences, this cloning method can be applied to any CRISPR vector construction. Most CRISPR cloning schemes use either gene synthesis of the gRNA, type IIS restriction enzymes17,18, or overlap-extension PCR19. Each of these techniques has inherent advantages and disadvantages, but they typically require multiple hands-on cloning steps. The primary advantage of the cloning method presented here is that the entire process occurs in a single,...

CRISPR / Cas9で標的DNAの変更を生成する能力は、機能的ゲノム研究のための大きな可能性を秘めています。 CRISPR / Cas9システムの2つのコンポーネントがあります。 ブドウ球菌化膿連鎖球菌と、標的DNA部位（複数可）1にCas9を指示およそ100-ntのガイドRNA（gRNA）分子に由来Cas9ヌクレアーゼ、。標的認識は、最初にによって与えられる〜ターゲティングベクター2,3の高スループット生産を可能にするgRNA、20-NT。操作することができるほとんどの生物は、既にCRISPR / Cas9技術4,5とされています。 植物では、例えば、CaMV35Sプロモーターなどの構成的プロモーターは、一般にCas9ヌクレアーゼ6の発現を駆動するために使用されます。 gRNAsはgRNAの最初の塩基を制限するRNAポリメラーゼIII U6またはU3プロモーターを用いて表現しているのいずれかG、効率的な転写のためのU3のためのU6、またはA、のために。しかし、RNAポリメラーゼIIのプロムこれらの制限のないotersも、7,8を使用されています。 異なるgRNAsは異なる効率を有するDNAの突然変異を誘発し、最初に全植物の形質転換に投資するか、大規模な表現型の画面を設定する前に、CRISPRベクトルを検証するために重要であり得ます。植物におけるCRISPRコンストラクトの一過性発現は、例えば、アグロインフィルトレーションを使用して、一般的なアプローチでは非実用的変異の検出が困難と表現型のアッセイを行うこと、安定した植物体6と比較して、DNA修飾の低い周波数になります。いわゆる毛状根は、安定した植物についてヶ月とは対照的に独立した、安定に形質転換された材料の多くは、数週間以内に発生させることができるので便利で、代替システムです。 CRISPRベクターは、毛状根9,10においてDNA突然変異を誘発するのに非常に効果的です。 DNAアセンブリ方法は、効率的overlを含むDNA断片を連結しますappingは11を終了します。いくつかのDNAの組み立て方法の主な利点は、組み立てられた製品へのssDNA（ すなわち 、オリゴ）を組み込む能力です。 gRNAsのみ〜20ヌクレオチド長であり、新たなターゲットが合成オリゴを用いて作製することができるので、これらのDNAアセンブリ方法は、CRISPRクローニングに適しています。ここに記載されたプロトコルが正常に大豆10、ポプラ12で使用され、現在はトマトされたCRISPRベクトルのP201シリーズに基づいています。提示クローニング手順は、現在のクローニング法10の上にいくつかの利点を提供しています。すなわち、完全に機能的なベクターは、1日に単一クローニング反応で生成することができます。ベクター構築はさらに手をオン還元時間と材料費、並行して複数のCRISPRベクトルを生成するためにプールすることができます。我々はまた、標的遺伝子の欠失を有するトランスジェニック材料を製造するための効率的な方法として、トマト毛状根を生成するためのプロトコルを提示します。毛状根を有効に使用されていますCRISPRベクトルを食べ、その後の実験のための材料を提供します。

<table><tbody><tr><td>NEBuilder&amp;reg; (HiFi DNA assembly mix)</td><td>New England Biolabs</td><td>E5520</td><td></td></tr><tr><td>p201N:Cas9</td><td>Addgene</td><td>59175</td><td>The p201H:Cas9 plasmid (59176) is also compatible with the reported overlaps and enzymes.</td></tr><tr><td>pUC gRNA Shuttle</td><td>Addgene</td><td>47024</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Swa&lt;/em&gt;I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0604S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Spe&lt;/em&gt;I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>Zymo clean and concentrator-5 column purification</td><td>Zymo Research</td><td>D4003</td><td></td></tr><tr><td>NEB Buffer 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7202S</td><td></td></tr><tr><td>NEB CutSmart (Buffer 4)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>NEB Buffer 3.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7203S</td><td></td></tr><tr><td>EconoSpin Mini Spin Column (plasmid prep)</td><td>Epoch Life Sciences</td><td>1910-050/250</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV-HF&amp;reg;</td><td>New England Biolabs</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td>StyI-HF&amp;reg;</td><td>New England Biolabs</td><td>R3500S</td><td></td></tr><tr><td>MS Salts + Gamborg Vitamins</td><td>Phytotechnology Laboratories</td><td>M404</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel&amp;trade; (gellan gum)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>GA-7 Boxes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V8505</td><td></td></tr><tr><td>Micropore&amp;trade; surgical tape</td><td>3M</td><td>1535-0</td><td></td></tr><tr><td>Timentin&amp;reg; (Ticarcillin/Clavulanic acid)</td><td>Various</td><td>0029-6571-26</td><td></td></tr><tr><td>Primers 5&#039; &amp;#8594; 3&#039;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SwaI_MtU6F&amp;nbsp;</td><td>&lt;strong&gt;GATATTAATCTCTTCGATGA&lt;br/&gt;AATTT&lt;/strong&gt;ATGCCTATCTTATAT&lt;br/&gt;GATCAATGAGG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MtU6R&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>AAGCCTACTGGTTCGCTTG&lt;br/&gt;AAG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ScaffoldF&amp;nbsp;</td><td>GTTTTAGAGCTAGAAATAGC&lt;br/&gt;AAGTT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Spe&lt;/em&gt;I_Scaffold R</td><td>&lt;strong&gt;GTCATGAATTGTAATACGACTC&lt;br/&gt;A&lt;/strong&gt;AAAAAAAGCACCGACTCGGTG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StUbi3P218R&amp;nbsp;</td><td>ACATGCACCTAATTTCACTA&lt;br/&gt;GATGT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISceIR</td><td>GTGATCGATTACCCTGTTAT&lt;br/&gt;CCCTAG</td><td>Cannot be used for Sanger sequencing since there is a second binding site on the plasmid</td><td></td></tr><tr><td>UNS1_Scaffold R&amp;nbsp;</td><td>GAGAATGGATGCGAGTAATGAA&lt;br/&gt;AAAAAGCACCGACTCGGTG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UNS1_MtU6 F&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>CATTACTCGCATCCATTCTCAT&lt;br/&gt;GCCTATCTTATATGATCAATGAGG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p201R&amp;nbsp;</td><td>CGCGCCGAATTCTAGTGATCG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bolded sequences denote 20-nt overlaps with linearized p201N:Cas9.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput crispr vector construction and characterization of dna modifications by generation of tomato hairy roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

DNAアセンブリとCRISPRベクター構築は、一般的に独立したクローンの数十〜数百を生成します。 PCRによるコロニーのスクリーニングは簡単なトラブルシューティングのために有用である（ 図2A）の正確なクローンを識別し、インサートを有するとせずに、プラスミドを区別することができます。一般的に、クローンのすべては、インサートを含み、ユーザ...

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High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

トマト毛状根の発生によるDNAの修飾のハイスループットCRISPRベクター構築と特性

DNAアセンブリを使用して、複数のCRISPRベクトルが単一クローニング反応に並列に構築することができ、CRISPR多数の構造を作ることは簡単な作業ベクトル。トマト毛状根は、CRISPRベクトルを検証し、突然変異体材料を生成するための優れたモデルシステムです。

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

high-throughput-crispr-vector-construction-characterization-dna

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

17.8K ビュー.  Boyce Thompson Institute for Plant Research.  DNAアセンブリを使用して、複数のCRISPRベクトルが単一クローニング反応に並列に構築することができ、CRISPR多数の構造を作ることは簡単な作業ベクトル。トマト毛状根は、CRISPRベクトルを検証し、突然変異体材料を生成するための優れたモデルシステムです。 

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Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to possess medicinally relevant biological activity. However, thus far this potential has not translated into a plethora of triterpene-derived drugs in the clinic. This is arguably (at least partially) a consequence of limited practical synthetic access to this class of compound, a problem that can stifle the exploration of structure-activity relationships and development of lead candidates by traditional medicinal chemistry workflows. Despite their immense diversity, triterpenes are all derived from a single linear precursor, 2,3-oxidosqualene. Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in N. benthamiana can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products that are not naturally produced by this host. Agro-infiltration is an efficient and simple means of achieving transient expression in N. benthamiana. The process involves infiltration of plant leaves with a suspension of Agrobacterium tumefaciens carrying the expression construct(s) of interest. Co-infiltration of an additional A. tumefaciens strain carrying an expression construct encoding an enzyme that boosts precursor supply significantly increases yields. After a period of five days, the infiltrated leaf material can be harvested and processed to extract and isolate the resulting triterpene product(s). This is a process that is linearly and reliably scalable, simply by increasing the number of plants used in the experiment. Herein is described a protocol for rapid preparative-scale production of triterpenes utilizing this plant-based platform. The protocol utilizes an easily replicable vacuum infiltration apparatus, which allows the simultaneous infiltration of up to four plants, enabling batch-wise infiltration of hundreds of plants in a short period of time.

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in Nicotiana benthamiana leaves can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products. Herein is described a detailed protocol for rapid (5 days) preparative-scale production of triterpenes and analogs utilizing this powerful plant-based platform.

一過性発現タバコにおける葉トリテルペン用分取スケールで

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

生化学

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to agriculture. However, the Ralstonia model is considerably underexplored in comparison to other models involving bacterial plant pathogens, such as Pseudomonas syringae in Arabidopsis. Research targeted to understanding the interaction between Ralstonia and crop plants is essential to develop sustainable solutions to fight against bacterial wilt disease but is currently hindered by the lack of straightforward experimental assays to characterize the different components of the interaction in native host plants. In this scenario, we have developed a method to perform genetic analysis of Ralstonia infection of tomato, a natural host of Ralstonia. This method is based on Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato roots, followed by Ralstonia soil-drenching inoculation of the resulting plants, containing transformed roots expressing the construct of interest. The versatility of the root transformation assay allows performing either gene overexpression or gene silencing mediated by RNAi. As a proof of concept, we used this method to show that RNAi-mediated silencing of SlCESA6 in tomato roots conferred resistance to Ralstonia. Here, we describe this method in detail, enabling genetic approaches to understand bacterial wilt disease in a relatively short time and with small requirements of equipment and plant growth space.

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Here, we present a versatile method for tomato root transformation followed by inoculation with Ralstonia solanacearum to perform straightforward genetic analysis for the study of bacterial wilt disease.

細菌性ウィルト病の簡単な遺伝子解析のためのラストニア・ソラナセアラムによるトマト根形質転換

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...

遺伝学

Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum)

Tartary buckwheat (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possesses various biological and pharmacological activities because it contains abundant secondary metabolites such as flavonoids, especially rutin. Agrobacterium rhizogenes have been gradually used worldwide to induce hairy roots in medicinal plants to investigate gene functions and increase the yield of secondary metabolites. In this study, we have described a detailed method to generate A. rhizogenes-mediated hairy roots in TB. Cotyledons and hypocotyledonary axis at 7&#8211;10 days were selected as explants and infected with A. rhizogenes carrying a binary vector, which induced adventitious hairy roots that appeared after 1 week. The generated hairy root transformation was identified based on morphology, resistance selection (kanamycin), and reporter gene expression (green fluorescent protein). Subsequently, the transformed hairy roots were self-propagated as required. Meanwhile, a myeloblastosis (MYB) transcription factor, FtMYB116, was transformed into the TB genome using the A. rhizogenes-mediated hairy roots to verify the role of FtMYB116 in synthesizing flavonoids. The results showed that the expression of flavonoid-related genes and the yield of flavonoid compounds (rutin and quercetin) were significantly (p &#60; 0.01) promoted by FtMYB116, indicating that A. rhizogenes-mediated hairy roots can be used as an effective alternative tool to investigate gene functions and the production of secondary metabolites. The detailed step-by-step protocol described in this study for generating hairy roots can be adopted for any genetic transformation or other medicinal plants after adjustment.

Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat Fagopyrum tataricum

We describe a method of inducing hairy roots by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation in Tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum). This can be used to investigate gene functions and production of secondary metabolites in Tartary buckwheat, be adopted for any genetic transformation, or used for other medicinal plants after improvement.

アグロバクテリウム・リゾゲネスによる毛深い根を誘発する -タータルソバにおける媒介性形質転換(ファゴピラム・タタリカム)

Tartary buckwheat (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possesses various biological and pharmacological activities because it contains abundant ...

CcCIPK14 Gene Function Analysis to Illuminate the Efficient Root Transgenic System

An efficient and stable transformation system is fundamental for gene function study and molecular breeding of plants. Here, we describe the use of an Agrobacterium rhizogenes mediated transformation system on pigeon pea. The stem is infected with A. rhizogenes carrying a binary vector, which induced callus after 7 days and adventitious roots 14 days later. The generated transgenic hairy root was identified by morphological analysis and a GFP reporter gene.To further illustrate the application range of this system, CcCIPK14 (Calcineurin B-like protein-interacting protein kinases) was transformed into pigeon pea using this transformation method. The transgenic plants were treated with jasmonic acid (JA) and abscisic acid (ABA), respectively, for the purpose of testing whether CcCIPK14 responds to those hormones. The results demonstrated that (1) exogenous hormones could significantly upregulate the expression levelof CcCIPK14, especially in CcCIPK14 over-expression (OE) plants; (2) the content of Genistein in CcCIPK14-OE lines was significantly higher than the control; (3) the expression level of two downstream key flavonoid synthase genes, CcHIDH1 and CcHIDH2, were up-regulated in the CcCIPK14-OE lines; and (4) the hairy root transgenic system can be used to study metabolically functional genes in non-model plants.

CcCIPK14 Gene Function Analysis to Illuminate the Efficient Root Transgenic System

Here we present an efficient and stable transformation system for the functional analysis of the CcCIPK14 gene as an example, providing a technical basis for studying the metabolism of non-model plants.

An efficient and stable transformation system is fundamental for gene function study and molecular breeding of plants. Here, we describe the use of an ...

CRISPRmassを用いたハイスループットUAS-cDNA/ORFプラスミドライブラリーの構築

CRISPR-Based Modular Assembly for High-Throughput Construction of a UAS-cDNA/ORF Plasmid Library

Functional genomics screening offers a powerful approach to probe gene function and relies on the construction of genome-wide plasmid libraries. Conventional approaches for plasmid library construction are time-consuming and laborious. Therefore, we recently developed a simple and efficient method, CRISPR-based modular assembly (CRISPRmass), for high-throughput construction of a genome-wide upstream activating sequence-complementary DNA/open reading frame (UAS-cDNA/ORF) plasmid library. Here, we present a protocol for CRISPRmass, taking as an example the construction of a GAL4/UAS-based UAS-cDNA/ORF plasmid library. The protocol includes massively parallel two-step test tube reactions followed by bacterial transformation. The first step is to linearize the existing complementary DNA (cDNA) or open reading frame (ORF) cDNA or ORF library plasmids by cutting the shared upstream vector sequences adjacent to the 5&#39; end of cDNAs or ORFs using CRISPR/Cas9 together with single guide RNA (sgRNA), and the second step is to insert a UAS module into the linearized cDNA or ORF plasmids using a single step reaction. CRISPRmass allows the simple, fast, efficient, and cost-effective construction of various plasmid libraries. The UAS-cDNA/ORF plasmid library can be utilized for gain-of-function screening in cultured cells and for constructing a genome-wide transgenic UAS-cDNA/ORF library in Drosophila.&#160;

著者スポットライト:CRISPRmass を使用したゲノムワイドプラスミドライブラリー構築の簡素化(英語)

We present a protocol for CRISPR-based modular assembly (CRISPRmass), a method for high-throughput construction of UAS-cDNA/ORF plasmid library in Drosophila using publicly available cDNA/ORF resources. CRISPRmass can be applied to editing various plasmid libraries.

UAS-cDNA/ORFプラスミドライブラリーのハイスループット構築のためのCRISPRベースのモジュラーアセンブリ

Functional genomics screening offers a powerful approach to probe gene function and relies on the construction of genome-wide plasmid libraries. ...

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that cut outside of their recognition sites and create a short overhang. This modular cloning (MoClo) system uses a hierarchical workflow in which different DNA parts, such as promoters, coding sequences (CDS), and terminators, are first cloned into an entry vector. Multiple entry vectors then assemble into transcription units. Several transcription units then connect into a multi-gene plasmid. The Golden Gate cloning strategy is of tremendous advantage because it allows scar-less, directional, and modular assembly in a one-pot reaction. The hierarchical workflow typically enables the facile cloning of a large variety of multi-gene constructs with no need for sequencing beyond entry vectors. The use of fluorescent protein dropouts enables easy visual screening. This work provides a detailed, step-by-step protocol for assembling multi-gene plasmids using the yeast modular cloning (MoClo) kit. We show optimal and suboptimal results of multi-gene plasmid assembly and provide a guide for screening for colonies. This cloning strategy is highly applicable for yeast metabolic engineering and other situations in which multi-gene plasmid cloning is required.

The goal of this protocol is to provide a detailed, step-by-step guide for assembling multi-gene constructs using the modular cloning system based on Golden Gate cloning. It also gives recommendations on critical steps to ensure optimal assembly based on our experiences.

モジュラーゴールデンゲートクローニングを用いた多遺伝子構造の迅速な組み立て

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

生物工学

遺伝子組み換えダイズ毛根の高効率生産

Soybean Hairy Root Transformation for the Analysis of Gene Function

Soybean (Glycine max) is a valuable crop in agriculture that has thousands of industrial uses. Soybean roots are the primary site of interaction with soil-borne microbes that form symbiosis to fix nitrogen and pathogens, which makes research involving soybean root genetics of prime importance to improve its agricultural production. The genetic transformation of soybean hairy roots (HRs) is mediated by the Agrobacterium rhizogenes strain NCPPB2659 (K599) and is an efficient tool for studying gene function in soybean roots, taking only 2 months from start to finish. Here, we provide a detailed protocol that outlines the method for overexpressing and silencing a gene of interest in soybean HRs. This methodology includes soybean seed sterilization, infection of cotyledons with K599, and the selection and harvesting of genetically transformed HRs for RNA isolation and, if warranted, metabolite analyses. The throughput of the approach is sufficient to simultaneously study several genes or networks and could determine the optimal engineering strategies prior to committing to long-term stable transformation approaches.

著者スポットライト:遺伝子機能解析のためのダイズ毛根形質転換  

Here, we present a protocol for the high-efficiency production of transgenic soybean hairy roots.

遺伝子機能解析のためのダイズ毛状根形質転換

Soybean (Glycine max) is a valuable crop in agriculture that has thousands of industrial uses. Soybean roots are the primary site of interaction with ...

トマト毛状根の発生によるDNAの修飾のハイスループットCRISPRベクター構築と特性

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一過性発現タバコにおける葉トリテルペン用分取スケールで

細菌性ウィルト病の簡単な遺伝子解析のためのラストニア・ソラナセアラムによるトマト根形質転換

アグロバクテリウム・リゾゲネスによる毛深い根を誘発する -タータルソバにおける媒介性形質転換(ファゴピラム・タタリカム)

CcCIPK14 Gene Function Analysis to Illuminate the Efficient Root Transgenic System

UAS-cDNA/ORFプラスミドライブラリーのハイスループット構築のためのCRISPRベースのモジュラーアセンブリ

UAS-cDNA/ORFプラスミドライブラリーのハイスループット構築のためのCRISPRベースのモジュラーアセンブリ

UAS-cDNA/ORFプラスミドライブラリーのハイスループット構築のためのCRISPRベースのモジュラーアセンブリ

モジュラーゴールデンゲートクローニングを用いた多遺伝子構造の迅速な組み立て

遺伝子機能解析のためのダイズ毛状根形質転換

遺伝子機能解析のためのダイズ毛状根形質転換