I thank Dr Adamantios Mamais for extracting &#945;-synuclein from human tissue and running of blots. This work was supported in part by a MRC Grant (MR/L010933/1) and in part by the Wellcome Trust/MRC Joint Call in Neurodegeneration award (WT089698) to the UK Parkinson's Disease Consortium (UKPDC) whose members are from the UCL Institute of Neurology, the University of Sheffield and the MRC Protein Phosphorylation Unit at the University of Dundee. RB received funding from MJFox foundation for this work and is also funded by the Reta Lila Weston Trust.

死後脳組織が神経疾患のためにクイーンスクエア脳バンクに寄贈された、ロンドン大学、倫理的に承認されたプロトコルを用いて神経学研究所ヒト組織機関によって発行されたライセンスの下で研究のために保存（HTA）、英国（NO。12198）。このプロトコル（ 表1）に使用するケースのリストを参照してください。 バッファーの調製<ol><li> 1×TBS（トリス緩衝食塩水）バッファーを準備します。 <ol><li> 500 mMトリス - 塩酸pHが7.4と1500 mMのNaClを含む原液として10倍のTBSを準備します。 <ol><li>うち60.5グラムのTris-ClでpHを7.6と高純度水の800ミリリットル中のNaClの87.6グラムを計量。 1MのHClを用いてpHを調整し、1 Lに、最終的な在庫量を作ります</li></ol></li><li>蒸留水に株式を10回希釈することにより1X TBSの最終濃度を準備します。 </li><li>プロテアーゼ阻害剤を加える（PI）、（50 mlの緩衝液当たり1錠）及びフォス停止ホスファターゼ阻害剤錠剤（緩衝液10ml当たり1錠）にプロテアーゼおよびホスファターゼの非特異的な酵素作用の影響を排除。 注：ここでは、ロシュからの酵素阻害剤錠剤を使用しているが、同じように他の市販の阻害剤は、製造業者の説明書に従って使用することができます。 </li></ol></li><li> 1X TBSへW / Vドデシル硫酸ナトリウム（SDS）（pH7.4）でバッファ5％添加し、TBS-SDS緩衝液を準備します。 SDSを可溶化するために、磁気スターラーを用いて一定に攪拌しながら60℃に溶液を加熱します。 </li><li> / 1×TBS-SDS緩衝液（pH 7.4）にV wを8 Mの最終濃度に尿素を加えることによって、TBS-SDS-尿素緩衝液を準備します。尿素を溶解し、マグネチックスターラーで絶えず撹拌しながら60℃に溶液を加熱します。 </li></ol> 2.サンプル均質化および差動超遠心注：以下の作業の一部は、HTA UKの規則に従って、ヒト脳組織の取り扱いを伴います。ローカル標準操作手順は、すべてのTIで追跡されていますMES。脳サンプルを負圧に維持microcabinetで均質化凍結脳ブロックおよび組織材料から切除されます。使い捨てガウン手袋、フェイスマスク、オーバーシューズプロテクターと安全ゴーグルは、プロシージャ全体で着用されています。ヒト組織廃棄物は安全に処分するため、20分間121℃でオートクレーブ処理後に廃棄されます。シャープ（メスの刃）を包含し、安全に処分するために適切なシャープコンテナに配置されています。 <ol><li>凍結ヒト組織（大脳基底核領域から重量で約0.5グラム）のチャンクを取り、迅速に小さなペトリ皿や滅菌手術用メスの刃を使用して氷の上に小さな断片（約1mm 2）にミンチ。各サンプルの別々のペトリ皿とメスの刃を使用してください。 15mlチューブにみじん切りの組織を収集し、チューブに氷冷1XTBSバッファの10のボリュームを追加します。 </li><li> 10秒間20,000rpmで機械的ホモジナイザーを用いてサンプルをホモジナイズします。 2分間氷上で冷却します。このステップ3回繰り返します秒。 注：均質化しながら、サンプルが加熱されないように行われます。 </li><li> 4℃で5分間、1000×gで遠心分離することによって明らかにします。非均質化された材料のペレットを捨てます。 </li><li> 、上清（粗ホモジネート）を取るポリカーボネート遠心管に加える（チューブのサイズはローターのサイズに依存）、慎重にバランスをとります。 4℃で1時間、100,000×gで遠心分離します。 </li><li>これは、TBS-可溶性画分であるとして、上清を保持します。 </li><li>洗浄は、4℃で15分間、100,000×gで1×TBS緩衝液および遠心分離の5つのボリュームに2回ずつ時間をペレット化。上清を捨てます。 <ol><li>室温で1×TBS-SDSの約5倍量の20 kHzで10秒間ペレットを超音波処理することによって、最終的なペレットを再懸濁。 注：SDS含有緩衝液サンプルの添加はSDS沈殿を避けるために、10℃でもたらされるべきである前に。 </li><li> 25℃で30分間100,000×gで超遠心機。 </li></ol></li><li>これは番目であるとして、上清を保持eは可溶性画分をSDS。 <ol><li>ウォッシュは、室温で1×TBS-SDS緩衝液の5倍量の二回ペレット。 25℃で15分間100,000×gで遠心分離するたびに。 </li><li>完全な可溶化を達成するために10秒間20 kHzで設定し、超音波処理器を使用して、1×TBS-SDS-尿素緩衝液50μlの最終ペレットを可溶化します。これは、尿素可溶性画分と呼ばれます。 </li></ol></li><li>製造業者のプロトコルに従って市販のタンパク質アッセイキットを用いて全タンパク質含量のために、各画分をアッセイ。タンパク質アッセイ試薬との互換性を可能にするために、1×TBSバッファーで1：TBS-SDS-尿素サンプル1を希釈します。 -80℃で少量のアリコート（20μL）中で凍結サンプルを、凍結融解サイクルを減少させます。 注：サンプルに10％グリセロールを追加すると、-80℃で長期保存することをお勧めします。 </li></ol>サンプルと分析結果の3イムノブロッティング<ol><li> 10ウェル、4〜12％ビス - トリスポリアクリルアミドゲル上で、TBS、TBS-SDSおよびTBS-SDS-尿素抽出物からの実行サンプル標準的な技術を使用してバッファを実行しているとしてMOPSを持ちます。詳細なウエスタンブロットプロトコルのギャラガーとチャクラバルティ（2008）29を参照してください 。 </li><li> TBSとSDSおよび尿素分画のための分子量マーカーと一緒に各レーンにロード各試料からの10μgのタンパク質を。 </li><li> 1時間またはローディングバッファーからの青色色素がゲルの底に到達するまで、200Vでゲルを実行します。 </li><li>電気泳動ナイロン膜28上にゲルからタンパク質を転送し、20％メタノールを含有する転写緩衝液中に最初に100％メタノールで、次いで、予め湿らせました。タンパク質側及び分子量サイズマーカーの向きを決定するために、ブロット上の識別マークを提供します。 <ol><li>湿った濾紙と一緒に膜を有するゲルを挟みます。膜の正しい配置は、ゲルとアノードとの間の膜とが重要です。 40 Vで2時間転送を行います</li><li> 1X PBS-トゥイーン（1X PBS-T）バッファを構成する：200ml中にPBSを1錠を溶かし水は、0.01 Mリン酸緩衝液、0.0027 M塩化カリウムおよび0.137 M塩化ナトリウム、pHが7.4を得ました。 </li><li> 70rpmで振盪しながら30分間、1X PBS-T中の5％BSA溶液中で膜をブロックします。これは、膜を一次抗体の非特異的結合を防止します。 </li></ol></li><li> （1×PBS-Tで一連の洗浄に続いて（4℃でO / N）750希釈：1で、α-SYN一次抗体SYN-1（マウスモノクローナル抗体BD Biosciences社）を6 mlのタンパク質ブロットをプローブ3×5分ごとに）28。 </li><li> 1で適切なHRP結合二次抗体でブロットをインキュベート：30分2,000希釈。 1×PBS-Tで一連の洗浄（3×5分ごとに）を実行します。 <ol><li>暗い部屋で15秒間増強化学発光溶液中でブロットを浸し。ラップフィルムでブロットをカバーし、適切な信号（適切なサイズのバンド）をキャプチャするために、光を通さないカセットにタンパク質側を上にしてブロットに対してオートラジオグラフィーフィルムを配置します。 </li><li>自動化された現像剤中のオートラジオグラフィーフィルムを開発。 注意：ブロットはまた、自動化された開発者のマシンが利用できない場合には商業的供給源からの現像液と定着液を使用して手動で開発することができます。 </li></ol></li><li>定数α-SYN抗体シグナルのブロットを取り除くために振盪しながら10分間ストリッピングバッファーウエスタンブロットの6ミリリットルでウエスタンブロットをインキュベートします。 8000希釈：1でベータアクチン一次抗体（マウスモノクローナル）を使用して3.6.2に至るまでのステップ3.43に従ってください。 </li><li>スキャンおよび定量のために、NIH ImageJの（無料ダウンロード可能なソフトウェア）を使用して、TIFF画像と測定濃度に最終画像を変換します。 注：ソフトウェアは、関心の相対面積（適切なサイズのバンド）の濃度の読み取りを可能にし、データがいずれかの上の任意の単位として、またはα-SYN密度/βアクチン（ハウスキーピング遺伝子）の比として表すことができます。独自のハウスキーピング遺伝子は、（尿素水溶性サンプルの場合のように）有効でない場合。 </li&gt; </ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+quantitative+immunoblotting+of+endogenous+&#945;-synuclein.">A new method for quantitative immunoblotting of endogenous &#945;-synuclein.</a> PLoS ONE. 8 (11), e81314 (2013).</li></ol>

著者は、開示することは何もありません。

この記事では、変性ゲル走行条件を使用して病気の脳から抽出し、モノマー、オリゴマーの溶解度差のプロパティの検査および集約α-SYNのための生化学的なプロトコルを記述します。これは、凝集したα-SYN 17,18を研究するために 、十分に確立された技術、20、21、その天然の形態で通常は可溶性であるが、疾患の進行を伴うまたは遺伝的変異を有するアミロイド生成または増加凝集特性を得るタンパク質です。それにもかかわらず、いくつかのグループは30、そのバッファに（8％または10％の代わりに5％）21,22を 、SDS濃度のわずかな変動を使用していた。SDSは、α-SYNの膜結合形態を含むことができオリゴマー陰イオン界面活性剤とsolubilisesですα-SYNは、尿素のに対し、カオトロピック試薬は、α-SYN 20の不溶性の凝集および原線維またはアミロイド生成性のフォームを変性させます。この点でPaleologouら31による系統的な研究は、安定性を調べました尿素の様々な濃度のα-SYNオリゴマーおよび原線維の（6.5から8 M）またはSDS（0.25から2パーセント）及び尿素濃度の高いオリゴマー、SDS濃度の安定ではないことを報告しました。 α-SYNオリゴマーおよび原線維のための具体的な彼らのFILA-1抗体は、非変性条件下での6.5 M尿素濃度で繊維の高い濃度が検出されました。このプロトコルで使用されるバッファーの濃度は厳密にCulvenor らに記載されているものを反映します。 （1999）32。 不溶性α-SYNの生化学的抽出のための解剖学的脳の領域は、慎重に選択されるべきであり、これは、疾患の進行33,34に応じて、α-SYN LBとLN負荷を反映する必要があります。ここで使用されるケースがMcKeith ctriteria 34に係るPDの進行の後期および中間段階を反映したPDの新皮質と辺縁系のサブタイプから基底核サンプルです。クイーンスクエア脳バンクでは、脳の半分です日常組織化学的分析のためにホルマリンで固定し、残りの半分は、慎重に、さらに生化学的およびDNA / RNA分析研究のために-80 O Cの冷凍庫で凍結して保存異なる解剖学的領域とフラッシュに解剖されています。神経病理学者によって脳や解剖のホルマリン固定後、免疫組織化学はアーカイブα-SYN抗体との結果を用いて行われます。また、日常的な手順として、脳組織のpHは、脳組織の死戦状態の尺度として到着時に測定されます。これは、生化学分析のための組織保存の品質のための強固な基礎を形成します。 ここで我々のデータは、より多くのSDSは、可溶性α-SYNモノマーは、対照と比較して、PDのケースであることを示しています。特に新皮質のPD症例は辺縁系PD品種に比べて高いα-SYNの負荷を持っています。新皮質の場合は、正面と頭頂CORとして新皮質の領域におけるPDα-SYN病理のより大きな進行を表しますtices 33,34。大脳辺縁系のPDの場合は、扁桃体、transentorhinalと帯状の領域のような前脳基底部/辺縁領域の分野で高いLBスコアを持っています。意味のあるデータと統計分析のために、一つは各コホートから少なくとも4例を実行する必要があります。同様に、我々はここに提示ブロットデータの統計的分析を試みていません。 それはまた、異なる抗体は、異なる形態/高次α-シンオリゴマーの組成を認識してもよいし、それぞれが独自の相対的な感度および好みを有してもよいことに注意しなければなりません。これはトンらの結果から明らかである。彼らは4つの異なるα-SYN抗体（SYN-1、SS、オンコ及びLB509）は、少なくともα-SYNオリゴマー/集合体のための変更の結果を与えることを示している29。これらは、α-SYN抗体エピトープは、N末端またはCのいずれかに配置されているかどうかに依存して変動を有することができるが、α-SYNモノマーはすべて4抗体によって同様の程度に認められました29末端。同様に、リン酸化アルファに特異的な抗体は、シヌクレインの異なる高分子量αシヌクレイン種20,21を決定します 。ここに記載されたプロトコルでは、非常に特徴の抗体のSyn-1 19-21使用されています。 しかし、抗体の前吸収実験によりウェスタンブロット上の任意の新しい抗体を検証し、また、細胞内のタンパク質の過剰発現とノックダウンを考慮することが重要です。 これは、α-SYNとまたは不安定な四量体、α-SYN形の小さな断片を決定するために研究者によって適用されている他のバリエーションを考慮することが重要です。これは、四量体36を安定化させるために架橋剤とα-SYN 35またはサンプルホモジネートの治療の短縮形態を保持するために、PBS中の0.4％のPFAを有する膜の軽度固定を含めることができます。 死後のTIを使用して、タンパク質の正確な生化学的評価ssueは、酵素タンパク質の分解や変更の最小化を必要とします。これは、最短死後遅延で組織を使用し、および/またはケースのコホート内で一致したサンプルを選択することをお勧めします。 α-SYNの免疫組織化学のために、標準的な抗体を用いた免疫組織化学は、分離プロトコルを開始する前に実行する必要があります。 α-SYN病理の程度は非常に可変であり、選択された領域に応じて変化することができます。これは、すべての実行で最適な歩留まりの陽性対照として、豊富な病理との領域を選択することをお勧めします。必要なホスファターゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤の場合と使用は、細胞溶解中に発生し、4°Cでサンプルを維持する細胞内プロテアーゼまたはホスファターゼの放出後に非常に重要である望ましくない酵素分解を防止することができます。 これは、実験のバッチ内のサンプルのすべてがイントラユーザの変動を回避するために、均一にかつ一貫して処理されることが重要です。複数のFREこれは潜在的に、このようなリン酸化などの翻訳後修飾を撤回することとしてエズ - 融解サイクルを避けるべきです。多数のサンプルを検査する際に念頭に置いて負担する重要な点は、イムノブロットのデータは、ゲル上の他のすべてのサンプル、そのサンプルに参照されるすべてのデータと並列に実行する必要があります一つのサンプルに正規化しなければならないということです。これは、いくつかの間でイムノブロットデータの正規化を確保するために行われます。これは、我々の最近の研究22で採用されている方法です。 これは、低いバックグラウンドECLを維持するために、ブロットをウェスタンブロットプロトコルの中の任意の時点で乾燥させてはならないことに留意すべきです。これはECL信号の飽和につながると不正確な定量につながるとして加えて、オートラジオグラフィーフィルムに非常に長時間露光（&gt; 10分）は避けるべきです。 プロトコル上のこれは一般的な実験用試薬を用いて、比較的簡単な技術であり、中楽器とPD研究におけるα-SYNタンパク質の病態生理学を研究するための貴重なツールになります。この方法は、α-SYNトランスジェニック動物におけるα-SYNの生物学の研究にだけでなく、AD、MSA、DLB、HDとfrontotemporaldementiasとして凝集したタンパク質の異常沈着を特徴と他の神経変性疾患に適切な修正を加えて拡張することはできません。しかし、ここで説明したウエスタンブロットデータは、α-SYN 31の特定の形態のための抗体を用いた酵素結合免疫吸着アッセイを使用して検証することができます。

いくつかの神経変性疾患の間で共通鍵の病理学的特徴の一つは、タンパク質/疾患特異的1で発生した異常なタンパク質凝集体の形成です。このように、アルツハイマー病（AD）における神経細胞内の特徴的な神経外アミロイドβプラーク凝集過リン酸化タウの沈着があります。レビー小体（DLBs）2-4とPD、PDの認知症や認知症におけるレビー神経突起（LNS）と呼ばれるニューロン内封入体あるレビー小体（ポンド）であり、また、ジストロフィー神経突起内で凝集し、α-SYN預金。異常なα-SYN預金もMSA 5におけるグリア細胞質封入体の特徴病変で見られます。ハンチントン病では、そこに特徴的ポリQ堆積物であり、異常タールDNAは、タンパク質43と結合し、蛋白質肉腫（FUS）に融合した前頭側頭型認知症を堆積します。重要なことには、PDのための、α-SYN遺伝子変異はCAUに見出されていますSE常染色体優性PD 6-11。さらに、α-SYN遺伝子三重12と重複13はまた、このように、PDの発症機序に増加し、α-SYN式をリンクする家族性PDの原因となります。注目すべきは、散発的と家族の両方のPDの場合は、α-SYN病理14の異常沈着を抱きます。 PDのための現在利用​​可能な処置は対症的に過ぎず、容赦のない疾患の進行を停止または遅延させることには影響しません。 α-SYNが豊富ヒト脳で発現し、全脳タンパク質の約1％を占めています。これは、神経細胞内で、より具体的に存在するが、グリア細胞内のより少ない量ではあるが存在することができます。論争点がランダムモノマー15として、または折り畳ま四量体16として存在することができるα-SYNの天然の構造です。疾患中に、α-SYNは、ミスフォールドを取得することができ、その立体配座を変化させ、このプロセスは、疾患pathogeの原因であると考えられていますネシス。 α-SYNと疾患の病態生理学的側面 ​​の調査の数年にもかかわらず、病気のメカニズムの正確な原因は14とらえどころのない残っていました。 パーキンソン脳の事後分析を用いた研究はこれまでに、LRRK2遺伝子17-22における突然変異に関連するPD散発PDにし、また、両方のα-SYNの正常および異常な生物学に関する重要な手がかりを提供しています。ここでは、程度の差は、α-SYN凝集体を抱く人間の死後のPD脳組織からますます不溶性α-SYN預金の生化学的な抽出プロトコルは、（参照方式は、図1に示す ）に記載されています。この技術はまた、他の神経変性疾患23,24から集合タンパク質を研究するためのバッファ組成物に変更して、また、トランスジェニック動物の脳組織25-27から適応させることができます。適応のための主な考慮事項はsolubiの違いですリティ、主に核であり、FUS 28について示されるように、最適な抽出のために、高塩緩衝液を必要とするかもしれないそのうちのいくつかは、それぞれのタンパク質の総量。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="800">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tris-HCL</td>
			<td style="width:216px;">Sigma</td>
			<td style="width:145px;">T5912</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27800.291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>71727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease inhibitor tablets&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04 693 116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase inhibitor tablets&#160;</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>04 906 837001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline tablets&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE MOPS SDS running buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE transfer buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0006-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hybond-P membrane&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN303F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Whatman 3MM filter paper</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA30306185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bis-tris gels 4-12%&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Supersignal West Pico Chemiluminescent substrate</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>34080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bio-RAD DC protein assay kit&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thickwall Beckman Polycarbonate tubes</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Western blot stripping buffer</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>46430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syn-1 primary antibody (mouse monoclonal)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">beta-actin primary antibody (mouse monoclonal&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HRP cojugated goat anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-2031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Instrument</td>
			<td>Company</td>
			<td>Rotor/ model no&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benchtop Ultracentrifuge Optima Max</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>MLA-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sonicator</td>
			<td>Heat Systems</td>
			<td>XL20-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Homogeniser</td>
			<td>Jenke and Kunkel</td>
			<td>TP18/10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequential extraction of soluble and insoluble alpha-synuclein from parkinsonian brains

α-シヌクレイン（α-SYN）、タンパク質が豊富に主に神経細胞内で発現し、多くの異なる形態で存在します - モノマー、四量体、オリゴマーおよび原線維。疾患中に、α-SYNは、タンパク質をより不溶性にする傾向があるオリゴマー及び高分子量の凝集体を形成するためにコンフォメーション変化を受けます。異常に凝集したα-SYNは、パーキンソン病（PD）、レビー小体（DLB）および多系統萎縮症（MSA）と認知症の神経病理学的特徴です。増加洗剤強度と高速超遠心分離を用いて緩衝液を使用して不溶性のα-SYNの生化学的特徴付けおよび分析は、疾患の進行に関連付けられているα-SYN病理の発達を決定するための強力なツールを提供します。このプロトコルは、死後のヒト脳組織からますます不溶性/凝集したα-SYNの単離を記載しています。この方法は、正常と異常αの研究への変更を適応させることができます異なるα-シン変異を有するトランスジェニック動物モデルにおける、ならびにそれらのそれぞれの病態に関与するタンパク質の異常な線維状沈着を特徴と他の神経変性疾患で-syn生物学。

TBS、SDSおよび図1に示したプロトコルに従って基底核から抽出された尿素可溶性タンパク質は、ゲル上で実行され、α-SYN SYN-1マウスモノクローナル一次抗体を用いてイムノブロットしました。 TBS可溶性画分は、PDと制御の場合には、単量体、α-SYN（〜14 kDaの種）の存在を示した（ 図2A）を調べました。 SDS可溶性画分は、低露光ブロット（ 図2C）に表示される研究例すべての3つのサブタイプで豊富な単量体のα-SYNを示しました。 PDの例はまた、オリゴマー（ 図2C）である可能性が高い、高露光ブロットで見られるように、より高い分子量（MW）α-SYN種を示しました。 PD症例からの尿素可溶性画分は、対照例と比較して、α-SYNモノマー、オリゴマーおよび凝集した種の高められた量を示しました。新皮質特発性PDの例はaggregの高い量を実証<html>大脳辺縁系の場合は、不溶性α-SYNの中間レベルを示す一方で、α-SYN種をated。 20は説明したように、SDSおよび特発性PDの例からの尿素分画の両方が、12 kDaのと6キロダルトンで短縮型α-SYNの製品の様々なレベルを示しています。対照的に、対照例は、任意の不溶性または凝集したα-SYN（ 図2E）を示さありませんでした。半定量的密度の措置は新皮質と辺縁系のPDの場合に集約されたα-SYN（ 図2B、2D、2F）の不溶性の性質を実証するα-SYNの免疫組織化学を使用してcategoriesdとしてLB負荷の量を反映しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53415/53415fig1.jpg" /> 図1.不溶性 α-syn抽出手順 の概略図 。目標確認= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53415/53415fig2.jpg" /> 図2. PDからのα-synレベル の代表的なイムノブロット およびヒト組織を制御する。TBS、SDSおよび尿素可溶性画分大脳基底核（対照）特発性PD症例のと神経学的に正常な（PD症例でα-SYN病理を保有領域）から脳をウェスタンイムノブロットを用いてα-SYNの存在に​​ついて分析しました。 10μgのタンパク質を各レーンにロードしました。 TBS画分（A）においては、主にα-SYNモノマーは、すべての場合に存在します。 SDS画分（C）は、α-SYNのいくつかのオリゴマーは、主に、PD組織中のモノマーと一緒に見られます。尿素画分（C）において、モノマー、オリゴマーおよび凝集したα-SYNを可変PDケースreflectinで発現されますグラム、それぞれのLB負荷。神経学的に正常な対照サンプルは、単量体のα-SYNのごく少量の存在を示します。 α-SYNの分解生成物は、高LB負荷の例いくつかに見られる可能性に注意してください。実線の矢印ヘッドは、α-SYNの単量体の形を表しています。 *おそらく以前に20,26に記載されているように α-SYNのC末端切断形態を表す。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53415/53415fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 場合 </td><td> セックス </td><td> 死亡歳時の年齢 </td><td> 死後遅延（時間） </td><td> 組織のpH </td></tr><tr><td>新皮質1 </td><td> M </td><td> 82 </td><td> 40 </td><td> 6.3 </td></tr><tr><td>新皮質2 </td><td> F</td><td> 75 </td><td> 35.3 </td><td> 6.4 </td></tr><tr><td>大脳辺縁1 </td><td> M </td><td> 81 </td><td> 28.5 </td><td> 6.2 </td></tr><tr><td>大脳辺縁2 </td><td> F </td><td> 79 </td><td> 36.5 </td><td> 6.2 </td></tr><tr><td>コントロール1 </td><td> M </td><td> 80 </td><td> 38 </td><td> 6.1 </td></tr><tr><td>コントロール2 </td><td> F </td><td> 83 </td><td> 32.5 </td><td> 6.3 </td></tr></tbody></table> 使用例表1限定人口統計

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Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (&#945;-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of &#945;-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.

パーキンソン脳からの可溶性および不溶性のα-シヌクレインの逐次抽出

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

sequential-extraction-soluble-insoluble-alpha-synuclein-from

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.1K ビュー.  UCL Institute of Neurology. Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (α-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of α-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.

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Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, the olfactory bulb (OB), the dorsal motor nucleus of the vagus (DMV)3, the intermediolateral nucleus of the spinal cord 4 and the substantia nigra, providing the basis for the neuropathological staging of the disease4,5. The ENS and the OB are the most exposed nervous structures and the first ones to be affected. Interestingly, PD has been related to pesticide exposure6-8. Here we show in detail two methods used in our previous study 9. In order to analyze the effects of rotenone acting locally on the ENS, we administered rotenone using a gavage to one-year old C57/BL6 mice. Rotenone is a widely used pesticide that strongly inhibits mitochondrial Complex I 10. It is highly lipophylic and poorly absorbed in the gastrointestinal tract 11. Our results showed that the administration of 5 mg/kg of rotenone did not inhibit mitochondrial Complex I activity in the muscle or the brain. Thus, suggesting that using our administration method rotenone did not cross the hepatoportal system and was acting solely on the ENS. Here we show a method to administer pesticides using a gavage and the image analysis protocol used to analyze the effects of the pesticide in alpha-synuclein accumulation in the ENS. The first part shows a method that allows intragastric administration of pesticides (rotenone) at a desired precise concentration. The second method shows a semi-automatic image analysis protocol to analyze alpha-synuclein accumulation in the ENS using an image analysis software.

Parkinson's disease has been related to the exposure to pesticides. Here we show a method to deliver pesticides using a gastric tube at the desired concentration and a method to analyze their effect in alpha-synuclein accumulation in the enteric nervous system.

腸神経系ではα-シヌクレインの介在物の強制経口および画像解析を用いたロテノンの経口投与

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

神経科学

Targeted Training of Ultrasonic Vocalizations in Aged and Parkinsonian Rats

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting communication abilities. 1, 2 Targeted training (speech/voice therapy) can improve specific voice deficits,3, 4 although the underlying mechanisms of behavioral interventions are not well understood. Systematic investigation of voice deficits and therapy should consider many factors that are difficult to control in humans, such as age, home environment, age post-onset of disease, severity of disease, and medications. The method presented here uses an animal model of vocalization that allows for systematic study of how underlying sensorimotor mechanisms change with targeted voice training. The ultrasonic recording and analysis procedures outlined in this protocol are applicable to any investigation of rodent ultrasonic vocalizations.
The ultrasonic vocalizations of rodents are emerging as a valuable model to investigate the neural substrates of behavior.5-8 Both rodent and human vocalizations carry semiotic value and are produced by modifying an egressive airflow with a laryngeal constriction.9, 10 Thus, rodent vocalizations may be a useful model to study voice deficits in a sensorimotor context. Further, rat models allow us to study the neurobiological underpinnings of recovery from deficits with targeted training.
To model PD we use Long-Evans rats (Charles River Laboratories International, Inc.) and induce parkinsonism by a unilateral infusion of 7 &mu;g of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the medial forebrain bundle which causes moderate to severe degeneration of presynaptic striatal neurons (for details see Ciucci, 2010).11, 12 For our aging model we use the Fischer 344/Brown Norway F1 (National Institute on Aging).
Our primary method for eliciting vocalizations is to expose sexually-experienced male rats to sexually receptive female rats. When the male becomes interested in the female, the female is removed and the male continues to vocalize. By rewarding complex vocalizations with food or water, both the number of complex vocalizations and the rate of vocalizations can be increased (Figure 1).
An ultrasonic microphone mounted above the male's home cage records the vocalizations. Recording begins after the female rat is removed to isolate the male calls. Vocalizations can be viewed in real time for training or recorded and analyzed offline. By recording and acoustically analyzing vocalizations before and after vocal training, the effects of disease and restoration of normal function with training can be assessed. This model also allows us to relate the observed behavioral (vocal) improvements to changes in the brain and neuromuscular system.

Voice disorders are debilitating in aging and Parkinson disease. The ultrasonic vocalizations of rats, also affected by these conditions, can be used to study these voice disorders, their neural substrates, and the nature of functional recovery with behavioral intervention.

高齢者とパーキンソンラットにおける超音波発声の対象とトレーニング

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting ...

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for investigating the cell biology and development of central brain structures by allowing acute pharmacological interventions and live imaging of cellular processes. As an example of the technique, prior work from our lab1 has shown that a previously unrecognized subcellular compartment lies between the axonal and somatodendritic compartments of axons of the Drosophila central brain. The development of this compartment, referred to as the axon initial segment (AIS)2, was shown genetically to depend on the neuron-specific cyclin-dependent kinase, Cdk5. We show here that ex vivo treatment of wild-type Drosophila larval brains with the Cdk5-specific pharmacological inhibitors roscovitine and olomoucine3 causes acute changes in actin organization, and in localization of the cell-surface protein Fasciclin 2, that mimic the changes seen in mutants that lack Cdk5 activity genetically.
A second example of the ex vivo culture technique is provided for remodeling of the connections of embryonic mushroom body (MB) gamma neurons during metamorphosis from larva to adult. The mushroom body is the center of olfactory learning and memory in the fly4, and these gamma neurons prune their axonal and dendritic branches during pupal development and then re-extend branches at a later timepoint to establish the adult innervation pattern5. Pruning of these neurons of the MB has been shown to occur via local degeneration of neurite branches6, by a mechanism that is triggered by ecdysone, a steroid hormone, acting at the ecdysone receptor B17, and that is dependent on the activity of the ubiquitin-proteasome system6. Our method of ex vivo culturing can be used to interrogate further the mechanism of developmental remodeling. We found that in the ex vivo culture setting, gamma neurons of the MB recapitulated the process of developmental pruning with a time course similar to that in vivo. It was essential, however, to wait until 1.5 hours after puparium formation before explanting the tissue in order for the cells to commit irreversibly to metamorphosis; dissection of animals at the onset of pupariation led to little or no metamorphosis in culture. Thus, with appropriate modification, the ex vivo culture approach can be applied to study dynamic as well as steady state aspects of central brain biology.

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

This article describes a method by which one can mimic in vivo development of the Drosophila mushroom body in an ex vivo culture system.

全体の開発、 ショウジョウバエの脳のex vivoで培養

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

胚性齧歯類の脳から単離、プライマリ脳ドーパミンニューロンの文化と長期メンテナンス

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein prionoids, which cause neuropathology within the central nervous system (CNS). Here we describe that intraglossal or intraperitoneal injection of alpha-synuclein fibrils into bigenic Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which overexpress human alpha-synuclein with the A53T mutation from the prion protein promoter and firefly luciferase from the promoter for glial fibrillary acidic protein (Gfap), is sufficient to induce neuropathologic disease. In comparison to homozygous Tg(M83+/+) mice that develop severe neurologic symptoms beginning at an age of 8 months, heterozygous Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) animals remain free of spontaneous disease until they reach an age of 22 months. Interestingly, injection of alpha-synuclein fibrils via the intraperitoneal route induced neurologic disease with paralysis in four of five Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice with a median incubation time of 229 &#177;17 days. Diseased animals showed severe deposits of phosphorylated alpha-synuclein in their brains and spinal cords. Accumulations of alpha-synuclein were sarkosyl-insoluble and colocalized with ubiquitin and p62, and were accompanied by an inflammatory response resulting in astrocytic gliosis and microgliosis. Surprisingly, inoculation of alpha-synuclein fibrils into the tongue was less effective in causing disease with only one of five injected animals showing alpha-synuclein pathology after 285 days. Our findings show that inoculation via the intraglossal route and more so via the intraperitoneal route is suitable to induce neurologic illness with relevant hallmarks of synucleinopathies in Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice. This provides a new model for studying prion-like pathogenesis induced by alpha-synuclein prionoids in greater detail.

Peripheral injection of alpha-synuclein fibrils into the peritoneum or tongue of Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which express human alpha-synuclein with the familial A53T mutation and firefly luciferase, can induce neuropathology, including neuroinflammation, in their central nervous system.

α-シヌクレイン線維の末梢接種後のトランスジェニックマウスにおける神経炎症の生物発光イメージング

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

分離およびゼブラフィッシュ稚魚の脳から神経細胞、大食細胞、ミクログリアの RNA の抽出

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the study of &#945;S aggregation in Parkinson&#39;s Disease (PD). Recently, the development of new animal models through the exogenous inoculation of brain extracts from diseased &#945;S transgenic mice or PD patients has given new hopes to the possibility of creating more adequate cell models of &#945;S aggregation. Unfortunately, when it comes to cells in cultures, administration of raw brain extracts has not proven as successful as in mice and the source of choice of exogenous aggregates is still in vitro preformed &#945;S fibrils.
We have developed a method to induce the formation of intracellular &#945;S inclusions in primary neurons through the exogenous administration of native microsomes-associated &#945;S aggregates, a highly toxic &#945;S species isolated from diseased areas of transgenic mice. This fraction of &#945;S aggregates that is associated with the microsomes vesicles, is efficiently internalized and induces the formation of intracellular inclusions positive for aggregated and phosphorylated &#945;S. Compared to in vitro-preformed fibrils which are made from recombinant &#945;S, our method is faster and guarantees that the pathogenic seeding is made with authentic &#945;S aggregates extracted from diseased animal models of PD, mimicking more closely the type of inclusions obtained in vivo. As a result, availability of tissues rich in &#945;S inclusions is mandatory.
We believe that this method will provide a versatile cell-based model to study the microscopic aspects of &#945;S aggregation and the related cellular pathophysiology in vivo and will be a starting point for the creation of more accurate and sophisticated cell paradigm of PD.

The goal of this protocol is to provide a cell-based system that replicates the formation of alpha-synuclein aggregates in vivo. Intracellular alpha-synuclein inclusions are seeded in primary neurons by the internalization and propagation of exogenous administered native microsomes-associated alpha-synuclein aggregates isolated from diseased alpha-synuclein transgenic mice.

線維形成の強力な細胞モデルとして α-シヌクレインのミクロソーム関連付けられた集計一次ニューロンの外因性投与

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

キイロショウジョウバエ幼虫と大人の脳の代謝解析

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In neuroscience, as well as a plethora of other scientific fields, these techniques are used. Immunohistochemistry can be done on slide mounted tissue or free-floating sections. Preparing slide-mounted samples is a time intensive process. The following protocol for a technique, called the Megabrain, reduced the time taken to cryosection and mount brain tissue by up to 90% by combining multiple brains into a single frozen block. Furthermore, this technique reduced variability seen between staining rounds, in a large histochemical study. The current technique has been optimized for using rodent brain tissue in downstream immunohistochemical analyses; however, it can be applied to different scientific fields that use cryosectioning.

Here, we present a protocol to freeze and section brain tissue from multiple animals as a timesaving alternative to processing single brains. This reduces staining variability during immunohistochemistry and reduces time cryosectioning and imaging.

複数の齧歯動物の頭脳の同時セクショニング

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the diagnosis still relies only on clinical signs of motor involvement that appear later on in the disease course, when most of the dopaminergic neurons are already lost. Hence, there is a strong need for a biomarker that can identify patients at the beginning of disease or at the risk of developing it. Over the last few years, skin biopsy has proved to be an excellent research and diagnostic tool for peripheral nerve diseases such as small fiber neuropathy. Interestingly, a small fiber neuropathy and alpha synuclein (&#945;Syn) neural deposits have been shown by skin biopsy in PD patients. Indeed, skin biopsy has the great advantage of being an easily accessible, minimally invasive and painless procedure that allows the analysis of peripheral nervous tissue prone to the pathology. Moreover, the possibility of repeating the skin biopsy in the course of the follow-up of the same patient allows studying the longitudinal correlation with the disease progression. We set up a standardized reliable protocol to investigate the presence of &#945;Syn aggregates in skin nerve fibers of the PD patient. This protocol involves few short fixation steps, a cryotome sectioning and then a free-floating immunofluorescence double-staining with two specific antibodies: anti Protein Gene Product 9.5 (PGP9.5) to mark the cutaneous nerve fibers and anti 5G4 for detecting &#945;Syn aggregates. It is a versatile, sensitive and easy to perform protocol that can also be applied for targeting other proteins of interest in skin nerves. The ability to mark &#945;Syn aggregates is another step forward to the use of skin biopsy as a tool for establishing a pre-mortem histopathological diagnosis of PD.

Here, we present a protocol for a free-floating indirect immunofluorescence assay on skin biopsy sections that allows for the identification of disease specific conformation variants of alpha synuclein involved in Parkinson disease and multiple proteins of the peripheral nervous system.

自由浮遊免疫蛍光アッセイによる皮下末梢神経線維におけるアルファシヌクレイン凝集体の標的化

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

パーキンソン脳からの可溶性および不溶性のα-シヌクレインの逐次抽出

要約

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この動画の章

腸神経系ではα-シヌクレインの介在物の強制経口および画像解析を用いたロテノンの経口投与

高齢者とパーキンソンラットにおける超音波発声の対象とトレーニング

全体の開発、ショウジョウバエの脳のex vivoで培養

胚性齧歯類の脳から単離、プライマリ脳ドーパミンニューロンの文化と長期メンテナンス

α-シヌクレイン線維の末梢接種後のトランスジェニックマウスにおける神経炎症の生物発光イメージング

分離およびゼブラフィッシュ稚魚の脳から神経細胞、大食細胞、ミクログリアの RNA の抽出

線維形成の強力な細胞モデルとして α-シヌクレインのミクロソーム関連付けられた集計一次ニューロンの外因性投与

キイロショウジョウバエ幼虫と大人の脳の代謝解析

複数の齧歯動物の頭脳の同時セクショニング

自由浮遊免疫蛍光アッセイによる皮下末梢神経線維におけるアルファシヌクレイン凝集体の標的化

パーキンソン脳からの可溶性および不溶性のα-シヌクレインの逐次抽出

要約

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腸神経系ではα-シヌクレインの介在物の強制経口および画像解析を用いたロテノンの経口投与

高齢者とパーキンソンラットにおける超音波発声の対象とトレーニング

全体の開発、 ショウジョウバエの脳のex vivoで培養

胚性齧歯類の脳から単離、プライマリ脳ドーパミンニューロンの文化と長期メンテナンス

α-シヌクレイン線維の末梢接種後のトランスジェニックマウスにおける神経炎症の生物発光イメージング

分離およびゼブラフィッシュ稚魚の脳から神経細胞、大食細胞、ミクログリアの RNA の抽出

線維形成の強力な細胞モデルとして α-シヌクレインのミクロソーム関連付けられた集計一次ニューロンの外因性投与

キイロショウジョウバエ幼虫と大人の脳の代謝解析

複数の齧歯動物の頭脳の同時セクショニング

自由浮遊免疫蛍光アッセイによる皮下末梢神経線維におけるアルファシヌクレイン凝集体の標的化

全体の開発、ショウジョウバエの脳のex vivoで培養