Name: geomagnetic field (gmf) and plant evolution: investigating the effects of gmf reversal on arabidopsis thaliana development and gene expression
Uploaded: 2015-11-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
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This work was supported by a grant to MEM from the Dept. of Life Sciences and Systems Biology of the University of Turin, Italy. The authors thank G. Gnavi for technical assistance during some experiments. CTR is funded by the Wellcome Trust and the Royal Society (Grant Number 098436/Z/12/Z).

三軸コイルの1設定 メモ ：図1は、GMFを逆転するために使用される三軸コイルを示しています。 <ol><li>そのプローブ三軸コイルに挿入された3軸磁力計、オンにします。 </li><li>コンピュータの電源をオンにし、データが3軸磁気センサから収集することを可能にする磁力計のソフトウェアを起動します。 </li><li> GMFの大きさを計算するために、磁力によって報告された部品の値を使用してください。例えば、磁力計値で：BXは6.39μTを=で= 36.08μT、Bzが= 20.40は、以下の式を使用して、μT41.94の電界強度を計算するμT：B = B GMF + B の追加 、ここでB の追加 =（Bxを2 + 2 +のBz 2）1/2（ すなわち、この例では 41.9μT。） </li><li> 3 couplに接続された各1：（0-8V / 5Aおよび0-20V / 2.5A、50Wのデュアルレンジ）3つのDC電源をオンにしますヘルムホルツコイルのESとGPIB接続（ 図1B）を介してコンピュータに接続されています。 </li><li>電源のセ​​ット電圧が反転磁界ベクトルと所望の磁場を発生させます。例えば、ステップ1.3で、ここでは説明計装のコイルサイズであるB GMFと、V新しい結果Bを生成するために、X = 0.00 V、V yを= 30.52 V、VのZ = 0.00 Vに電圧を設定します= B GMF + B 三軸コイル =（6.38、-36.08、20.39）μTは。 すなわち、BのGMFと同じ大きさで新しいフィールドが、異なる方向を指しています。 </li><li> 1.3で説明した手順を使用して、磁力計ソフトウェアで新しいフィールドを確認してください。 </li><li>通常の両方に植物をさらすと、セクション2で説明したようにペトリ皿を使用して、GMF条件を逆転させました。 </li><li>等しいフィールドの大きさを維持することによって、偽曝露実験を行います| B GMF |そして、維持垂直GMFと同等のフィールドの構成要素が、フィールド反転状態に比べて三軸コイル内の等しい電流と磁場の水平成分の方向（ すなわち、「北、東または西」）を変更します。 1.5で説明したように、コイルの電圧を変更することによってこれを行います。 注：この偽の露出は、潜在的な微妙な加熱またはいずれかのコイル自体またはコイルを制御するために使用される電子機器からの振動の影響を除外。 </li><li>人員実験の残りの部分を実行し、および/またはデータを解釈するから盲目にフィールド条件を適用することにより、二重盲検試験を実行します。 </li></ol>植物材料と植物生育の条件の作製<ol><li> 5％（w / v）の次亜塩素酸カルシウム溶液および0.02％（v / v）のトリトンX-で処理することによって滅菌1.5 mlのチューブ表面にその後シロイヌナズナ 、コロンビア生態型0（COL 0）の種、場所を使用連続振とうしながら25〜28℃で10〜12分間、80％エタノール（エタノール）、100。その後、100％エタノールで洗浄し、80％EtOHで二回洗浄し、最終的に滅菌蒸留水で洗い流してください。 </li><li>追加することで、メディアを変更しムラシゲ・スクーグ22（MS）の1リットルを準備し、MSの2.297グラム（0.5×MS基礎塩混合物）、10gのスクロース、1 L、KOHでpH調整5.8から6.0への脱イオン水を上に。 20分、120℃のために寒天、オートクレーブの16グラムを追加します。 </li><li>固化する前に、各（120×120ミリメートル2）正方形のペトリ皿に培地80ミリリットルを注ぎます。プレートに30無菌種をまく、その後、ワックス状フィルムでプレートを密封します。 </li><li>発芽を増強し、同期させるために4℃で2日間暗闇に水平プレートを開花結実を促進する、その後、正常またはGMFを逆のいずれかにペトリ皿を公開します。 </li><li>三軸コイル内部の3軸コイルの外側の両方の並行実験で垂直位置で22℃の気候制御された環境で種子を公開ナトリウム蒸気ランプを使用して、8時間の闇と16時間の光の光周期スケジュール、下の（220×10 -6のEメートル-2秒-1）。ランプの赤色成分を低減するためにスポットライトの青のゼラチンフィルムを使用してください。 </li><li>通常の（コントロール）と逆転（治療）の両方GMF条件にRNA抽出前に10日間の植物を公開します。 </li><li>露光後、ペトリ皿の写真を撮ります。 </li><li>根長と葉面積を計算するためにImageJソフトウェアを使用してください。 <ol><li>簡単に言うと、その後、ペトリプレートの画像を開いて、正確にプレート側を横切る線を引くための「ストレート」ラインオプションを使用して、ペトリプレートの側面を測定します。 </li><li> 「分析」メニューの「設定スケール」を選択し、「既知の距離」ボックス（例えば、120ミリメートル）は、長さ（mm）の単位を挿入実際の距離を挿入します。最終的にはすべての測定の設定が利用できるようにする「グローバル」オプションをクリックします。 </li><li>カンガルーのためにトン長、フリーハンドツールを使用して慎重にルートの形状に従ってください。 「分析」メニューの「測定」オプションを使用して長さを測定します。画像内のすべての根を測定し、さらに統計分析のために、ファイルを保存し続けます。 </li><li>葉面積については、「イメージ」メニューから調整オプションし、「カラーしきい値」を使用します。個々の葉を選択し、「分析」メニューの「粒子を分析する」を選択します。統計分析のための個々の測定値を保存します。 </li></ol></li></ol> 3. シロイヌナズナ全RNA抽出、定量的リアルタイムPCR（定量PCR）反応条件とシロイヌナズナのためのプライマー<ol><li>別途30芽や根30を収集し、直ちに液体窒素中で凍結します。その後、乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で粉砕します。 </li><li>機械製造を使用して精製キットおよびRNaseフリーDNase処理キットを用いて全RNAを単離しますERの指示。 </li><li>製造業者の指示に従ってRNAナノキットおよびキャピラリーゲル電気泳動を使用して、サンプルの質と量を確認してください。分光光度法でRNAの定量を確認してください。 </li><li>製造業者の推奨に従って、第一鎖cDNAを得るために、cDNAを逆転写キットを用いて全RNAおよびランダムプライマーを2μgを使用してください。 </li><li>内部の負荷標準としてROXとサイバーグリーンを用いたリアルタイムシステム上のすべての実験を行います。 </li><li> 2X SYBRグリーン定量PCRマスターミックス12.5μlの、cDNAの0.5μlの100 nMのプライマーからなる混合物を25μlで反応を実行します。 表1に列挙されたプライマーを使用してください。（ゲノムDNA汚染を監視するために逆転写することなく、全RNAを使用して）コントロール非RTコントロールと非テンプレートコントロール（水の代わりに、テンプレート）に含めます。 </li><li>標準を使用して全てのプライマー対のためのプライマーの効率を計算します曲線法23。 </li><li> CRU3、COTP1、RRTF1：以下のPCR条件を使用してください。 95℃で10分間、95℃、58℃で30秒間、および72℃で30秒で15秒を40サイクル; UBP6、eEF1Balpha2、ACT1、GAPC2、CAT3、TAPX、APX1、RbohD、FeSOD1 10分95℃で、95°C、57°Cで20秒間、および72℃で30秒で15秒の40サイクル。 </li><li>各アニーリングおよび伸長段階の後、蛍光をお読みください。すべての実行のために、熱プロファイルで解離セグメントを含むことにより、55〜95℃の融解曲線分析を行います。解離プロファイル（温度の関数としての蛍光のプロット）を表示するには、[結果]タブを介してアクセス解離曲線画面を使用します。実験の解離セグメント間に収集されたデータセットが分析/セットアップ画面を使用して、分析のために選択されていることを確認します。 </li><li> Lを決定します3つの技術反復24,25で分析三つの独立したRNA抽出物からのcDNAを用いて10倍希釈系列（1〜3〜10倍）を行うことにより、閾値サイクル値（Ct値）に鋳型濃度の範囲inear。 </li><li> Ct値を得るために、リアルタイムPCR機器ソフトウェアですべての増幅プロットを分析します。キャリブレーションとしては、次の最高のハウスキーピング遺伝子のレベルと相対的RNAレベルを正常化：3.11.1）[結果]タブを介してプロット画面で増幅にアクセスし、データを分析選択/設定画面を使用して分析する必要のあるランプや高原を選択し、してから、コマンドパネルの蛍光メニューからDRN（ベースライン補正された正規化された蛍光）を選択します。サンプル値は、サンプリングされたウェルについてのCt値を表示するには、[結果]タブを介してスクリーンプレートにアクセスします。 </li><li>四つの異なる参照遺伝子を使用して[例えば、 細胞質のグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、（GAPC2）、ユビキチンspecifICプロテアーゼ6（UBP6）、Actin1（ACT1）と伸長因子1（b）のαサブユニット2（eEF1Balpha2）]は、リアルタイムPCRの結果を正規化します。解析ソフトウェア26を用いたトップランクの遺伝子を選択します。そして、標準化のために最も安定した遺伝子を使用しています。 <ol><li>簡単に言えば、遺伝子名およびサンプル名を含む最初の行を含む最初の列でExcelシート上の入力データを整理します。次に、メニューバーから解析ソフトウェアを選択します。入力データを選択するためのダイアログボックスを使用します。 </li><li>次に、フィールドにサンプル名、遺伝子名と簡単な出力だけをチェックします。解析を実行するGoボタンをクリックします。最も安定に発現候補遺伝子として（最小安定性値を有する）トップランクの遺伝子を選択します。 </li></ol></li><li>芽と根の両方の差動倍数変化の発現を示すことにより、プロットデータ。 </li></ol> 4.統計分析<ol><li> ±標準誤差平均値などのデータを表現。共同の比較ntrolと分散分析（ANOVA）およびボンフェローニとダン・シダック調整確率検定（0.95パーセントの信頼）とTukeyのテストの分析を行うことで、治療群。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

我々は最近、驚くべき相関がGMFの反転および家族被子植物の系統のほとんどの転換が2に発生した時間の間に存在することを示しました。しかし、刺激仮説多様GMF強度の効果に関する研究の過多にもかかわらず、GMF反転自体が植物遺伝子発現および形態に有意な変化を誘導する可能性があるという仮定が実証されていません。ここでは、初めて我々の研究室でGMFを逆にする三軸八角形のヘルムホルツコイルを使用し、周囲の磁場の反転が表現型の変化や植物における遺伝子発現の調節を引き起こす可能性があることを方法を示しています。 植物成長実験（2×2×2 m 3で）のに十分な量の上GMF反転（または変更）を得るために、我々は、八角形のヘルムホルツコイルシステムを構築しました。このシステムは、（通常、ヘルムホルツコイルがリング状であり、小さい方）市販されていませんそして、建設のためのコストがかなりありました。重要なことは、このシステムが変更された磁場中で例外的な時間の安定性と均一性で、堅牢なフィールドの変更を実現します。 システムは正常な状態の千にGMFの値を小さくしたり、磁場の3次元のいずれかを逆転させるために設計され、構築されています。しかしながら、コイルの設計は、高い磁場強度を生成することはできません。したがって、本形態では、この器具は、植物または他の生物に高磁場強度の効果を評価するために設計した実験には適していません。 研究室では、この方法に記載したものと同様のGMFの変化は、磁場を外れると、金属自体の中でそれらを濃縮する高透磁率を有する強磁性金属板によって実験ゾーンを囲むことによりシールドを含む、様々な方法によって得られました。目ヘルムホルツコイルを使用しての電子の利点は、システムは、このようにそれだけでなく、in vitro試験のための（ペトリ皿の使用と同様に）理想的なだけでなくなって、植物がより自然条件（光、空気循環等 ）にさらされることを可能にすることですインビボでの植物の成長及び発達実験のため。我々のシステムの寸法は、このようにいくつかのペトリ皿またはいくつかの小さなをホストできるように、（ 図1Aを参照してください ）25×25×25 cm 3の球状の体積全体の自然GMFの&lt;1 /第千まで抑制することができるスペースを作成植物の成長のためのポット。 ここに提示される方法は、生物学の研究を植物に適用されてきました。しかし、このシステムは、ウイルス学や微生物学だけでなく、線虫の研究（例えば、 線虫（Caenorhabditis elegans））、（マウスおよびラットを含む）節足動物や小動物などの実験の広い範囲を、可能にします。 GMFの反転が可能であるという仮説のため、テスト形態学的および転写の変化を誘発することもあっても、ヒトの細胞に、おそらく最終的に、多くの他の生体系に拡張することができます。 GMFは、常に変化と変動しています。したがって、我々の実験で一つの主要な課題は、所望の新しいGMF値を得るために、GMFの一定の補償を提供することにあります。これは、磁力値及び電圧補償の読み取りを介して磁界値を連続的に制御することによって達成することができます。したがって、システムはGMFのゆっくりと変化する部​​分を補うことができますが、それは、より高い周波数の変動を何もしません。 結論として、GMFベクトルを逆にする三軸コイルの使用は、GMFベクトルのこの逆転は、植物形態学的変化と差動遺伝子発現を誘導することができることを実証するために尽力しました。提示される方法を用いて得られた結果は、仮説GMF再を支持する説得力のある証拠を提供しますversalsは、地質学的時間スケール2の上に植物の進化のための原動力の一つとなっている可能性があります。

地球の磁場（または同等地磁気、GMF）は植物を含む地球に住むすべての生物のための避けられない環境因子です。 GMFは、常に地球の自然の特徴となっているので、進化の過程で、すべての生物は、その作用を経験しました。証拠の増加体は、GMFは、多くの生物学的プロセスを1に影響を与えることができることを示しています。 GMFは、一様ではなく、地球の表面で、その大きさと方向を大幅に地元の違いがあります。地球の表面のGMFは30未満、μTから約70μTに至るまで、大きさの広い範囲を示しています。 GMFは、磁気圏2を介して 、その荷電粒子の大部分を偏向させることにより太陽風の致死効果から、地球とその生物圏を保護します。 植物は環境刺激に応答します。そして、このような光や重力などの非生物的要因への古典的な応答は、トンでしたhoroughlyいわゆる屈光性​​や重力屈性応答を定義することによって説明。非常に少ない、または何も、このトピックに公開され、最近では1件の論文の過多にもかかわらず、知覚と磁場に対する植物の応答のメカニズムに知られています。重力場とは違って、GMFは、それによって、最近、最終的に植物の多様化と分化2に貢献する潜在的な駆動力と考えられてきた重要な非生物的ストレス要因を表す植物進化の間に一貫して変化しました。地磁気逆転（またはエクスカーション）はGMFの極性が変化しています。地球の生命を歴史の中で、GMFの反転は数回発生しました。これらは、すべての極性遷移の間に減少GMF強度の期間に惑星を露呈しました。一部の著者は、低GMF強度のこれらの遷移期間は、それによってAを誘導する、太陽風からの電離放射線は地球の表面に到達させたかもしれないという仮説を立てています最終的には植物の進化2につながる遺伝子変化を誘導するのに十分な強されている可能性が生物への一貫したストレス、。 植物における磁場の効果を説明した実験の詳細な分析は、妥当な生物物理学的相互作用機構の不足により特徴付けられる相反する多数のレポートを示します。他の人は最終的に、3を説得している、検証可能な仮説を欠き、一方で多くの実験は、単に非現実的です。過去数年にわたり、植物の磁場の影響に関する研究の進捗状況とステータスが2,4-11を検討されています。最近では、両方の低域と高磁場の影響を完全に植物の進化2のGMF反転イベントの関与に特に焦点を当てて、1を検討されています。 GMFの反転は、植物の進化に影響を与えるという仮説を実証するための最も直接的な手段GMFを合成することです正常な、逆磁場条件に対する植物の応答を試験することにより実験室で逆転。仮説を検証するために、我々は、したがって、正確に通常のGMF条件を逆転させることができる三軸八角ヘルムホルツコイル対の磁場補償制度（三軸コイル）を、構築されました。 我々は、モデル植物としてシロイヌナズナを用いて、我々はいくつかの重要な遺伝子の遺伝子発現に対する逆GMFの効果テスト： ルシフェリン3（CRU3）、チロシンリン酸化され、そのリン酸化状態が対応して変調された12S種子貯蔵タンパク質をコードしますシロイヌナズナの種子 12,13におけるABAへ。土壌Cuの取得と花粉の開発14において支配的な機能を持つ重金属輸送/解毒スーパーファミリータンパク質をコードしている銅交通Protein1（COTP1）;そして、 レドックス応答性転写Factor1（RRTF1）、すなわち、ERF（エチレン応答因子）サブファミリーB-3遺伝子発現経路の相乗的な共活性化を促進し、非生物的および生物15の応力に交差耐性を与える1 AP2ドメインを含むERF / AP2転写因子ファミリーのメンバーをコードします。 （O 2 - ）と水（H 2 O）、過酸化水素（H酵素的に、迅速にスーパーオキシドアニオンに変換する細胞質酵素をコードしたFeスーパーオキシドDismutase1、（FSD1）：また、我々はまた、酸化ストレス応答に関与する5つの遺伝子を分析しました水と酸素17,18へのH 2 O 2分解を触媒 Catalase3（すなわち、コードすることCAT3）、および酵素; 2 O 2）、酸素分子（O 2）16 Thylakoidalアスコルビン酸ペルオキシダーゼ（TAPX）、符号化しH 2 Oを捕捉する葉緑体チラコイドペルオキシダーゼ2 19; H 2 O 2を捕捉すると、NO-20由来の分子によって媒介される翻訳後修飾の潜在的な標的の一つを表すサイトゾルペルオキシダーゼをコードしているアスコルビン酸Peroxidase1（APX1）は 、 O 2を生成する酵素エンコードNADPH- 呼吸バーストオキシダーゼタンパク質D（RbohD） -とシロイヌナズナ21の成長、開発、ストレス応答の調節に重要な役割を果たしているが。 我々のフィールド反転方法はGMF反転がAの形態および遺伝子発現の有意な変化を誘導し得るという最初の証拠を提供しますシロイヌナズナの根と芽。このプロトコルは、植物形態学および遺伝子発現に対するGMF反転の効果を評価するための革新的な方法を提供し、プラントの動作の他の側面にGMF反転の潜在的な影響を評価するために使用することができ、それによりROの議論を導きます植物の進化のGMF逆転のル。

<table><tbody><tr><td>Three-axis magnetometer</td><td>Bartington&amp;nbsp;</td><td>Mag-03MC</td><td>triaxial fluxgate magnetometer</td></tr><tr><td>Magnetometer power supply</td><td>Bartington&amp;nbsp;</td><td>Mag-03PSU</td><td>triaxial fluxgate magnetometer</td></tr><tr><td>Magnetometer software</td><td>Bartington&amp;nbsp;</td><td>Mag03DAM</td><td>triaxial fluxgate magnetometer</td></tr><tr><td>DC power supply&amp;nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>E3642A</td><td></td></tr><tr><td>Calcium hypochlorite&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>211389</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>X100&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>GroLux Sodium vapor lamps&amp;nbsp;</td><td>OSRAM Sylvania</td><td>600W</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plant RNA kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74903</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938B</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>not available</td><td></td></tr><tr><td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>Mx3000P</td><td>Agilent Technologies</td><td>401512</td><td></td></tr><tr><td>2x MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix&amp;nbsp;</td><td>Fermentas International, Inc</td><td>K0221</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Basal Medium</td><td>Sigma</td><td>M5519&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish square (120 x120 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;)</td><td>Sigma</td><td>Z692344&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

geomagnetic field (gmf) and plant evolution: investigating the effects of gmf reversal on arabidopsis thaliana development and gene expression

植物の進化の中で最も刺激的な観察の一つは、地球磁場の発生（GMF）逆転（またはエクスカーション）と被子植物の放射の瞬間との間の相関です。これは、GMFの極性の変化が植物の進化において役割を果たし得るという仮説につながりました。ここでは、人工的にGMF条件を逆にするシロイヌナズナを暴露することによって、この仮説を検証する方法を説明します。我々は、三軸磁力計を使用し、収集されたデータは、GMFの大きさを計算するために使用しました。 3つのDC電源装置は、3つのヘルムホルツコイル対に接続され、GMF条件を変更するために、コンピュータによって制御しました。ペトリプレートで生育した植物は、通常の両方に暴露し、GMF条件を逆転しました。シャム曝露実験も行いました。露出された植物は、実験中に撮影され、画像は、根長と葉の面積を計算するために分析しました。シロイヌナズナ全RNAを抽出し、定量しましたリアルタイムPCR（定量PCR）は、 ルシフェリン3（CRU3）、銅輸送protein1（COTP1）、レドックス応答性転写Factor1（RRTF1）、鉄スーパーオキシドジスムターゼ1（FSD1）、Catalase3（CAT3）、Thylakoidalの遺伝子発現分析を行いましたアスコルビン酸ペルオキシダーゼ（TAPX）、細胞質ゾルアスコルビン酸Peroxidase1（APX1）、および NADPH /呼吸バーストオキシダーゼタンパク質D（RbohD）。四つの異なる参照遺伝子は、定量PCRの結果を標準化するために分析しました。 4つの遺伝子の最良を選択し、正規化のための最も安定した遺伝子を使用しました。我々のデータは、三軸コイルを用いGMFの極性を反転することは、植物の成長および遺伝子発現に対する有意な効果を有することを初めて示しています。これは、最終的にはPにつながる、より高い選択圧を正当化する可能性がGMF反転が植物の発育の変化を誘導することに貢献するという仮説を支持しますLANT進化。

このプロトコルの目的は、時セットGMFを逆転するために使用され、図1（a）に示すように地球磁場（GMF）の反転は、植物発育及びシロイヌナズナ生態型コル0三軸コイルの遺伝子発現に影響を及ぼし得るかどうかを評価する方法を提供することにありますプロトコールのステップ1.5で説明したように適切な駆動電圧（ 図1B）と、得られます。三軸コイルの寸法は、いくつかのペトリ皿をホストする逆GMF条件に十分なスペースを可能にした〜2×2×2メートル3、です。コントロールは、同じ環境条件で、通常のGMF値で増殖させました。 GMF条件ノーマルへの曝露の10日後に、逆に、植物の表現型は明らかに形態変化を示しました。 図2に示すように 、（通常のGMF条件下で増殖させ、すなわち 、）コントロール植物は、有意（ダン-シダック及びボンフェローニの調整度Prob &lt;0.001で根の長さを示しました。逆GMFにさらされる植物に対する（17.53ミリメートルで、N = 32）;スチューデントのt = 10.68、DF = 31）より高い値（29.41ミリメートル; SEM = 1.04、S​​EM = 0.58; N = 36）。 GMF-逆転植物では、芽の形態はまた、リーフレット拡大の減少発展を示すことによって変更されました。スチューデントのt = 31.32、DFを、逆GMF条件にさらされる植物は度Prob = &lt;0.001を調整ダン・シダックとボンフェローニ（大幅に示したのに対し、正常な状態にさらされた植物は、4.95ミリメートル2（SEM 0.025、N = 54）の平均葉面積を示しました= 53）下葉面積値（3.71ミリメートル2、SEM = 0.032; N = 54）。したがって、逆GMF条件にシロイヌナズナの露出は根長と葉面積の両方の減少を誘導しました。 葉の拡大と根の成長は、分裂、細胞27の伸びの両方に依存しています。したがって、植物の開発、生産性と全体的なフィットネスは、最適なshoot-とルートシステムアーキテクチャに依存しています&lt;SUP&gt; 28。縮小根長と逆GMF条件にさらされる植物の葉の大きさは、磁場強度の変動を認識するだけでなく、重力に比べて磁界の変化を「方向」に応答することができる検出システムの存在を示します。 GMF反転が植物の成長に影響を与える可能性があるという仮説は、GMF反転条件が大幅に植物の発育に影響を与えることができることを実証する実験において、説得力のある証拠を見つけます。 形態学的変化は、遺伝子発現の変化を伴っていました。ハウスキーピング遺伝子の中で、最も安定した遺伝子は、 伸長因子1（b）のアルファサブユニット2であった 。遺伝子の最初のグループ（CRU3、COTP1、RRTF1）は 、遺伝子発現（ 図3）の劇的な変化を示しました。すべての3つの遺伝子の発現が有意に準備にさらされる植物では約2.5倍（P &lt;0.05）増加したシュートD GMF条件。 CRU3のルート式は逆GMF条件においてダウンレギュレートした（P &lt;0.05）、通常のGMFの条件にさらされた植物で根においてアップレギュレートされ、有意でした。反対は、通常の状態でダウンレギュレートし、GMFの逆転（ 図3）の存在下でアップレギュレートされたCOTP1とRRTF1、見つかりました。 ルシフェリン（12 Sグロブリン）は、Aの種子中で最も豊富な貯蔵タンパク質でありますシロイヌナズナや他のアブラナとは、粗面小胞体内の前駆体として合成されます。次いで、これをタンパク質貯蔵液胞13に搬送されます。苗の発芽は、窒素の初期ソースとして使用されるルシフェリンの内訳を、必要とします。ダウンレギュレーション劣化をルシフェリンの細胞構造や細胞成分の開発29,30を損なうことにより、胚の発生を低減します。我々の結果は、CRU3のアップレギュレーションはと相関することを示していますこのようにして下葉の拡大と縮小根長、G​​MF反転に敏感で、この遺伝子れ、その過剰発現が植物の発育の低減に寄与し得ることを示しています。また、GMF反転が減少根の長さと相関根におけるCRU3の大幅なダウンレギュレーションを誘導します。銅は植物中の主要プロセスに不可欠な補因子であるが、それは過剰に有害な効果を発揮します。したがって、銅の輸送を過剰発現する植物の成長を損ないます。 GMFの逆転の効果は、このように減少し、植物の成長を説明する、シュートおよび根の両方におけるCOTP1の有意な過剰発現がありました。イオン応力がしっかり細胞の酸化還元状態にリンクされている葉緑体の代謝を損ないます。シロイヌナズナで転写因子RRTF1は、酸化還元に調整する能力31を変更するには、関連する遺伝子の発現のために重要です。したがって、植物は、その生理学的および開発を変えることができる外部刺激にさらされているときアルプログラムは、この重要な転写因子の過剰発現が期​​待されます。 GMFの逆転は、このように逆GMF条件に対する植物の高い酸化ストレス応答を示し、芽と根の両方でRRTF1の大幅な過剰発現を誘導しました。 興味深い結果は、酸化ストレスに関与する5つの遺伝子を解析することにより得られます。植物が正常に成長又はGMF条件（ 図4、図5）を逆転したときに一般的には、芽で抽出し、分析した全ての遺伝子が有意差（P&gt; 0.05）を示さありませんでした。しかし、かなりのダウンレギュレーションは、常に逆GMF条件にさらされる植物の根において観察されました。特に、CAT3が最高のダウンレギュレーション（ 図5）を示した （ 図4）APX1、FSD1、RBOHDとTAPXによってダウンレギュレーションのために続きます。 にクロス寛容生物的および生物的ストレスは、いくつかの生化学的経路に関与する種々の遺伝子の活性化によって提供される。RRTF1転写因子は、これらの経路15,31の遺伝子発現の相乗的な共活性化を促進し、そして潜在的に酸化ストレス32に関与することができます。脱酸素が ​​減少したときしたがって、RRTF1のアップレギュレーションが期待されます。ルート捕捉酵素のダウンレギュレーションは、増加した酸化ストレスに応答して作用するRRTF1のアップレギュレーションと相関します。 CAT3、APX1とTAPXの劇的なルートダウンレギュレーションは、FSD1のダウンレギュレーションにより、スーパーオキシドアニオンをdismutate能力の低下を伴って、H 2 O 2を 、捕捉する根細胞の減少能力を示します。酸化ストレス応答は逆GMF知覚の主要な部位であると思われるルーツが高いです。 図1.地磁気補償システム 。 （A）三軸コイル（3直交軸のそれぞれに八角形のコイル対を含む）は、地磁気ベクトルを逆にするために使用されます。 （B）は、コンピュータ制御された電源は、ヘルムホルツコイルの各対に接続されています。 （図中の電圧は任意である<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53286/53286fig1large.jpg" target="_blank">）、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig2.jpg" /> 図シロイヌナズナの形態の地磁気逆転の2影響 。曝露の10日後、対照植物（ すなわち 、通常のGMF条件に暴露されたもの）は、著しく大きな根長、よりEXPANを表示逆GMF条件に曝露した植物と比較DEDリーフレット。メトリックバー= 18ミリメートル。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53286/53286fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig3.jpg" /> 図シロイヌナズナ遺伝子発現に対する地磁気逆転の3影響 。曝露の10日後、対照および処理した植物の総RNAを抽出し、発現分析のためにリアルタイムPCRによって分析しました。 GMFの逆転の効果を試験した全ての遺伝子の遺伝子発現の急激な変化を誘導することであったCRU3、ルシフェリン3;。COTP1、銅輸送Protein1; RRTF1、レドックス応答性転写Factor1。バーは標準誤差を示します。アスタリスクは、PLとの間に有意な（P &lt;0.05）の違いを示し、逆および通常のGMF条件に暴露アリ。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53286/53286fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig4.jpg" /> 図シロイヌナズナ抗酸化関連遺伝子の発現に地球磁場逆転の4影響 。曝露の10日後、対照および処理した植物の総RNAを単離し、リアルタイムPCRを用いた遺伝子発現解析のために用いられます。 GMFの反転の効果がシュート遺伝子発現に有意な変化を誘発しないことでした。しかし、大幅なダウンレギュレーションが逆転GMF条件の下で栽培された植物の根の遺伝子発現で観察されたTAPX、Thylakoidalアスコルビン酸ペルオキシダーゼ ; APX1、アスコルビン酸Peroxidase1; FSD1、鉄スーパーオキシドDismutase1; RbohD、NADPH /呼吸バーストオキシダーゼタンパク質Dバーは標準誤差を示します。アスタリスクは逆に、通常のGMF条件にさらされた植物との間に有意な（P &lt;0.05）の違いを示している。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53286/53286fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig5.jpg" /> 図シロイヌナズナカタラーゼ3（CAT3）遺伝子発現に対する地磁気逆転の5影響 。曝露の10日後、対照および処理した植物の総RNAを単離し、リアルタイムPCRを用いた遺伝子発現解析のために用いられます。 GMFの反転の効果がシュート遺伝子発現に有意な変化を誘発しないことでした。しかしながら、急激なダウンレギュレーションが逆GMF条件下で成長した植物の根の遺伝子発現で観察されました。バーは標準ERROを示しますR;アスタリスクは逆に、通常のGMF条件にさらされた植物との間に有意な（P &lt;0.05）の違いを示している。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53286/53286fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.

地磁気（Gmfと）と植物の進化：Gmfと逆転の影響に関する調査を<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;開発と遺伝子発現

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

geomagnetic-field-gmf-plant-evolution-investigating-effects-gmf

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

13.2K ビュー.  University of Turin. This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.

ビデオ: Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for germination or early seedling development are activated by gibberellin (GA), while genes associated with stress responses are activated by abscisic acid (ABA). The mechanisms of GA and ABA signaling can be interrogated by introducing reporter gene constructs into aleurone cells via particle bombardment, with the resulting transient expression measured using enzyme assays. An improved protocol is reported that partially automates and streamlines the grain homogenization step and the enzyme assays, allowing significantly more throughput than existing methods. Homogenization of the grain samples is carried out using an automated tissue homogenizer, and GUS (&#946;-glucuronidase) assays are carried out using a 96-well plate system. Representative results using the protocol suggest that phospholipase D activity may play an important role in the activation of HVA1 gene expression by ABA, through the transcription factor TaABF1.

An improved protocol is presented for the measurement of transient gene expression from reporter constructs in barley aleurone cells after particle bombardment. The combination of automated grain grinding with 96-well plate enzyme assays provides high throughput for the procedure.

スループットを向上させると衝撃されたオオムギ糊粉層における遺伝子発現を測定

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

遺伝学

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

誘導、細胞型における発現シロイヌナズナLhGR を介したトランス-活性化

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

シロイヌナズナの胚発生の特性評価法

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

発生生物学

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

生物学

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

フローラルディップ変換のシロイヌナズナ調べに pTSO2：：β-グルクロニダーゼレポーター遺伝子発現

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

から初期段階の胚の効率的かつ迅速な単離<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;種子

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of dormant seeds or that of nondormant seeds irradiated by a far red (FR) light pulse. In order to further gain insight into the molecular genetic mechanisms underlying the germination repressive activity exerted by the endosperm, a &#34;seed coat bedding&#34; assay (SCBA) was devised. The SCBA is a dissection procedure physically separating seed coats and embryos from seeds, which allows monitoring the growth of embryos on an underlying layer of seed coats. Remarkably, the SCBA reconstitutes the germination repressive activities of the seed coat in the context of seed dormancy and FR-dependent control of seed germination. Since the SCBA allows the combinatorial use of dormant, nondormant and genetically modified seed coat and embryonic materials, the genetic pathways controlling germination and specifically operating in the endosperm and embryo can be dissected. Here we detail the procedure to assemble a SCBA.

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

We present the procedure to assemble a seed coat bedding assay (SCBA) from Arabidopsis thaliana seeds. The SCBA was shown to be a powerful tool to explore genetically and in vitro how the endosperm controls seed germination in dormant seeds and in response to light cues. The SCBA is in principle applicable under any situation where the endosperm is suspected to influence embryonic growth.

遺伝的に探索するために種皮寝具アッセイ<em&gt;体外</em&gt;どのように胚乳コントロール種子発芽<em&gt;シロイヌナズナ</em

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

時空のCaを測定する<sup&gt; 2 +</supシロイヌナズナ植物における&gt;シグナル

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン<em&gt;インビボ</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

タバコ一過性発現系を使用したMAPKシグナル伝達経路の空間再編のイメージング

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

地磁気（Gmfと）と植物の進化：Gmfと逆転の影響に関する調査を

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スループットを向上させると衝撃されたオオムギ糊粉層における遺伝子発現を測定

誘導、細胞型における発現シロイヌナズナLhGR を介したトランス-活性化

シロイヌナズナの胚発生の特性評価法

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ

フローラルディップ変換のシロイヌナズナ調べに pTSO2：：β-グルクロニダーゼレポーター遺伝子発現

から初期段階の胚の効率的かつ迅速な単離

遺伝的に探索するために種皮寝具アッセイ

時空のCaを測定する

シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン

タバコ一過性発現系を使用したMAPKシグナル伝達経路の空間再編のイメージング