This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).

1. SPPS：CK（TMR）TATG（fTAT）の合成注：dfTATを形成するジスルフィド結合二量体化に続いて、固相ペプチド合成によってfTATモノマーの合成：dfTATは二段階で製造されます。 <ol><li> 1時間の標準的な50 mlのSPPS容器中にジメチルホルムアミド（DMF）中のRinkアミドMBHA樹脂500mgの膨潤。 </li><li> 20％ピペリジン溶液（DMF中20％ピペリジンを10ml（0.30ミリモル）中のFmoc保護樹脂をインキュベートすることによってFmoc脱保護を行う。使用した洗浄工程で（1×5分間および1×15分）で2回脱保護工程を実行し反応の間にDMF（洗浄工程は、約150 mlのDMFの総容積で樹脂を複数回洗浄し、真空ろ過により溶媒を除去することを含みます）。 </li><li> RinkアミドMBHA樹脂にCK（TMR）RKKRRQRRRG（fTAT）を合成。使用したFmocは、アミノ酸の保護以下：Fmoc-Lys（Mtt）-OHを（N末端のみに）、のFmoc-Lysのカルボニル（Boc）を-OH、のFmoc-Glyを-OH、のFmoc-Argの（はPbf）-OH、のFmoc- GLN（Trtの）-OH、およびFmoc-Cysを（Trtの）-OH。反応を攪拌するN 2（20 PSI）を使用して反応を行います。室温で全ての反応を実行します。 <ol><li> 4時間、各アミノ酸カップリング反応を行います。各カップリングのため、のFmocアミノ酸（1.2ミリモル）、N、N、N &#39;、N&#39; -Tetramethyl- O-（1 H -benzotriazol -1-イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HBTU）（0.44グラム、1.1ミリモル保護使いますDMFに溶解）、およびジイソプロピルエチルアミン（DIEA）（0.51ミリリットル、3.0ミリモル）。 4時間のカップリングに続いて、ステップ1.2で説明したようにDMFで樹脂を洗浄し、Fmoc脱保護ステップを実行します。 </li><li>合成した：fTATの直鎖状ペプチド鎖（CKRKKRRQRRRGなしTMRリニアペプチド鎖が）まで繰り返します。 </li><li>そして、徹底的に最初にDMFを使用して、ジクロロメタン（DCM）であることを以下の樹脂を洗浄。 DMFまたはDCMの約150ミリリットルの全容量で樹脂を複数回すすぎ、真空濾過により溶媒を除去します。 </li><li> USE MALDI-TOFは、得られたペプチドは、適切な分子量を有することを確認しました。 <ol><li>水溶液とアセトニトリル50μlの0.01％TFAを50μlからなる溶液にマトリックス1mgを追加することにより、マトリックスミックスを行います。 </li><li>直鎖状ペプチド鎖の質量、使用αシアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸を確認します。粗ペプチドの分析HPLCを実行し、純粋なピークの頂点から50μLを集めます。 </li><li> MALDIプレート上にプレートに試料を調製するために：乾燥または37℃の熱板上を空気にMALDIプレート上にマトリックス溶液と場所の2μlにペプチドの8μLを追加します。 注：アルギニンは、SPPS中のカップルに困難なアミノ酸であることが知られています。成功したカップリングはKaiser試験14（例えば、ニンヒドリンテスト）を実行することによって確立されます。このテストでは、樹脂上にカップリングしていないままになることがあり遊離アミンの検出を可能にします。場合に青色が（遊離アミンの存在を示す）を検出し、結合のTEPSを繰り返します。 </li></ol></li></ol></li><li> CKのために（-NH-TMR）TATG（fTAT）、1％トリフルオロ酢酸（TFA）、2％トリイソプロピルシランからなる溶液でCKでのLysのアミノ基で（-NH-MTT）をTATGのMtt保護基を開裂DCM（TIS）。 <ol><li> MTT保護基の除去には、黄色の色が観察されなくなるまでこれを繰り返して、5分間、上記溶液20mlで樹脂をインキュベートし、イエロー色の外観をもたらすように。間に、DCM、DMFで樹脂を洗浄します。 TISは、MTTを清掃うスカベンジャーであることからさらに、一度何の黄色はMTTの存在下で、溶液中で表示されません。 </li><li>これ以上MTTが削除され、溶液は透明のままであることを保証するための樹脂に、DCM中の1％TFA（無TIS）と追加の溶液を加えます。 </li></ol></li><li> DMF中のカルボキシ（TMR）、HBTU、およびDIEA（（）MG中の樹脂の量に対して4、3.9および10等価）、この混合物を追加します。3成分を溶解樹脂に、反応を実施O / Nで攪拌を提供するために、乾燥N 2を用いました 。 </li><li> Fmocの脱保護およびアミノ酸結合後、DCMで樹脂を洗浄し、乾燥させます。樹脂からのペプチドの完全な切断のために、3のためのペプチジル樹脂を92.5％TFA、2.5％H 2 O、2.5％TIS、2.5％のエタンジチオール（EDT）（総容積= 4 ml）を含有する溶液を加え樹脂からグローバルな脱保護および切断を達成するために、室温で時間。 <ol><li> Et 2 O 40ミリリットルにステップ1.6からの溶液を排出することによって冷たい無水エチルエーテル（Et 2 Oで）を使用して、粗ペプチド産物を沈殿させ、4℃でスピンダウンし、20 4,000 XG - 25分。冷たい無水Et 2 Oで沈殿物を洗浄できるようにするには、この手順を繰り返し</li><li>水（5 mlまたは沈殿物が完全に溶解するまで）、および凍結乾燥の沈殿物を再懸濁します。その後、0.1％TFA水溶液/アセトニトリル中で得られた生成物を再懸濁します。 </li></ol></li> &lt;李は&gt;各ペプチドを分析するための分析C18カラム（5ミクロン、4×150ミリメートル）でHPLC分析を行います。 1ml /分、および214nmで検出し、550nmでの流量を使用します。 </li><li>ペプチド精製のためのC18 10×250mmカラム上の分取用HPLCを実行します。 214 nmおよび550 nmでのフロー4ミリリットル/分の速度、および検出を使用してください。すべての実行については、0.1％TFA水溶液（溶媒A）、90％アセトニトリル、9.9％の水、0.1％TFA（溶媒B）の直線勾配を使用しています。 </li><li> fTAT、予想質量：2,041.17、観察された質量：2040.66、製造業者のプロトコルに従って、MALDI-TOFによりペプチドの正確な身元を確認してください。 DEAC-K9、予想質量：1,415.59：1,412.97は、質量を観察しました。 MALDI-TOF用のα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸マトリックスを使用してください。 </li></ol> 2.酸化反応：dfTATジェネレーション<ol><li> 1時間（以下の反応のための少なくとも5 ml）を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH7.4中に通気。 </li><li> AERにfTAT（0.3ミリグラム、1.5×10 -4モル）を溶解PBSのpHを7.4（5 ml）をated。ペプチドを添加した後、7.5 - pHが7.0の間にあることを確認してください。バック7.4までのpHを - （5μlの1 M、少しずつ1）水酸化ナトリウムを追加しない場合。 </li><li>注：PBSに溶解した酸素はfTAT上のチオール基を酸化し、ジスルフィド結合を形成するように作用します。 </li><li>それが完了（HPLC分析に基づいて、100％の収率）まで反応することを可能にする反応章動O / N。逆相HPLCを用いて生成物を精製し、ステップ1.9のように質量分析法（MALDI-TOF）によって分析します。期待質量：4,084.21：4,080.34は、質量を観察しました。 </li><li>凍結乾燥純粋dfTAT（0.71×10 -4 mmol）および200μlの水に再懸濁し（濃度純粋dfTAT = 356.3μM）。 </li></ol> 3. dfTAT濃度を測定<ol><li> 50 mMのTCEP溶液を149μlの精製したdfTAT（精製されたペプチドの量に応じて、通常は1マイクロリットル）のアリコートを再懸濁します。 </li><li>注：このステップではdfTATは、そのMOに還元されます原因dfTATでTMRの蛍光団（dfTATにおけるTMRの吸光係数εが減少fTATにおけるTMRのεと比較して減少している）の近接に発生した吸光度消光を排除するnomer対応fTAT。 </li><li> （分析HPLCはfTATの形成を確認するために使用することができる）、サンプルを約20分間反応させます。 </li><li>石英キュベットにすべてのソリューションを追加し、556 nmの吸光度を測定します。 </li><li>ベールの法則を用いて（A =εcl：ε= 91500 M -1 cm -1で）は 、fTATの濃度を計算dfTATの濃度を決定し、2で[fTAT]分割します。 </li></ol> 4.細胞配信実験<ol><li> 90％（例えば、8ウェルまたは24ウェルディッシュ） - 80の密集度でシャーレ内の細胞（HeLa細胞、HDF など ）をシード。 37℃で90％の密集度-適切な培地中で細胞を増殖させる80まで（例えば、DMEM、10％FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを補充しました）5％のCO 2を含む加湿雰囲気。 </li><li> （200μlのPBSを追加し、それを3回除去することによって）、PBSで細胞を3回（3回）洗浄します。 </li><li> （8のためによく全量を200μlのでなければならない一品）NRL-15培地中で（水中）dfTATの株式を希釈することによりdfTATの作業濃度5μMを行います。 5μMdfTATの濃度は、現在までに試験されたほとんどの細胞型で効率的な配信（皿の中に存在する細胞の90％以上で細胞質ゾルデリバリーのハイレベル）（ 図3）につながります。しかし、より低いまたはより高い濃度の浸透に高いまたは低い傾向を持つ細胞タイプのためのより適切な場合があります。 メディアに関する注：それはdfTAT中のジスルフィド結合を減らすことができるシステインを含んでいないため、NRL-15はdfTATの送達のために使用されます。しかし、我々のデータは、通常のL-15（システイン）及びDMEM両方が送達媒体として使用することができることを示しています。 L-15は、還元アミノ酸システインが、システインpresumabが含まLYは（DMEMがシスチンを用いて製剤化された）、シスチンを形成するために、培地中で酸化します。 dfTATしたがって、これらの媒体内にそのまま残り、配信はnrL15で得られたものと同じ効率で動作します。 </li><li>伴うまたは積荷なしdfTAT（5μM）（ 例えば 、EGFP（10μM））で細胞をインキュベートし、（インキュベーション時間を低減することができるが、dfTATは、典型的には、エンドソームの漏出を誘導するために、約30〜45分を必要とし、1時間37℃で維持）。 </li><li>細胞の細胞膜に結合したdfTATを削除する（3回の洗浄が推奨されている）L-15中のヘパリン（1 mg / ml）で細胞を洗浄。 </li><li>に従ってのSytoxブルー、。 例えば、細胞不透過性の核染色で細胞をインキュベートし、のSytoxグリーン（NRL-15で2μM）、細胞の細胞膜が損なわれているかどうかを判断する（生細胞ではないだろうが、死細胞を染色されます）製造業者のプロトコル。 </li><li>蛍光顕微鏡（100倍の油浸または20X対物レンズ）を用いて、画像セル。 RFPフィルタを用いた画像dfTAT（例=560±20 nmで/エム= 630±35 nm）で。 注：正常配信は（目的のタンパク質またはペプチドの送達を評価する用途に依存する）は、細胞全体dfTAT蛍光の拡散につながります。 fTAT（サイトゾルエントリ時dfTATの還元生成物）による核小体の染色が検出された蛍光が細胞内であることを指標として用いることができます。 fTATは数時間以内に低下します。この時点で、分解フラグメントの蛍光は点状として表示されます。これはdfTATが失敗した（dfTATは濃度が低すぎるで存在する場合、この現象が発生することができます）、エンドソーム内に閉じ込められたまま場合にも見られている点状分布のために混同してはなりません。 </li></ol>配信MOIの5 Controling濃度<ol><li>使用した細胞型におけるdfTATの効率的な細胞質の放出を達成するために必要な「最適な配信」の濃度を特定します。 increasinとインキュベートした細胞に蛍光顕微鏡を実行しますdfTAT gの濃度。最適dfTAT濃度はサイトゾル消去につながる最小濃度として定義されている培養物中の細胞の約100％にTMR蛍光を「拡散します」。 </li><li> （dfTATの最適な送達濃度を用いて、例えば ）dfTAT一定の濃度を維持しながら、MOIの濃度は、共インキュベーションプロトコルで使用される変化します。 1時間未満にインキュベーション時間を変更すると、MOIは、配信の量を変化させるためのオプションであってもよいです。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

これは送達効率に影響を与える可能性があるためdfTAT配信に使用される細胞は、（&gt; 90％の集密度）過度にコンフルエントであってはなりません。細胞はまた、健康でなければなりません：文化の中で死んだ細胞がdfTATは（劣化した核から例えば、DNA）を対話することができるアポトーシス断片を放出することができます。これにより、配信効率及びイメージングの質を妨害すること?...

生細胞へのタンパク質、ペプチドまたは細胞不透過性小分子の送達は、多くの生物学的またはバイオテクノロジー用途（細胞イメージング、機能的アッセイ、細胞の再プログラミングなど ）1-4でしばしば望ましいです。多くの送達アプローチは、既にマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、またはキャリア剤の使用を含め、報告されている（ 例えば 、例えば、TATのような細胞透過性ペプチド、脂質）5-7。各技術は、典型的には、特定のアプリケーションのためではなく、他人のために、これらのアプローチが適切になるかもしれない特定の長所と短所を持っています。一般的な問題は、 例えば （全人口の貧しい配信の効率化および/ ​​または8,9を配信されるどのくらいの材料の制御の欠如、毒性または有害な生理学的影響10,11、時間的制御の欠如、少数の細胞での配信ではなく、を含みます。、マイクロインジェクション）12、および複雑な化学的結合または製剤スキーム11。 S = &quot;jove_contentは&quot;&gt;最近​​、我々はこれらの制限を回避する新たな配信戦略を開発しました。この戦略は、dfTAT（二量体蛍光TAT）13という名前のペプチドに依存しています。 dfTATは周知の細胞透過性ペプチド（CPP）TATに由来します。 dfTATは、フルオロフォアのテトラメチルローダミンで標識TATの2つのジスルフィド結合したコ​​ピーが含まれています。その類似性にもかかわらず、TATおよびdfTAT活動に大きく異なります。 TATは、典型的には、エンドサイトーシスによって細胞内に内在化されます。このCPPは、しかし、大部分（蛍光顕微鏡で検査したとき、これは通常、細胞内ペプチドの点状の分布につながる）、エンドソーム内に閉じ込められたままになります。 TATのように、dfTATを効率的に細胞によってエンドサイトーシスされます。しかし、dfTATはエンドソーム内に閉じ込められたままにしません。その代わりに、それは非常に効率的な方法でエンドソーム漏れを媒介します。 dfTATのエンドソーム溶解活性は、単純なインキュベーションアッセイにより高分子を提供するために活用することができます。 ntentは &quot;&gt;次のように配信プロセスの現在の理解がある。dfTATがマクロピノサイトーシスを誘導する。その結果、dfTATとともにインキュベートした細胞は、流体相によってメディアに存在する可溶性タンパク質、ペプチド、または小分子（目的の分子、MOI）を取り上げますエンドサイトーシス（ 図1参照）。dfTATとMOIの間の相互作用が必要でない両方のエンティティトラフィック限り一緒にエンドサイトーシス経路内。dfTATはエンドサイトーシスの細胞小器官の内腔内の特定のしきい値に達すると、それはそのエンドソーム漏洩活性を発現する（分子の詳細。）完全には特性決定されて漏出性細胞小器官の内腔の内容のままであり、したがってMOIは、その後、細胞内に放出される。MOIとの接合または製剤スキームが必要とされないように、このアプローチは、したがって、非常に便利です。また、dfTATであるため、直接MOIを変更していない細胞内送達が達成されると、それはまたのMOIの機能を妨害してはならない。また、濃度をdfTATは、配信がメディアでMOIのそれとは独立して使用します。例えば、dfTAT濃度がエンドソーム漏れで再現可能な効率を保証するために、異なる実験間で一定に保つことができます。対照的に、培地中のMOIの濃度が徐々にMOIの所望のレベルを達成するために変更することができる細胞質ゾルに送達しました。 dfTATで達成高エンドソーム漏れ効率は、現在までに試験した細胞の多くと非常に無害です。エンドサイトーシス小器官は細胞の重要な構成要素であり、1つはdfTATによって媒介劇的な漏れが有害な細胞応答を伴うことであろうと予想されるので、これは驚きです。しかし、処理された細胞は、未処理の細胞と同じ速度で増殖し、そのトランスクリプトームの有意な変化は表示されません。また、配達は、細胞が失わずに許容されたり、配信プロセスから回復するかことを示し、再現性の配信効率で数分以内に繰り返すことができますエンドサイトーシスまたはエンドソーム漏れ能力。微妙な細胞応答はdfTAT配信およびこれらの応答が探求されないままであるかもしれないものの分子の詳細の間に行わ可能性があります。しかし、高効率、プロトコルの利便性、および毒性の欠如を組み合わせることで、この配信アプローチは、多くの細胞ベースのアプリケーションですぐに有用であることを証明する必要があります。本明細書に提示プロトコルは研究団体にこの技術がアクセス可能にすることを目的としています。

<table><tbody><tr><td>Heparin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>CAS 9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Blue</td><td>Invitrogen</td><td>S11348</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>nrL15 L-15 (&amp;ndash;) cysteine</td><td>Hyclone</td><td></td><td>Special order</td></tr><tr><td>Fmoc-protected Amino acids</td><td>Novabiochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dfTAT</td><td></td><td></td><td>Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu)</td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted epifluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td>model IXB1</td><td>equipped with a heating stage maintained at 37 &amp;deg;C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C humidified, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

delivery of proteins, peptides or cell-impermeable small molecules into live cells by incubation with the endosomolytic reagent dftat

高分子送達戦略は、典型的には、細胞侵入経路としてエンドサイトーシス経路を利用します。しかし、エンドソーム捕捉が大幅に細胞の細胞質ゾル空間を貫通巨大分子れる効率を制限します。最近、我々は、試薬dfTAT、蛍光体テトラメチルローダミンで標識されたペプチドTATのジスルフィド結合二量体を識別することによって、この問題を回避しています。我々は、生細胞に浸透し、特に高い効率で細胞の細胞質ゾル空間に到達した原型の細胞透過性ペプチド（CPP）、TAT、dfTATの蛍光標識された二量体を生成しました。 dfTATのサイトゾル送達は初代細胞を含む複数の細胞株において達成されます。また、配達は著しく細胞の生存率、増殖または遺伝子発現に影響を​​与えません。 dfTATは、小分子、ペプチド、抗体、生物学的に活性な酵素や転写因子を提供することができます。本稿では、dfTAに関わるプロトコルを記述T合成および細胞送達。原稿は、細胞外に投与されたタンパク質の量を変化させることによって、細胞の細胞質ゾル空間に送達されるタンパク質の量を制御する方法について説明します。最後に、この新しい技術と配信の検証に必要な手順の現在の限界が議論されています。記載されているプロトコルは、細胞ベースのアッセイのためだけでなく、 細胞のex vivoで操作し、再プログラミングのために非常に有用です。

fTAT dfTATとの間の差を評価するために、HeLa細胞は、その細胞内局在の違いを決定するために、それぞれのペプチドで1時間インキュベートします。 2 CPPのの内在化は、蛍光顕微鏡を用いて評価した。 図2は fTAT（20μM）は点状の分布に局在することを示しています。この分布は、エンドソームの内部に閉じ込められたままのペプチドと一致しています。これとは対照的に、dfTAT（5μM?...

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Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

エンドソーム溶解試薬dfTATとのインキュベーションによって生細胞へのタンパク質、ペプチドまたは細胞不浸透性小分子の送達

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

delivery-proteins-peptides-or-cell-impermeable-small-molecules-into

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JoVE Journal

Bioengineering

10.2K ビュー.  Texas A&M University. We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky. 

ビデオ: Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Physical interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane protein complexes and in dynamic processes such as transmembrane (TM) signaling and regulation of cell-surface protein levels. Understanding the structural features driving the association of particular sequences requires sophisticated biophysical and biochemical analyses of TM peptide complexes. However, the extreme hydrophobicity of TM domains makes them very difficult to manipulate using standard peptide chemistry techniques, and production of suitable study material often proves prohibitively challenging. Identifying conditions under which peptides can adopt stable helical conformations and form complexes spontaneously adds a further level of difficulty. Here we present a procedure for the production of homo- or hetero-dimeric TM peptide complexes from materials that are expressed in E. coli, thus allowing incorporation of stable isotope labels for nuclear magnetic resonance (NMR) or non-natural amino acids for other applications relatively inexpensively. The key innovation in this method is that TM complexes are produced and purified as covalently associated (disulfide-crosslinked) assemblies that can form stable, stoichiometric and homogeneous structures when reconstituted into detergent, lipid or other membrane-mimetic materials. We also present carefully optimized procedures for expression and purification that are equally applicable whether producing single TM domains or crosslinked complexes and provide advice for adapting these methods to new TM sequences.

Biophysical and biochemical studies of interactions among membrane-embedded protein domains face many technical challenges, the first of which is obtaining appropriate study material. This article describes a protocol for producing and purifying disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes that are suitable for structural analysis by solution nuclear magnetic resonance (NMR) and other analytical applications.

構造研究のためのジスルフィド安定化膜貫通ペプチド複合体の生産

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

化学

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

堅牢、マイクロ流体細胞内送達プラットフォームとしての細胞絞る

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

生物工学

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum (ER) resident proteins implicated in homotypic fusion of the ER. We detail here a method for purifying a glutathione S-transferase (GST) and poly-histidine tagged Drosophila atlastin by two rounds of affinity chromatography. Studying fusion reactions in vitro requires purified fusion proteins to be inserted into a lipid bilayer. Liposomes are ideal model membranes, as lipid composition and size may be adjusted. To this end, we describe a reconstitution method by detergent removal for Drosophila atlastin into preformed liposomes. While several reconstitution methods are available, reconstitution by detergent removal has several advantages that make it suitable for atlastins and other similar proteins. The advantage of this method includes a high reconstitution yield and correct orientation of the reconstituted protein. This method can be extended to other membrane proteins and for other applications that require proteoliposomes. Additionally, we describe a FRET based lipid mixing assay of proteoliposomes used as a measurement of membrane fusion.

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biological membrane fusion is catalyzed by specialized fusion proteins. Measuring the fusogenic properties of proteins can be achieved by lipid mixing assays. We present a method for purifying recombinant Drosophila atlastin, a protein that mediates homotypic fusion of the ER, reconstituting it to preformed liposomes, and testing for fusion capacity.

脂質混合アッセイ用リポソームへの組換えショウジョウバエアラストシンの洗剤支援再構成

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

生化学

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. This information is particularly valuable in the context of host-pathogen interactions. Many pathogen proteins function within host cells in a variety of way such as, enabling evasion of the host immune system and survival within the intracellular environment. To study these pathogen-protein host-cell interactions, several approaches are commonly used, including: in vivo infection with a strain expressing a tagged or mutant protein, or introduction of pathogen genes via transfection or transduction. Each of these approaches has advantages and disadvantages. We sought a means to directly introduce exogenous proteins into cells. Electroporation is commonly used to introduce nucleic acids into cells, but has been more rarely applied to proteins although the biophysical basis is exactly the same. A standard electroporator was used to introduce affinity-tagged bacterial effectors into mammalian cells. Human epithelial and mouse macrophage cells were cultured by traditional methods, detached, and placed in 0.4 cm gap electroporation cuvettes with an exogenous bacterial pathogen protein of interest (e.g. Salmonella Typhimurium GtgE). After electroporation (0.3 kV) and a short (4 hr) recovery period, intracellular protein was verified by fluorescently labeling the protein via its affinity tag and examining spatial and temporal distribution by confocal microscopy. The electroporated protein was also shown to be functional inside the cell and capable of correct subcellular trafficking and protein-protein interaction. While the exogenous proteins tended to accumulate on the surface of the cells, the electroporated samples had large increases in intracellular effector concentration relative to incubation alone. The protocol is simple and fast enough to be done in a parallel fashion, allowing for high-throughput characterization of pathogen proteins in host cells including subcellular targeting and function of virulence proteins.

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

哺乳動物細胞への機能性細菌エフェクターのエレクトロポレーション

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

免疫・感染学

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can make use of the translocating ability of so-called cell penetrating peptides (CPPs), also designated as protein transduction domains (PTDs). The TAT-CPP derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat (trans-activator of transcription) protein has been widely used. The positively charged TAT promotes cell permeability thereby overcoming the barriers of the cellular membrane by endocytosis or/and direct membrane penetration2. In combination with a nuclear localization signal (NLS) fusion proteins are able to enter the nucleus exhibiting functionality. Our video presentation demonstrates, as an exemplification for the engineering of cell-permeable proteins, the construction, production and application of a cell-permeable version of the DNA-modifying enzyme Cre.
Cre is a site-specific recombinase that is able to recognize and recombine 34 base pair loxP sites in mammalian cells in vitro and in vivo. Therefore the Cre/loxP system is widely used to conditionally induce mutations in the genome of living cells3,4. The delivery of active Cre recombinase to cells, however, represents a limitation.
We describe the pSESAME vector system, which allows a direct insertion of the gene-of-interest and provides a platform to rapidly clone different domains and tags used within the vector in a convenient and standardized manner. Rearranging of the different tags has been shown to modify the biochemical properties of the fusion proteins providing a possibility to achieve higher yield and better solubility. We demonstrate how to express and purify recombinant cell-permeant proteins in and from E. coli. The functionality of the recombinant Cre protein is finally validated in cell culture by assessing its intracellular recombinase activity.

Protein transduction enables the direct delivery of biologically active proteins into cells. In contrast to conventional methods such as DNA transfection or viral transduction this non-invasive paradigm allows highly efficient cellular manipulation in a titratable manner circumventing cellular toxicity and the risk of oncogenic transformation by permanent genetic modification.

エンジニアリング細胞透過性のタンパク質

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

生物学

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

大型単層小胞へのペプチドの転座の測定

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Zinc-finger domains are intrinsically cell-permeable and capable of mediating protein delivery into a broad range of mammalian cell types. Here, a detailed step-by-step protocol for implementing zinc-finger technology for intracellular protein delivery is presented.

細胞透過性のCysを用いて哺乳動物細胞への直接タンパク質送達<sub&gt; 2</sub&gt; -His<sub&gt; 2</sub&gt;ジンクフィンガードメイン

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated exocytosis is fundamental for intercellular communication and is a key mechanism for the secretion of neurotransmitters, hormones, inflammatory mediators, and other compounds, by a variety of cells. At least three distinct mechanisms are known for regulated exocytosis: full exocytosis, where a single SG fully fuses with the plasma membrane, kiss-and-run exocytosis, where a single SG transiently fuses with the plasma membrane, and compound exocytosis, where several SGs fuse with each other, prior to or after SG fusion with the plasma membrane. The type of regulated exocytosis undertaken by a cell is often dictated by the type of secretory trigger. However, in many cells, a single secretory trigger can activate multiple modes of regulated exocytosis simultaneously. Despite their abundance and importance across cell types and species, the mechanisms that determine the different modes of secretion are largely unresolved. One of the main challenges in investigating the different modes of regulated exocytosis, is the difficulty in distinguishing between them as well as exploring them separately. Here we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran as an exocytosis reporter, and live cell imaging, to differentiate between the different pathways of regulated exocytosis, focusing on compound exocytosis, based on the robustness and duration of the exocytic events.

Here we detail a method for live cell imaging of regulated exocytosis. This method utilizes FITC-dextran, which accumulates in lysosome-related organelles, as a reporter. This simple method also allows distinguishing between different modes of regulated exocytosis in cells that are difficult to manipulate genetically.

規制エキソサイトーシスの記者として FITC デキストランをイメージング

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Bead Loading Proteins and Nucleic Acids into Adherent Human Cells

Many live-cell imaging experiments use exogenous particles (e.g., peptides, antibodies, beads) to label or function within cells. However, introducing proteins into a cell across its membrane is difficult. The limited selection of current methods struggles with low efficiency, requires expensive and technically demanding equipment, or functions within narrow parameters. Here, we describe a relatively simple and cost-effective technique for loading DNA, RNA, and proteins into live human cells. Bead loading induces a temporary mechanical disruption to the cell membrane, allowing macromolecules to enter adherent, live mammalian cells. At less than 0.01 USD per experiment, bead loading is the least expensive cell loading method available. Moreover, bead loading does not substantially stress cells or impact their viability or proliferation. This manuscript describes the steps of the bead loading procedure, adaptations, variations, and technical limitations. This methodology is especially suited for live-cell imaging but provides a practical solution for other applications requiring the introduction of proteins, beads, RNA, or plasmids into living, adherent mammalian cells.

Bead loading introduces proteins, plasmids, and particles into adherent mammalian cells. This cell loading technique is inexpensive, rapid, and does not substantially affect cell health. It is best suited for live-cell imaging.

ビーズは、接着性ヒト細胞にタンパク質と核酸をロード

Many live-cell imaging experiments use exogenous particles (e.g., peptides, antibodies, beads) to label or function within cells. However, introducing ...

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling, and Macropinocytosis

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase nutrients and other material in cells. The dramatic extension of cell surface ruffles, their closure to form macropinosomes, and the maturation of internalized macropinosomes are key events in this pathway that can be difficult to capture using conventional confocal imaging based on tracking a bolus of fluorescent cargo. Fluorescent dextrans are commonly used experimentally as fluid phase markers for macropinosomes and for other endocytic pathways. A method the lab has adopted to optimize the imaging of dextran uptake involves using live imaging of cells bathed in high concentrations of fluorescent dextran in the medium, with the unlabeled cells appearing in relief (as black). The cell ruffles are highlighted to visualize ruffle closure, and internalized macropinosomes appear as fluorescent vacuoles in the cell interior. This method is optimal for visualizing macropinosome features and allows for easy segmentation and quantification. This paper describes dual-labeling of pathways with different sized dextrans and the co-expression of lipid probes and fluorescent membrane proteins to demark macropinosomes and other endosomes. The detection of internalized dextran at an ultrastructural level using correlative light and electron microscopy (CLEM) is also demonstrated. These cell processes can be imaged using multiple live imaging modalities, including in 3D. Taken together, these approaches optimize macropinosome imaging for many different settings and experimental systems.

<meta charset="utf8"></head><body>生蛍光、細胞波立方位の逆イメージング、およびマクロピノサイトーシス

This protocol demonstrates dextran imaging in live cells using continuous uptake and inverse images to optimize visualization of ruffling, macropinosome maturation, and analysis of dextran and other cell labelings.

生蛍光、細胞波立方位の逆イメージング、およびマクロピノサイトーシス

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase ...