This work is supported in part by American Heart Association Scientist Development Grant and NARSAD Young Investigator Award to Yingwei Mao.

注：動物に関わるすべてのプロトコルはIACUCの＃44057、ペンシルベニア州立大学の動物保護ガイドラインに従って追跡しました 1.レンチウイルス生産注：トランスフェクションの前日には、LentiX-293細胞は、80％の集密度になるようにしてください。 <ol><li>ただ、トランスフェクションの前にDME​​Mで細胞を洗浄し、室温で5分間、ペニシリン（100 IU / ml）およびストレプトマイシン（100μg/ ml）を含むDMEM / 10％FBS 10mlにインキュベートします。 </li><li> 3の比率（1μgのDNA：PEIの3μL）1 DMEM mlの1分間ボルテックスで1にDNAとポリエチレンイミン（PEI）（1mg / ml）を希釈します。 DNAの量はDNAの濃度に依存しました。室温で10分間インキュベートします。 <ol><li>例えば、皿当たりPEIの60μlのベクタープラスミド10μgを、psPax2 145μgのプラスミド、水疱性口内炎ウイルス（VSV）を5μgからなるDNAプラスミド20μgのを、使用しています。 </li></ol></li><lI&gt; 1分間ボルテックスすることにより再びDNAとPEI溶液を混ぜます。室温で10分間インキュベートします。 </li><li> DMEM（100ミリメートル皿中の10ミリリットルの培地のためのすなわち 1ミリリットル）の全培養液の1/10ボリュームを追加します。皿にドロップすることにより、DNA-PEI混合物の低下の1ミリリットルを追加し、培養培地になるまで周りの皿を旋回DNAとよく混合されます。 </li><li>室温で6時間インキュベートし、上清を除去します。培地の5ミリリットルを追加します。 </li><li>トランスフェクション後48時間では、50mlチューブ中で4℃で5分間、627×gでウイルス上清を回収し、スピン。超遠心管に0.45μmのシリンジフィルターを通してウイルス上清30mlのをフィルタリングします。 </li><li>チューブのバランスをとるために滅菌水を追加し、パラフィルムの小片でチューブをカバーしています。 4℃で120分間、11249×gでチューブをスピン。真空チップを用いて液体を除去します。 </li><li>冷PBS100μlのチューブを追加します。静かに4°CO / Nでチューブを揺すります。 </li><li>ウイルス、ピペットTを再懸濁するために、彼はPBSを先端でペレットに触れないように注意しながら、ペレット10回以上のステップ1.8で追加されました。これが完了するまで、ペレットを再懸濁されることはありません。 </li><li> -80℃で液体窒素とストアにフラッシュ凍結、チューブあたり10〜20μlのでウイルスを等分。 </li></ol> 2.定位注射楽器の2.1）準備<ol><li>ハサミ、平滑末端の鉗子、ニードルホルダー、メス、綿棒、および滅菌インジケータと密封されたパック内の布、および手術前にオートクレーブを置きます。さらに、10％ポビドンヨード、70％のエチルアルコール、吸収性縫合糸、加熱パッド、人工涙液、ガラスビーズ滅菌器、ドリル、ドリルビット、2使い捨て注射器、注射器、電気かみそり、鎮痛薬（ケトプロフェン）を得、麻酔（アベルチン）、手袋、噴射ポンプと定位装置。 </li><li> 0.2＆を使用して、新鮮な1.25％アベルチン溶液その日、無菌フード内のフィルタを作成します＃181;滅菌シリンジフィルターをM、および無菌の血清バイアルに入れます。 200ミリリットルの水に溶解し、その後、tert-アミルアルコール5mlに2,2,2-トリブロモアルコール2.5gのを混ぜます。 5. 15未満のpHを保ちます</li></ol>マウスの2.2）準備<ol><li>マウス（375ミリグラム/ kg）の重量に基づいて、アベルチン管理します。15は、腹腔内（IP）注射によってアベルチンでマウスを注入し、その後完全に麻酔をかけたまで戻しケージに配置します。 </li><li>乾燥を防ぐために、IP注射を介して鎮痛剤（ケタプロフェン、5ミリグラム/ kg）を、所定の位置にマウスの目に人工涙液を与えます。 </li><li>マウスは彼らの足をつまんで完全に眠っていることを確認してください。マウスは足のピンチに応答する場合には、（50μLの用量で）より多くの麻酔薬を与えます。電気かみそりを使用して、マウスの頭部を剃ります。 （典型的には、ちょうど耳の後ろから、鼻のトップへ）上で動作する領域、および周辺エリアを剃ります。 </li><li>マウスIを配置定位装置NTO。前部クランプに前歯をラッチし、クランプを下げ、顎が完全に安全であるように、それを締めます。 </li><li>完全に頭を安定させるために外耳道に耳バーを挿入します。内耳に損傷を与える可能性が、あまりにも遠くに耳棒を挿入しないように注意してください。完成したら、マウスの本体は、ヘッドの位置を中断することなく、わずかに移動させることができるようになります。 </li><li>作業中はマウスの体温を調整するために、マウスの下に加熱パッドを配置します。 </li><li>徹底的に手術領域を清掃してください。綿棒を使用して、手術部位の途中から始まり、外側に移動し、円を描くように、10％ポビドンヨードをこします。そして、同じように手術部位に70％のエチルアルコールをこするために綿棒を使用しています。 2回繰り返します。 </li></ol> 2.3）最初の切開<ol><li>マウスが準備されると、滅菌機器バッグを開きます。トウチ前に手袋を変更楽器をngの。無菌布を取り出し、布の上に機器​​を配置します。あらゆる楽器は未滅菌表面に接触した場合、それを滅菌する15秒間ガラスビーズ滅菌器を使用しています。 </li><li>非利き手で利き手と平滑末端の鉗子にメスを取ります。平滑末端の鉗子にそっと握り、マウスの皮膚を使用し、メスを用いて切開します。約1.5cm（鼻側）に耳の上に切開を開始し、耳の下の約0.5cmにまで及びます。 （ 図1）、ブレグマを露出するために、マウスの頭の中央に垂直に切開を拡張します。 </li><li>ブレグマが可視化された後、静かに頭蓋骨の表面を覆う任意の血液を除去するために滅菌綿棒を取ります。ヘッド側に皮膚をプッシュするために、2つの綿のヒントを参考にしてください。 </li></ol> 2.4）機器のセットアップ<ol><li>任意の血液を頭蓋骨の表面から除去され、そしてブレグマが明確に可視化された後、注射器（コンを準備10 8 TU / mlで、1マイクロリットルの容量）のセント。ヒュームフードでは、注入されるウイルスを注射器を埋めます。気泡が内部にないことを確認してください。それは完全に確保されていることを確認して、定位装置に注射器を置きます。 </li><li>無菌の注射針の先端がブレグマの交点と耳のラインに設定されているように、それは、右の頭蓋骨の表面を超えるまでゆっくりとシリンジを下げます。ゼロとしてこの点を設定し、この点からの座標を決定します。 </li><li>関心のある脳の領域に応じて、定位座標を変化させます。脳地図4を利用して、これらの座標を決定します。座標が決定されると、これらの座標と一致するように、注射器の針を動かします。座標を使用して歯状回をターゲット：M / L = +/- 1ミリメートル、A / P = -1.82 mmです。穴が掘削される必要がある場所を視覚化するために頭蓋骨の上に右に針を下ろします。 </li><li>少しシリンジを上げ、ドリルを取り、ドリル双方向を配置T右側頭骨に対して約45°の角度でターゲットドリルサイト以上。掘削を開始し、頭蓋骨は方法を提供するまでの掘削を続けます。頭蓋骨の方法を提供すると、抵抗の低下を検出することができます。皮質の損傷を防止するために、脳内にドリルしないように注意してください。 </li><li>滅菌綿棒を取り、穴からの血を拭い。 </li><li>先端が右脳（ない頭蓋骨）の表面上に位置するように、シリンジを下げます。 D / vの脳アトラス座標に基づいて、所望の深さまで下げ0にシリンジ（深さ）座標を設定します。歯状回に到達するには、-1.79 mmのD / Vに設定します。 </li><li> 0.2μL/分の速度で注入を開始します。注射器は、所望の深さよりも低いスリップしないことを保証するために監視します。この問題が発生した場合は、そっと再び所望の深さまで注射器を上げます。 </li><li>注入が完了した後、任意の残存ウイルスが吸収されたことを確認するために、約2分待ち。ゆっくりとシリンジを上げ、任意のリチウムを除去するために、綿棒を使用注射部位から一口分。 </li><li>他の半球のために繰り返します。 </li></ol> 2.5）縫合<ol><li>そのパッケージとグリップから針ホルダを使用して針を滅菌縫合糸と針を外します。離れて針ホルダから針の尖ったエッジに直面しています。非利き手で平滑末端の鉗子を保持し、グリップには、マウスの皮膚を、それを使用しています。利き手で始まります。 </li><li>優しく皮膚を通して縫合糸をプッシュして切開の反対側の皮膚をつかむために平滑末端の鉗子を使用しています。約0.75インチが残るまでを通して縫合材料を引き出します。 </li><li>針を放し、そして、その後、針ホルダの周りに1時間を縫合糸をラ​​ップ針ホルダーを0.75インチ残りの縫合糸をつかみ、そしてを通して縫合糸を引っ張るように平滑末端の鉗子を使用し、針と針ホルダーように彼らは元​​々にあったものにヘッドと反対の側に終わります。これは、結び目を形成すべきです。 </li><li>この手順を繰り返しますさらに3回、針ホルダは、各時間に終わるヘッドの側面を交互に。 </li><li>縫合糸をカットし、手順を繰り返し2.5.1-2.5.3切開が閉じられるまで。 </li></ol> 2.6）術後ケア<ol><li>静かにマウスの耳のバーを削除し、前方クランプからそのあごを削除します。 </li><li>それがウェイクアップし、独自に動き回るまで加熱パッド上でマウスを保管してください。毎日マウスを監視し、そのような、グルーミング食べたり飲んでいないような痛みの兆候、のために維持し、目。必要と認めたときに追加の鎮痛剤を与えます。 </li></ol> 3.オープンフィールドテスト 3.1）の設定<ol><li> 50センチメートル高い壁で、寸法50センチメートル×50 CMと空の角、プラスチックアリーナを得る（が、わずかに大きくすることができます）。実験の開始に先立って、70％のエチルアルコールでアリーナを清掃してください。エチルアルコールが完全に舞台上にマウスを置く前に乾燥していることを確認します。 </li><li>にアリーナを配置床、照明は影とグレアを最小限にするために設定されていることを確認してみてください。 </li><li>トラッキングソフトウェアを使用する場合は、（マウスの明確な見解を持つように十分離れて完全包含するように、全体の舞台が、十分に近い）、オープンフィールドの真上にオープンフィールドの上に約1.5フィートのカメラを置きます。 </li><li>ゾーンを設定するには16。ボックス（X 30センチメートル30cmの約領域）の中央にゾーンを設定し、サイドパネルのゾーン1]タブをクリックします。 <ol><li>上部パネルの形状のアウトラインを選択し、中央ゾーンの周囲を概説します。ゾーンの追加]を選択し、中央ゾーンの内側をクリックしてください。プログラムのプロンプトを使用して、（これは、この手順のための「中心」と呼ばれる）ゾーンに名前を付けます。行動試験を手で記録される場合は、フィールドの底部は、テープを使用して、マークされた10センチ×10cmの正方形に分割されていることを確認してください。 </li></ol></li><li>設定が正しい、とマウスが簡単にVISIになるようにソフトウェアを設定します画面にBLE。試験領域（照明）およびマウスの色に適合するように、マシン上の検出の設定を調整することによって、これを達成します。 注：設定が正しい場合、システムは、任意の影や尿/糞便をマウスだけを追跡し、しないでください。特定のソフトウェアの設定は、アリーナの照明、マウスの色に依存します。 </li></ol> 3.2）順化とテスト<ol><li>その周囲にそれらを順応させるために試験前行動部屋1時間に実験用マウスを移動します。順化のための彼らのケージにマウスを残します。 </li><li>行動タスクテープにカメラの電源を入れ、マウスが壁に直面しているように、舞台の中央前方に向かってマウスを置きます。 </li><li> 5分間のタイマーを設定し、競技場から離れます。可能な場合は、誤ってマウスに影響を与えないように、部屋を出ます。 </li><li> 5分がアップしたら、マウスを削除し、そのケージに配置します。 </li><li>徹底的に次のマウスに進む前に、フィールドを一掃するために70％のエチルアルコールを使用してください。エチルアルコールが完全に乾燥していることを確認します。 </li></ol> 3.3）得点<ol><li>すべての4つの足は、x 30センチメートル途中30センチメートル内にあるときに、フィールドの中央にあるように、マウスを検討してください。 </li><li>マウスを中心に費やす時間の量を定量化。あるいは、（例えば、Noldusのethovisonとして）追跡ソフトウェアを使用して、この時間を決定します。 <ol><li>これを行うには、分析]タブに移動し、分析·プロファイルの下に「動き」をクリックしてください。現在設定されているカテゴリを削除し、[場所]タブの下の「ゾーン内」を選択します。中央ゾーンを選択します。次に、結果を表示する（結果]タブの下の）「解析出力」を選択します。各試験のために不動に費やされる時間の一覧表が表示されます。 </li></ol></li><li>それ以外の場合は、手でOFTスコア。オープンフィールドは、OPEの底に概説25 10センチメートル×10センチの正方形を持っている必要がありますNフィールド（ステップ3.1.3に概説されるように）。アリーナの中心部へのエントリの数に加えて、マウスを中心に費やす時間の量を定量化する。16 注：センター30センチ×30センチメートルエリアはオープンフィールドの中心と考えられています。マウスは、すべての4つの足が30×30センチエリア内にあるかどうか中心領域に生息すると考えられています。 </li></ol> 4.強制水泳試験注：行動のタスク間の5日間の最小値を許可します。 4.1）の設定<ol><li> 2 L明確なバケツを取得し、22℃の水で満たします。テーブルの上にバケツを置き、照明は影とグレアを最小限にするために設定されていることを確認してみてください。 </li><li>トラッキングソフトウェアを使用する場合は、直接オーバーヘッドバケットのカメラを置きます。 </li><li>マウスが画面上で簡単に表示されるようにソフトウェアを設定します。 </li></ol> 4.2）順化とテスト<ol><li>行動ROに実験用マウスを移動します周囲を順応するためのテストの前にOM 1時間。順化のための彼らのケージにマウスを残します。 </li><li>テープへのカメラの行動タスクをオンにします。静かに、バケツの水の中央にマウスを置きます。でマウスを落とさないことを確認します。マウスをゆっくり下げ、そのフロント足が最初に水に触れるようにします。水没から自分の頭を防ぐために注意してください。 </li><li> 6分間のタイマーを設定し、行動の領域から離れます。 </li><li> 6分がアップしたら、バケツからマウスを削除し、そのケージに戻ってマウスを置く前に、余分な水分を拭き取ってください。 </li></ol> 4.3）得点<ol><li>トラッキングソフトウェアを使用する場合はNoldusによって示唆されるように、水泳対フローティング時間を定量化するために、（これはデフォルトの設定でなければならない）、11％パーセントの不動を設定します。 </li><li>トラッキングシステムを使用して定量化するために、分析]タブに移動し、分析·プロファイルの下で運動をクリックしてください。に、現在設定されているカテゴリを削除し、移動状態を選択（個人の行動の下で）左サイドパネル。 11％の不動を設定します。 </li><li> [結果]タブの下で、トラックの可視化を選択します。結果を表示する（結果]タブの下の）分析出力を選択します。各試験のために不動に費やされる時間の一覧表が表示されます。 </li><li>手の採点場合、マウスはマウスが不動に費やす時間の水泳や登山、と量を消費する時間を測定します。また、初めての不動のレイテンシを測定します。結果のセクションにある図2を参照してください。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

成功定位注射は三つの要因に依存している：、生きているマウスを維持する座標の正しいゼロ点（ブレグマの交点と耳間のライン上の針の先端）を設定し、ゼロ点に右の深さを設定する（針の先端をちょうど）脳組織の外側に触れます。マウスの生存率は重要です。手術の生存は、マウスが適切に麻酔し、適切な鎮痛を受けていることを確認することによって支援することができます。疼痛?...

それは、遺伝的に操作が容易であるため、マウスは広く神経生物学で使用されています。遺伝子ノックアウト技術は、研究者がそれぞれの遺伝的要因がマウスの行動を整形する方法を調査することができます。また、CRE-のloxPシステムは、異なる組織における遺伝子機能を研究する研究者を可能にする、マウスに特異的な遺伝子ノックアウトタイプ-組織および細胞のための貴重なツールを提供しています。1しかし、実際には、CREプロモーターの発現パターンを制御するのが困難です、これまでに多くの確立されたCREドライバは地域特異的発現を達成していない。2,3 あるいは、定位注射は、成体マウスの特定の脳領域を標的とする方法です。のcDNAまたはshRNAを発現する遺伝子操作されたウイルスを注入することにより、遺伝子発現の領域に特異的な変調を達成することができます。各マウスの脳の大きさは変化するが、特定の脳領域の位置は、定位COORDIを用いて決定することができます臀部は、マウス脳の頭蓋骨のランドマークから設定します。最も一般的に使用されるランドマークはブレグマ、ラムダ、および耳間のラインです。脳アトラスから得られた座標を使用して、各脳領域の4つの正確な位置は、前後（A / P）によって識別することができ、内側-外側（M / L）、および背腹（D / V）がから軸ブレグマ/耳のラインの交差点。典型的には、注射は、蛍光顕微鏡検査によって確認することができるように、赤色、または緑色蛍光タンパク質（RFP又はGFP）のいずれかでタグ付けされたマウスの脳に注入したウイルス。 マウスの行動評価は、精神疾患の基礎研究のために特に必要です。患者における精神障害の症状は、典型的には、異常行動を伴います。これらの人間の行動の一部は、進化的に保存され、直接マウスに模倣し、観察することができます。たとえば、うつ病の行動的絶望を測定することにより、マウスでモデル化することができます。 OFTうつ病を持つ人々彼らがこれまでに役立ちます何もしないかのようにアンは、最終的に自殺につながる可能性が症状を感じています。げっ歯類では、これは、水のプールに浮遊対水泳マウス（放棄とみなす）の時間を測定する、強制水泳試験（FST）を使用してモデル化することができます。このパラダイムは、抗うつ薬との表現型を救出することによって検証されている。抗うつを受けた7,8,9マウスは、未処理対照と比較して不動大幅に少ない時間を過ごすことになります。別の行動試験、オープンフィールド試験（OFT）は、マウスにおいて運動を評価するために設計されており、さらにマウスで気になる表現型を分析するために使用することができる。5,6-このテストは、それらが接近しているときに、マウスをより安全に感じることを前提としています新規オープンフィールド内の壁に。彼らは好奇心の強い動物であるように、野生型マウスは、最終的には、新しい環境を探索します。ただし、フィールドの中央に少ない時間を費やしては、マウスがイニシアを克服することができなくなりますように、マウスに不安を示していますLの恐怖が新しい環境によってもたらされます。マウスの不安は、オープンフィールドの中央で費やす時間の量により定量されるように、多くの精神障害に存在するヒトでの臨床不安、と比較することができます。 行動パラダイムと定位注射の組合せは、対象の脳の領域に特異的な遺伝子の発現を改変するための新規な方法です。マウスの行動に変調遺伝子発現の効果が決定され得ます。脳全体のノックアウトとは対照的に、この方法は、それが、特定の脳領域を標的として特に有用です。また、定位注射は、典型的には、成人、野生型マウスで行われ、従って、内因性遺伝子の発現は、発生段階を通じて維持されています。遺伝子は、開発の胚または出生後の段階での生存のために必要とされている場合、このメソッドは、交絡の影響を回避します。一つの主要な制限は、実験用マウスはthroug行く必要があるということですHマウスの頭蓋骨を持っている侵襲手術は、オープンされます。さらに、遺伝子変調度は、ウイルスの力価及び効率によって決定されます。ウイルスは、特別な機器を必要とする定位座標を使用して適切な領域に注入する必要があります。正しい注射部位の確認のみ死後に完成させることができます。 この方法は、以前に様々な神経疾患における特定の遺伝子の関与を試験するために使用されてきました。例えば、（ドーパミンを合成することを可能にする）Thの遺伝子を標的ウイルス媒介性RNAiは、黒質緻密部に注入し、そして運動行動分析を行った。10別の研究では、関連して、マウスの挙動を評価するために、レンチウイルス、サイレンシングDISC1の定位注射を使用しました統合失調症に。 DISC1のノックダウンは、新規性に応じて増加した運動につながった（類似統合失調症における陽性症状）、およびより大きな不動FST 11は、同様に、追加の研究は、5-HT 1Bの過剰発現は、OFTに増加した探索行動に、この方法を用いて、抗不安表現型と一致つながったことがわかった。12定位注射はCRE-loxP配列マウスで組換えを誘導するためにCREウイルスを提供することができます。この方法は、選択的扁桃体におけるY2受容体と分界条床核を削除するために使用されました。行動分析の際に、これらのマウスは、遺伝子は、中央扁桃体に削除された抗うつ表現型に見つけましたが、された遺伝子が基底外側扁桃体や分界条床核に削除された表現型がない。13このように、この技術を動物行動の遺伝的影響を研究するためのユニークなツールを提供します。

<table><tbody><tr><td>Stereotactic Apparatus item 51725</td><td>Stoelting co.</td><td>51725</td><td></td></tr><tr><td>Quintessential stereotaxic pump&amp;nbsp;</td><td>Stoelting co.</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>Injection Styringe, 65 RN</td><td>Hamilton</td><td>7633-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>PEI&amp;nbsp;</td><td>Polysciences Inc.</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Blunt end forceps</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder&amp;nbsp;</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Ram Products Inc</td><td>Microtorque control box, Tech2000 handpiece</td><td>with pedal</td></tr><tr><td>Glass bead sterilizer</td><td>Inotech&amp;nbsp;</td><td>IS-400</td><td></td></tr><tr><td>Absorbable sutures&amp;nbsp;</td><td>Unify</td><td>M-K518r19</td><td>Absorbable, reverse cutting</td></tr><tr><td>Cotton swabs</td><td>VWR</td><td>89031-270</td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>Gaymar</td><td>T-pump TP-500 PN11184-000</td><td></td></tr><tr><td>Artificial tears</td><td>Rugby</td><td>NDC 0536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>Disposable syringe</td><td>BD Syringe</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Cloth</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gloves&amp;nbsp;</td><td>Ansell</td><td>Senseitouch #7823</td><td></td></tr><tr><td>Avertin or other anesthetic</td><td>see recipe citation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen or other analgesic</td><td>see veternarian&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tracking software</td><td>Noldus</td><td>Ethovision XT</td><td></td></tr><tr><td>Tracking Camera</td><td>Noldus</td><td>Media Recorder</td><td></td></tr></tbody></table>

applying stereotactic injection technique to study genetic effects on animal behaviors

定位注射は、マウスにおける標的脳領域に高力価のレンチウイルスを提供する有用な技術です。レンチウイルスは、脳組織への重大な損傷を与えることなく、比較的着目領域における遺伝子発現を過剰発現またはノックダウンすることができます。回復後、注射したマウスは、オープンフィールド試験（OFT）および強制水泳試験（FST）などの様々な行動タスクにテストすることができます。 OFTは、マウスは、新規オープンフィールドの中央に費やす時間の量を測定することにより、マウスにおける運動や気になる表現型を評価するために設計されています。もっと気になるのマウスは、対照と比較して、新規フィールドの中央で有意に少ない時間を過ごすことになります。 FSTは、水の入ったバケツの中に入れたときにマウスが不動費やす時間の量を定量することにより、抗うつ表現型を評価します。抗うつ表現型を有するマウスは、対照動物と比較し有意に少ない時間不動を過ごすことになります。このプロトコルの目的は、STERを使用することです遺伝的要因は、動物の行動を調節する方法を評価する行動試験と一緒にレンチウイルスのeotactic注入。

<html>正確な定位注射は正しい座標を設定に大きく依存しています。ウイルスを注入するために使用される針の先端はブレグマの交点と耳線（ 図1）上で直接設定する必要があります。これは、針が正しく配置されているか否かを確認するために立体顕微鏡を使用すると便利です。顕微鏡で見ると、ウイルスが注入された場合、それはブレグマの交点と耳ラインで直接着陸なるよう...

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Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

cDNAを発現するレンチウイルスまたはshRNAの定位注射は、マウスの特定の脳領域における遺伝子発現を調節することができます。ここでは、そのようなオープンフィールド試験（OFT）および強制水泳試験（FST）のような行動のタスク、と定位注射を結合するためのプロトコルを提示します。

定位注入法を適用すると、動物の行動の遺伝的影響を研究するために、

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or ...

applying-stereotactic-injection-technique-to-study-genetic-effects-on

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Behavior

14.1K ビュー.  The Pennsylvania State University.  cDNAを発現するレンチウイルスまたはshRNAの定位注射は、マウスの特定の脳領域における遺伝子発現を調節することができます。ここでは、そのようなオープンフィールド試験（OFT）および強制水泳試験（FST）のような行動のタスク、と定位注射を結合するためのプロトコルを提示します。 

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Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an entire gene expression pathway by inducing destruction and/or inhibiting translation of these targets. Several miRNAs play key roles in maintaining neuronal structure and function and in higher-level brain functions, and methods are sought for manipulating their levels for exploring these functions. Here, we present a direct in vivo method for examining the cognitive consequences of enforced miRNAs excess in mice by stereotactic injection of miRNA-encoding virus particles. Specifically, the current protocol involves injection into the hippocampal CA1 region, which contributes to mammalian memory consolidation, learning, and stress responses, and offers a convenient injection site. The coordinates are measured according to the mouse bregma and virus perfusion is digitally controlled and kept very slow. After injection, the surgery wound is sealed and the animals recover. Lentiviruses encoding silencers of the corresponding mRNA targets serve to implicate the specific miRNA/target interaction responsible for the observed effect, with na&iuml;ve mice, mice injected with saline and mice injected with "empty" lentivirus vectors as controls. One month post-injection, the animals are examined in the Morris Water Maze (MWM) for assessing their navigation learning and memory abilities. The MWM is a round tank filled with colored water with a small platform submerged 1 cm below the water surface. Steady visual cues around the tank allow for spatial navigation (sound and the earth's magnetic field may also assist the animals in navigating). Video camera monitoring enables measuring the route of swim and the time to find and amount the platform. The mouse is first taught that mounting the hidden platform offers an escape from the enforced swimming; it is then tested for using this escape and finally, the platform is removed and probe tests examine if the mouse remembers its previous location. Repeated tests over several consecutive days highlight improved performance of tested mice at shorter latencies to find and mount the platform, and as more direct routes to reach the platform or its location. Failure to show such improvement represents impaired learning and memory and/or anxiety, which may then be tested specifically (e.g. in the elevated plus maze). This approach enables validation of specific miRNAs and target transcripts in the studied cognitive and/or stress-related processes.

MicroRNAs have significant roles in brain structure and function. Here we describe a method to enforce hippocampal miRNA over-expression using stereotactic injection of an engineered miRNA-expressing lentivirus. This approach can serve as a relatively rapid way to assess the in vivo effects of over-expressed miRNAs in specific brain regions.

の定位注入マイクロRNA発現マウス海馬CA1領域にレンチウイルスと行動アウトカムの評価

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

行動学

Stereotaxic Microinjection of Viral Vectors Expressing Cre Recombinase to Study the Role of Target Genes in Cocaine Conditioned Place Preference

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes of interest allows for enhanced temporally- and regionally-specific control of gene deletion, compared to existing methods. While conditional deletion can also be achieved by mating mice that express Cre recombinase under the control of specific gene promoters with mice carrying a floxed gene, stereotaxic microinjection allows for targeting of discrete brain areas at experimenter-determined time points of interest. In the context of cocaine conditioned place preference, and other cocaine behavioral paradigms such as self-administration or psychomotor sensitization that can involve withdrawal, extinction and/or reinstatement phases, this technique is particularly useful in exploring the unique contribution of target genes to these distinct phases of behavioral models of cocaine-induced plasticity. Specifically, this technique allows for selective ablation of target genes during discrete phases of a behavior to test their contribution to the behavior across time. Ultimately, this understanding allows for more targeted therapeutics that are best able to address the most potent risk factors that present themselves during each phase of addictive behavior.

This article describes how to microinject viral vectors into mouse brain and then test in a conditioned place preference paradigm that includes an acquisition, extinction and reinstatement phase.

コカイン条件付け場所嗜好における標的遺伝子の役割を研究するためにCreリコンビナーゼを発現するウイルスベクターの定位マイクロインジェクション

Microinjecting recombinant adenoassociated viral (rAAV) vectors expressing Cre recombinase into distinct mouse brain regions to selectively knockout genes ...

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as appropriate models, partly because the response to behaviorally relevant stimuli and the circuitry parsing stimulus-action outcomes is astonishingly similar between humans and rodents. In studying molecular substrates of complex behaviors, the microinjection of reagents that modify, augment, or silence specific systems is an invaluable technique. However, it is crucial that the microinjection site is precisely targeted in order to aid interpretation of the results. We present a method for the manufacture of surgical implements and microinjection needles that enables accurate microinjection and unlimited customizability with minimal cost. Importantly, this technique can be successfully completed in awake rodents if conducted in conjunction with other JoVE articles that covered requisite surgical procedures. Additionally, there are many behavioral paradigms that are well suited for measuring motivation. The progressive ratio is a commonly used method that quantifies the efficacy of a reinforcer to maintain responding despite an (often exponentially) increasing work requirement. This assay is sensitive to reinforcer magnitude and pharmacological manipulations, which allows reinforcing efficacy and/ or motivation to be determined. We also present a straightforward approach to program operant software to accommodate a progressive ratio reinforcement schedule.

Rodents are an appropriate model to investigate the molecular substrates of behavior and complex psychiatric disorders. Brain microinjection in awake rodents can be used to elucidate disease substrates. An efficient and customizable brain microinjection method as well as the execution of an operant paradigm that quantifies motivation is presented.

動機付け行動の分子基質を研究するために齧歯類の脳マイクロインジェクション

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are particularly devastating, difficult to treat, and confer a poor prognosis. While the precise incidence of brain metastases in the United States remains hard to estimate, it is likely to increase as extracranial therapies continue to become more efficacious in treating cancer. Thus, it is necessary to identify and develop novel therapeutic approaches to treat metastasis at this site. To this end, intracranial injection of cancer cells has become a well-established method in which to model brain metastasis. Previously, the inability to directly measure tumor growth has been a technical hindrance to this model; however, increasing availability and quality of small animal imaging modalities, such as magnetic resonance imaging (MRI), are vastly improving the ability to monitor tumor growth over time and infer changes within the brain during the experimental period. Herein, intracranial injection of murine mammary tumor cells into immunocompetent mice followed by MRI is demonstrated. The presented injection approach utilizes isoflurane anesthesia and a stereotactic setup with a digitally controlled, automated drill and needle injection to enhance precision, and reduce technical error. MRI is measured over time using a 9.4 Tesla instrument in The Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Tumor volume measurements are demonstrated at each time point through use of ImageJ. Overall, this intracranial injection approach allows for precise injection, day-to-day monitoring, and accurate tumor volume measurements, which combined greatly enhance the utility of this model system to test novel hypotheses on the drivers of brain metastases.

Intracranial brain metastasis modeling is complicated by an inability to monitor tumor size and response to treatment with precise and timely methods. The presented methodology couples intracranial tumor injection with magnetic resonance imaging analysis, which when combined, cultivates precise and consistent injections, enhanced animal monitoring, and accurate tumor volume measurements.

頭蓋内注射と磁気共鳴画像による脳転移のモデル化

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

がん研究

Establishment of Orthotopic Patient-derived Xenograft Models for Brain Tumors using a Stereotaxic Device

The development of clinically relevant and reliable models for central nervous system (CNS) tumors has been pivotal in advancing the field of neuro-oncology. One of the most widely used techniques is the orthotopic intracranial injection, a method that allows investigating of tumor growth, invasion, and dissemination within a controlled setting. This technique involves transplanting tumor cells from a specific patient region into the corresponding anatomical site in an animal. By doing so, these orthotopic brain tumor models offer a unique advantage, as they more accurately replicate cancer's biological behavior and its interactions with the brain environment seen in human patients. This makes them especially valuable for preclinical therapeutic testing, where a close resemblance to the clinical scenario is essential for evaluating potential treatments. This protocol shares experiences in developing patient-derived xenograft (PDX) models for pediatric brain tumors, including diffuse midline glioma (DMG), glioblastoma (GBM), medulloblastoma, and ependymoma. This method delineates the procedure for conducting intracranial stereotaxic injections in mice, ensuring the correct targeting of the injection site within the brain. Additionally, we describe the post-procedural monitoring system employed to detect signs of successful tumor engraftment. Following tumor injection, a rigorous monitoring system is implemented to observe the animals for any signs of neurological impairment, behavioral changes, and/or weight loss, which are common indicators of tumor progression. This system allows for timely intervention and provides critical data regarding the tumor's growth dynamics. By refining these models and protocols, we aim to enhance the reliability and translational potential of preclinical studies, contributing to the development of more effective treatments for pediatric CNS tumors.

The development of orthotopic pediatric brain tumor models requires meticulous precision, using a stereotaxic device to implant cancer cells precisely. The methodology presented here outlines the steps involved in preparing brain tumor cells, performing intracranial injections, and implementing a post-operative monitoring system to assess brain tumor engraftment.

The development of clinically relevant and reliable models for central nervous system (CNS) tumors has been pivotal in advancing the field of ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

新生児マウス脳の線条体細胞の遺伝的操作の定位手術

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

神経科学

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

マウス脳スライスにおける長距離入力の光遺伝学的刺激のための生体内脳内立体注射

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain regions still presents a challenge, particularly when targeting brain structures along the midline. These challenges include avoiding of the superior sagittal sinus and third ventricle and the ability to consistently target selective and discrete brain nuclei. In addition, more advanced neuroscience techniques (e.g., optogenetics, fiber photometry, and two-photon imaging) rely on targeted implantation of significant hardware to the brain, and spatial limitations are a common hindrance. Presented here is a modifiable protocol for stereotactic targeting of rodent brain structures using an angled coronal approach. It can be adapted to 1) mouse or rat models, 2) various neuroscience techniques, and 3) multiple brain regions. As a representative example, it includes the calculation of stereotactic coordinates for targeting of the mouse hypothalamic ventromedial nucleus (VMN) for an optogenetic inhibition experiment. This procedure begins with the bilateral microinjection of an adeno-associated virus (AAV) encoding a light-sensitive chloride channel (SwiChR++) to a Cre-dependent mouse model, followed by the angled bilateral implantation of fiberoptic cannulae. Using this approach, findings show that activation of a subset of VMN neurons is required for intact glucose counterregulatory responses to insulin-induced hypoglycemia.

Described here is a stereotactic procedure that can target challenging and difficult-to-reach brain regions (due to spatial limitations) using an angled coronal approach. This protocol is adaptable to both mouse and rat models and can be applied to diverse neuroscientific applications, including cannula implantation and microinjections of viral constructs.

多目的神経科学技術のための適応可能な角度付き定位アプローチ

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain ...

Stereotaxic Intracranial Delivery of Chemicals, Proteins or Viral Vectors to Study Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is a progressive disorder traditionally defined by resting tremor and akinesia, primarily due to loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra. Affected brain areas display intraneuronal fibrillar inclusions consisting mainly of alpha-synuclein (asyn) proteins. No animal model thus far has recapitulated all characteristics of this disease. Here, we describe the use of stereotaxic injection to deliver chemicals, proteins, or viral vectors intracranially in order to mimic various aspects of PD. These methods are well-established and widely used throughout the PD field. Stereotaxic injections are incredibly flexible; they can be adjusted in concentration, age of animal used for injection, brain area targeted and in animal species used. Combinations of substances allow for rapid variations to assess treatments or alter severity of the pathology or behavioral deficits. By injecting toxins into the brain, we can mimic inflammation and/or a severe loss of dopaminergic neurons resulting in substantial motor phenotypes. Viral vectors can be used to transduce cells to mimic genetic or mechanistic aspects. Preformed fibrillar asyn injections best recapitulate the progressive phenotype over an extended period of time. Once these methods are established, it can be economical to generate a new model compared to creating a new transgenic line. However, this method is labor intensive as it requires 30 minutes to four hours per animal depending on the model used. Each animal will have a slightly different targeting and therefore create a diverse cohort which on one hand can be challenging to interpret results from; on the other hand, help mimic a more realistic diversity found in patients. Mistargeted animals can be identified using behavioral or imaging readouts, or only after being sacrificed leading to smallercohort size after the study has already been concluded. Overall, this method is a rudimentary but effective way to assess a diverse set of PD aspects.

We describe how to successfully inject solutions into specific brain areas of rodents using a stereotaxic frame. This survival surgery is a well-established method used to mimic various aspects of Parkinson's disease.

Parkinson's disease (PD) is a progressive disorder traditionally defined by resting tremor and akinesia, primarily due to loss of dopaminergic neurons in ...

マウスにおける脳定位固定装置マイクロインジェクションの精度の最適化

Preliminary Validation of Stereotaxic Injection Coordinates via Cryosectioning

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their choice of stereotaxic injection parameters on mouse brain atlases or published materials that employed various populations/ages of mice and different stereotaxic equipment, necessitating further validation of the stereotaxic coordinate parameters. The efficacy of calcium imaging, chemogenetic, and optogenetic manipulations relies on the precise expression of reporter genes within the region of interest, often requiring several weeks of effort. Thus, it is a time-consuming task if the coordinates of the target brain region are not verified in advance. Using an appropriate dye instead of a virus and implementing cryosectioning, researchers can observe the injection site immediately following dye administration. This facilitates timely adjustments to coordinate parameters in cases where discrepancies exist between the actual injection site and the theoretical position. Such adjustments significantly enhance the accuracy of viral expression within the target region in subsequent experiments.

著者スポットライト:定位固定剤注射と費用対効果の高い色素によるマウスの認知障害研究の加速

The present protocol describes a practical strategy to expedite the verification step of stereotaxic injection coordinates before conducting viral tracing using dyes and frozen sections.

クライオセクショニングによる脳定位固定装置注射座標の予備検証

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their ...