We gratefully acknowledge Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands) for the kind gift of TOPflash cells.
This project was supported in part by NIH-R01DK083325 (MAH); NIH P30 DK078392 (Digestive Health Center); NIH UL1RR026314 (CTSA).

注：倫理に関する声明：CCHMCでIRBで承認された明細書に記載のヒト組織を使用するすべての実験（IRB＃2012から2858;＃2014から0427）。組織収集、保存、および試料の使用のためのインフォームドコンセントをCCHMCでドナーから得た。 文化1.準備注：すべての試薬 ​​は、 表1に記載されている。 <ol><li>次のようにEDTAストック溶液を準備します。0.5 Mエチレンジアミン四酢酸、純H 2 O、0.22μmのフィルターで滅菌フィルター内のpH 8（EDTA）を調製。必要に応じて、無期限にRTでEDTA原液を保存する。 </li><li>次のようなキレート緩衝液を調製する：2％ソルビトール、1％スクロース、1％ウシ血清アルブミン画分V（BSA）及びダルベッコのリン酸中で1×ゲンタマイシン/アンホテリシン溶液は、Ca 2+およびMgなし緩衝食塩水2+（DPBS）、濾過滅菌を混ぜる0.22μmのフィルター付き。キレートBUFを準備新鮮なFER。 </li><li>のWnt-3A-馴化培地は、製造業者の指示（ATCC、CRL-2647）に記載の細胞ラインLのWnt-3Aを使って家の中で行われ、以下のようなWnt-3A-馴化培地を準備します。 0.22μmのフィルターで滅菌2mMグルタミン、10mMのHEPES、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、1 N2サプリメント、1 B27サプリメント、1％BSA及びフィルタを有する培地を補足する。 注：テストTOPFLASHアッセイを用いてWnt活性のために、すべてのバッチ。製造元の指示に従ってウミシイタケのルシフェラーゼアッセイキットで安定したHEK293 TOPFLASH細胞株（ハンスCleversラボ）を使用します。 100ng / mlのヒト組換えのWnt-3AにTOPFLASHアッセイを標準化する。対照と比較して調整培地の少なくとも10倍チェンジ活性を確認する。 15ミリリットルで10ミリリットルのアリコートに新鮮なWnt-3A-馴化培地コニカルチューブを分割し、最大6ヶ月間-20℃で凍結する。ストアは、活性を失うことなく4℃で5日間にアリコートを解凍した。 </li><li> PRepareヒトminigut媒体を次のように0.22で滅菌2mMグルタミン、10mMのHEPES、100 U / mLペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、1 N2サプリメント、1 B27サプリメント、1％BSA及びフィルタと補足アドバンストDMEM / F12培地μmのフィルター。 注：15ミリリットルで10ミリリットルのアリコートコニカルチューブに新鮮なヒトminigut媒体を分割し、最大3ヶ月間-20℃で凍結する。ストアは、活性を失うことなく4℃で5日間にアリコートを解凍した。 </li><li>次のように完全な人間minigut媒体を準備します陰窩文化または50％のWnt-3A-馴化培地（1.3を参照）を、1μg/ mlののRスポンジン1（1を添加した培地変更人間minigut培地（1.4を参照）の前に、新鮮な準備：1,000 1 mg / mlの株式の希釈）、100ng / mlのノギン（1：100グラム/ mLの株式1,000希釈）、50 ng / mLでのEGF（1：500μg/ mlのストックを10,000希釈）、500 nMのA-83 -01（1：500 M株式1,000希釈）、10μMのSB202190（1：30 mMストックの3000希釈）、10 nMの[レイ] 15-ガストリン1（1：100μMの10,000希釈株式）、10 mMのニコチンアミド（1：1、M株式100希釈）と1 mMのN-アセチルシステイン（1：1、M株式1,000希釈）。 注：活性の損失なしに4℃で2日間まで保管完全なヒトminigut媒体。 </li></ol>全組織から2.墓所の単離注：組織採取から、生理食塩水でサンプルを維持するために不可欠である。これは、輸送中の氷の上に組織を維持することをお勧めします。陰窩の単離のための試料の調製は、可能な限り早く行われるべきである。 注：すべての試薬 ​​は、 表1、工具、機器に表示され、消耗品を表2に記載されています。 <ol><li>実験を開始する前に、すべての試薬を準備します。 37℃のCO 2インキュベーター中で氷上で基底膜マトリックスとプレインキュベートし、24ウェルプレートを解凍する。 注：または15μL/ウェル24の中心にを使用して、基底膜マトリックスの薄い層を作る型ウェルプレートを37℃のCO 2インキュベーター内に置かれる。この通性ステップは、重合中に、ドロップなどの基底膜マトリックスを保持します。 </li><li>氷のように冷たいダルベッコのリン酸を用いて組織を洗浄は、Ca 2+およびMg 2+（DPBS）なしで緩衝生理食塩水。 DPBSの内容がクリアされるまで進みます。 </li><li>直径0.2mm minutienピンを使用して、氷冷DPBSで満たされたシリコーンコーティングされたガラスシャーレに組織を固定する。ストレッチと粘膜面を上にし、フラットな組織をピン。 </li><li>解剖顕微鏡下では、マイクロ解剖ハサミと細かい点に湾曲鉗子（ 図2A、B）を使用して、粘膜下層および結合組織から覆っている粘膜を除去します。 </li><li>ストレッチや粘膜面を上にし、シリコーンコーティングされたガラスシャーレ上解剖粘膜フラットピン。残りの粘膜下結合組織は廃棄されるか、またはさらなる実験（ 図2C）のために使用することができる。 </li><li>優しく湾曲した鉗子で粘膜の表面をこすり。このステップは、調製物の品質を向上させる必要がある。 <ol><li>小腸のために、優しく絨毛を除去するための粘膜をこすり。 </li><li>コロンのために、静かに粘液と破片を除去するための粘膜をこすり。 </li></ol></li><li>絨毛および破片を除去するために、氷冷キレート化緩衝液で粘膜3-4回洗浄する。 </li><li>新たに調製した2mMのEDTAキレート化バッファー（49.6ミリリットルキレート化バッファーで200μlの0.5 M EDTA）で粘膜をカバーしています。 </li><li>氷上のペトリ皿を置き、水平オービタルシェーカー上で30分間静かに振る。 </li><li> EDTAを含まない氷冷キレート化緩衝液で組織を3〜4回​​洗浄する。洗浄後、氷冷キレート化バッファ内の粘膜を残す。 </li><li>湾曲したと細かい鉗子を使用して、解剖顕微鏡下で粘膜を処理します。緩やかに湾曲鉗子を使用して腸の陰窩を解放するために粘膜をこすり。 </li><li>静かにパイを使用してペトリ皿から陰窩サスペンションを削除50ミリリットルコニカルチューブにそれをpetteと転送。 注：ほとんどすべての陰窩は粘膜から削除されていることを確認するために組織を確認してください。 </li><li> 2回メッシュを150μmを通じて陰窩サスペンションをフィルタリングします。 注：顕微鏡（ 図2D）の下で暗号濃縮のためのフロースルーをチェック。 </li><li>遠心分離機50×gで、4℃で陰窩懸濁液を5分間。上清を捨てる。 </li><li> 5mlの氷冷キレート緩衝液にペレットを再懸濁する。 </li><li>ステップ2.15からの懸濁液から10μlの滴当たり陰窩の数をカウントします。 5ミリリットル丸底チューブにメッキのために必要な陰窩の数を転送します。 enteroidsまたはcolonoidsを確立するために、24ウェル皿のウェルあたり200〜500陰窩を使用してください。 </li><li>遠心分離機150グラム、4℃で10分間、陰窩分。上清を取り除きます。 </li><li>その後の培養のための陰窩を使用してください。 </li></ol>生検から3.墓所の単離<ol><li>前に、すべての試薬を準備実験開始。 37℃のCO 2インキュベーター中で氷上で基底膜マトリックスとプレインキュベートし、24ウェルプレートを解凍する。 </li><li>で生検を洗って、氷冷ダルベッコのリン酸は、Ca 2+およびMg 2+（DPBS）なしで緩衝生理食塩水。 </li><li>直径0.1mm minutienピンを使用して、氷冷DPBSで満たされたシリコーン被覆ガラスシャーレ上で生検を確保する。ストレッチや粘膜側が（ 図2E）を上に向けて平らな粘膜をピン。 </li><li>穏やか絨毛および破片を除去するために、湾曲鉗子で粘膜の表面を削り取る。このステップは、調製物の品質を向上させる必要がある。 </li><li>絨毛および破片を除去するために、氷冷キレート化バッファーで生検3-4回洗浄する。 </li><li>新たに調製した2mMのEDTAキレート化バッファー（49.8ミリリットルキレート化バッファーで200μlの0.5 M EDTA）で生検をカバーしています。 </li><li>氷上のペトリ皿を置き、水平オービタルシェーカー上で30分間静かに振る。 </li> &lt;李は&gt; EDTAを含まない氷冷キレート化バッファーで生検3-4回洗浄する。洗浄後、氷冷キレート化バッファ内の生検を残す。 </li><li>湾曲したと細かい鉗子を使用して、解剖顕微鏡下で生検を処理します。緩やかに湾曲鉗子を使用して腸の陰窩を解放するために粘膜をこすり。 </li><li>静かにピペットを用いてペトリ皿から陰窩サスペンションを削除し、50ミリリットルコニカルチューブに移す。 注：ほとんどすべての陰窩は粘膜から削除されていることを確認するために組織を確認してください。 </li><li> 2回メッシュ150μmのナイロンを通じて陰窩サスペンションをフィルタリングします。 注：顕微鏡下陰窩濃縮のためにフロースルーをチェック。 </li><li>遠心分離機50×gで、4℃で陰窩懸濁液を5分間。上清を捨てる。 </li><li> 1ミリリットルの氷冷キレート化バッファーにペレットを再懸濁。 1.5mlマイクロチューブに陰窩サスペンションを転送します。 </li><li>遠心分離機150×gで、4℃で10分間、陰窩分。上清を取り除きます。&lt;/ LI&gt; <li>その後の培養のための陰窩を使用してください。 </li></ol>基底膜マトリックス4.墓所文化<ol><li>あらかじめ冷却ピペットチップを使用して、基底膜マトリックス（200〜500陰窩/ 50μlの基底膜マトリックス）で（ステップ2.18または3.15から）陰窩ペレットを再懸濁。 </li><li>予め温めておいたプレートにウェル当たり基底膜マトリックスに陰窩懸濁液50μlを適用します。ゆっくりとウェルの中央に基底膜マトリックスを取り出す。 </li><li> 30分の基底膜マトリックスの完全な重合を可能にするために、37℃、5％CO 2インキュベーター中で24ウェルプレートを置き。 </li><li> 2.5μMCHIR99021を補足した完全なヒトminigut培地500μlの基底膜マトリックスをオーバーレイ（1：4000希釈10 mMストックの）と2.5μMThiazovivin（1：4000希釈10 mMストックの）。 </li><li> 37℃、5％CO 2インキュベーター中でプレートをインキュベートする。 </li><li>新鮮な完全フーマーを有する媒体を交換してくださいnは2日ごとに培地をminigut。 </li></ol>培養EnteroidsとColonoidsの5継代。 注：すべての7から10日最初のプレーティング後にパッセージEnteroidsとColonoids。一般的に、3から4ウェルにも1を分割します。 <ol><li>実験の開始前に、すべての試薬を準備します。 37℃のCO 2インキュベーター中で氷上で基底膜マトリックスとプレインキュベートし、24ウェルプレートを解凍する。 </li><li>氷冷DPBS 1mlの滅菌チップとオーバーレイを使用してメディアを取り出します。 </li><li> 1,000μlのチップで前後にピペット。新しい15ミリリットルコニカルチューブ内の溶液を移す。 </li><li>培地1mlあたり5％FBSを添加した人間minigut培地2mlを追加します。 </li><li>遠心分離機50×gで、4℃で5分間この溶液。上清を捨てる。 </li><li> （：10 mMストックの千希釈1）10μMのY-27632を補足した細胞解離酵素の2ミリリットルでペレットを再懸濁。 5メートルインキュベート水浴中で37℃である。 </li><li> 18-Gの充填/ブラント針を装備した3ミリリットルルアーロック注射器を用いて細胞塊を解離する。穏やかに注射を10回使用して前後に溶液をピペット。 </li><li>遠心機500×gで、4℃で5分間のサスペンション。上清を捨てる。 </li><li>あらかじめ冷却ピペットチップを使用して、基底膜マトリックスに細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>予め温めておいたプレートにウェル当たり基底膜マトリックスに陰窩懸濁液50μlを適用します。ゆっくりとウェルの中央に基底膜マトリックスを取り出す。 </li><li> 20分の基底膜マトリックスの完全な重合を可能にするために、37℃、5％CO 2インキュベーター中で24ウェルプレートを置く。 </li><li> 10μMのY-27632（：10 mMストックの千希釈1）を補充した完全なヒトminigut培地500μlの基底膜マトリックスをオーバーレイ。 </li><li> 37℃、5％CO 2インキュベーター中でプレートをインキュベートする。 </li><li> 2日後（：10 mMストックの千希釈1）、10μMのY-27632を補足した新鮮な完全なヒトminigut培地で培地を交換してください。その後、一日おきに新鮮な、完全な人間minigut培地で培地を交換してください。 </li></ol>培養EnteroidsとColonoids 6.凍結注：通常2-3クリオバイアルに1をよくフリーズ。 <ol><li>繰り返しますが5.1から5.8のステップ。 </li><li>冷たい凍結培地でペレットを再懸濁。転送ラベルクライオバイアルに溶液を凍結1ミリリットル。イソプロピルアルコール500ミリリットルを含む冷凍コンテナにクライオバイアルを置きます。 </li><li>その後、液体窒素貯蔵にクリオバイアルを転送、24時間、80℃のフリーザーに冷凍コンテナを転送する。 注：最大1年間のための店EnteroidsとColonoids。 </li></ol>

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K., Sasselli, V., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+gene+expression+control+in+primary+organoid+cultures.">Retroviral gene expression control in primary organoid cultures.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 27 (Unit 5A), 6 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

この方法は、腸上皮生物学を研究するための便利なツールを構成している腸管上皮系統および上皮ダイナミクスを再現する完全なシステムを提供しています。ここに提示された方法を効率的に人間enteroidsとcolonoidsになり、佐藤とClevers 22によって元のマウス研究から適応されました。ここでは、手動で任意の細胞の汚染物質を避けるために、顕微解剖によって陰窩を拾いました。この方法は、陰窩の直接可視化を可能にし、「振る」ことにより、元の暗号コレクションに比べて一貫性の残業につながる。他のグループは、特にコラゲナーゼ25とEDTAによるキレート化を置き換えるわずかに異なるアプローチを使用して、同様のテクニクスを開発しました。暗号コレクションの違いのほかに、それらのテクニクスは文化22で人間enteroidsを成長するために必要な定義されたメディアを使用。陰窩播種で成長効率を高めるために、GSK3インヒビター（CHIR99021）を追加最初の2日間12。 組織または生検の取り扱いが重要であり、暗号の分離とすぐ組織が実験室に到着したように実行する必要があります。しかし、遅延陰窩の単離および培養は、組織採取後24時間まで実施することができる以前に、マウス組織26について記載した（データは示さず）。腸組織を完全に組織破壊を回避するためにDPBSで満たし、4℃で維持されるべきである円錐管に配置する必要があります。遅延準備は、組織出荷が可能になりますが、温度変化は、輸送中に避けるべきである。初期陰窩めっきに必要な全体的な時間は、陰窩を分離し、めっきする組織と、1〜2時間後に処理するために15〜30分間で約2時間である。組織の顕微解剖は、きれいな地下室の準備の重要な決定要因と述語です。しかし、ハンドシェイクによって陰窩リリース様々なプロトコルに記載されるようにすることが可能である22,23。 ネズミenteroid（enteroids）システムと類似しているにもかかわらず、人間enteroidsは時間をかけて彼らの成長を促進し、維持するために特定の分子を必要とする。成長因子は、EGF、ノギン、Rスポンジン、マウス上皮オルガノイドと同様に使用される。しかし、のWnt-3Aの使用が不可欠である。我々は、形成ならびに成長効率は、ヒト組換えタンパク質よりはWnt-3A条件培地を使用して大きいことを指摘した。同時に、我々は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3（CHIR99021）12の阻害剤を使用して改良された培養条件を示した。組み換え成長因子は、Wnt-3A、Rスポンジン、及びノギン馴化メディアで置き換えることができる。のWnt-3Aを発現するL細胞株は（ATCC）は、市販されている。他のグループはNoggin- 19、およびWnt-3A / R-spondin3 / Noggin- 28発現細胞株、Rスポンジン1- 23,27を開発した。二つの小分子阻害剤は、培養に使用されている私DIAとは、文化29の維持のために必要である。 - 83から01の成長因子βおよびアクチビン/ノーダル受容体を形質転換の選択的阻害剤である（アクチビン様キナーゼ4、5、7）及びSB202190は、p38マイトジェン活性化プロテインキナーゼ阻害剤（MAPK）である。両阻害剤は、ヒト人工多能性幹細胞の自己再生を維持し、30-32、ヒトナイーブな多能性幹細胞を確立するためにそれぞれ使用されてきた。また、ニコチンアミド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの前駆体は、長期的22,29にenteroidsとcolonoidsの拡張を維持するために必要とされる。 それは地下室の準備からの収量を決定としてEDTAのキレート化は重要なステップです。私たちは、2 mMのEDTA処理に成功している。しかし、EDTAの濃度は、組織の種類に関して15 mMまでの2mMから変更することができる。その場合には、インキュベーション時間は、実験的に決定されなければならない。初期めっき後、cryptはラウンドuとなりますpと、最終的にはenteroidsを形成する。しかし、enteroidsまたはcolonoidsは、多くの場合、無分化した細胞にはほとんどして球体を形成することにより、「ステム」表現型を示す。その場合には、分化は、Wnt-3A、ニコチンアミドおよびp38 MAPK阻害剤を回収することによって開始することができる。そのようなDAPTまたはDBZなどのNotch阻害剤の使用はenteroids 22内分化を強化するのに役立ちます。 このモデルは、吸収性および分泌分化系統の両方を含む幹細胞区画から生じる継続的な陰出芽イベントならびに絨毛様上皮ドメインを有する腸生理を再現する。興味深いことに、このシステムは、任意の間葉細胞を含有し、ニッチ信号要件を満たすために特定のメディア条件を使用していない。 マウスモデルと同様に、人間enteroidsは、幹細胞として機能するそれらの細胞の能力をテストするために、単離された腸上皮細胞から生成することができる。セベRALの研究は、幹のプロパティ12,23,33を用いて細胞を濃縮する分化マーカー（CD44、CD24またはCD166）とEPHB2陽性細胞のクラスターを使用してきた。一緒に、これらの研究は、幹細胞性を試験するため、ヒトenteroids培養物の有用性を実証する。他の研究者は、感染下痢性疾患、嚢胞性線維症、または結腸直腸癌22,34-37腸疾患を調査するためにこのモデルを使用している。これらの研究は、人間enteroidsパーソナライズスクリーニングに向かって移動する可能性と信頼性の高いヒト疾患モデルを構成していることを示している。人間enteroidsは、遺伝的にウイルス粒子38とDNAトランスフェクションまたは感染を使用して変更することができます。これはヒト上皮オルガノイドまたは正しい遺伝子突然変異内の遺伝子固有の機能を研究するための強力なツールを提供します。最近では、Schwankらは、CRISPR / Cas9システムとゲノムを編集して、交流を引き起こしCFTR遺伝子に突然変異を修正する可能性を実証したystic線維症24。人間enteroidsは腸管幹細胞および上皮粘膜生物学を研究し、正常と異常の両方胃腸生理学を研究するための新たな実験系として機能するように貴重なシステムを構成している。

消化管のライニング上皮は一定のリニューアルです。このプロセスは、連続的に裏返すように迅速に腸上皮を交換する子孫を産生腸管幹細胞（のISC）の増殖によって引き起こされる。のISCを含む増殖性コンパートメントは陰窩の下部に限定される。のISCは、最終的に吸収または分泌系統に分化子孫を生じさせる。彼らはルーメン1に剥離する前に上向きに移動するように地下室を出て、絨毛または表面上皮上に移動すると、細胞が徐々に分化する。のISCは、腸細胞、microfold細胞、腸細胞、杯細胞、房細胞およびパネート細胞を含むすべての腸管上皮細胞タイプを生じさせる。コロンは、散乱腸と房細胞2で、結腸および杯細胞から主に構成された細長い陰窩ことを特徴としている。 エクスビボ CULトゥーレ·システムは、ISCのメンテナンスと腸組織の恒常性を研究するための有望なツールを構成している。生理学的な条件を完全に再生し、上皮の微小環境は、多くの場合、3,4変更されないようにしかし、それは組織培養技術に頼ることは困難である。 ISCの分野における主要な進歩は、正常な腸のニッチ信号を置き換えるために定義された成長因子を使用して、個々のマウスのISCを維持し、拡大した組織培養技術を確立した。長期培養条件は佐藤らによって記載され、その単一陰窩または腸上皮から単離された幹細胞は、複数の陰様ドメイン5-7を含む3次元の上皮構造を形成するために成長する。これらの三次元構造は、連続的に拡大する分裂事象を受ける。興味深いことに、起源の組織に固有のすべての腸の細胞型が生成され、同様に内腔8内に押し出される。このシステムの改変を用いて、上皮オルガノイドは、胃、小腸および大腸から生成することができる。具体的には、小腸からの上皮オルガノイドはenteroids 9であり、コロンからのものがcolonoids 9,10です。これらの上皮オルガノイド培養系は、このように単離された細胞5,6,10-15の「幹細胞性」を試験するインビトロで幹細胞として機能する単離された単一細胞の能力を試験するために使用されてきた。他の研究者は、個々の上皮細胞16〜21の機能を研究するenteroidsとcolonoids両方を使用している。したがって、enteroidとcolonoid培養は、幹細胞および非幹細胞の両方の機能を評価し、腸内の基本的な細胞間相互作用に新たな洞察を与えるために使用することができる。 2011年には、佐藤らは、人間の小腸および結腸22,23から派生した上皮オルガノイドの長期培養を生成した。培地組成の違い、ヒト上皮enteroidsに加えとcolonoidsは彼らのネズミの対応と同じ特徴を示す。さらに、それらは、バレット食道、腺腫または腺癌、および嚢胞性線維22,24として病変組織から生成することができる。人間enteroidsは腸管幹細胞および上皮粘膜生物学を研究し、正常と異常の両方胃腸生理学3を研究するための新たな実験系として機能するように貴重なシステムを構成している。 ここでは、人間の小腸および結腸陰窩（ 図1）からenteroidsとcolonoidsを確立するための方法を説明します。この方法論のレビューでは、全組織と生検から陰コレクションを強調する。私たちは、人間enteroidsとcolonoidsと、このモデルによって実施可能な実験的な戦略の成功成長および維持に不可欠な文化様式を再現。

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate buffered saline Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+ &lt;/sup&gt;free (DPBS)</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP439-500</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Gzntamycin/Amphotericin B solution</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>R-015-10</td><td></td></tr><tr><td>Wnt-3A conditioned medium</td><td>in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (glutamine)</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotidamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, GFR, Phenol free (basement membrane matrix)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>human recombinant Noggin</td><td>R&amp;amp;D</td><td>6057-NG/CF</td><td></td></tr><tr><td>human recombinant R-Spondin</td><td>Preprotech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>human recombinant EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067-5MG</td><td></td></tr><tr><td>human [Leu]15-Gastrin 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145-.1MG</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red (cell dissociation enzyme)</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>CTS Synth-a-Freeze Medium (freezing medium)</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>A13713-01</td><td></td></tr><tr><td>L Wnt-3A cell line</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>Renilla luciferase assay</td><td>Promega</td><td>E2710</td><td></td></tr><tr><td>human recombinant Wnt-3A</td><td>R&amp;amp;D</td><td>5036-WN/CF</td><td></td></tr><tr><td>HEK293 TOPflash cell line</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

図2Dは ​​、全組織（ 図2D）から新たに単離された陰窩の典型的な例を示している。生検から単離された陰窩の数は、全組織においてより低い。針で標準容量の生検鉗子を使用して、我々は通常、単一のパスで2生検刺さを行う。生検あたり50から100陰窩の平均（ 図2F）と10ミリメートル2面内の各生検一口結果。 基底膜マトリックスで培養後、陰窩は、大腸用、小腸とcolonospheresためenterospheresを形成するために切り上げる。通常出芽cryptは播種後、5〜6日以内に行われます。 （; ムービー1、図3A-C）。しかし、それはenteroids（enteroids）またはcolonoids（colonoids）基底膜マトリックス中に球体を形成するのどちらかを見ることが珍しくありません。継代はenteroidsのサイズに応じて、7日後に行うことができる。 enteroidsまたはcolonoids establ生検からished文化で同じ開発を受ける。播種における陰窩密度が低いほどしかし、継代は、通常、培養物中の10〜12日後に行われる（図4a、b）をEnteroidsとcolonoids文化が再現可能な方法で展開します。 enteroidsとcolonoidsの両方が腔側を提示し、上皮（ 図5A、B）が並んでいます。増殖細胞はenteroids内で観察することができ、芽の先端（ 図5C、D）内に配置される。 E-カドヘリン（ECAD）で染色enteroidsの共焦点イメージングは、上皮細胞（ 図5E）を示している。 enteroidsとcolonoidsの両方が先天性/遺伝性疾患の患者から得た組織から確立することができる。 図6は 、代表enteroidsによる上皮細胞の広告で先天性の変異に嚢胞性線維症（ 図6A）とタフティング腸症の患者から成長して示していますhesion分子遺伝子（のEpCAM）（ 図6B）。遺伝的欠陥の他に、enteroidsは、基底状態の違いを示さない。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig1highres.jpg" /> 陰窩解離と人間enteroidsと文化におけるcolonoidsの世代の図1.ワークフロー。陰窩（ヒト小腸または結腸から）は、EDTAのキレート化により分離されている。培養された陰窩は、大腸のための小腸とcolonoids用enteroidsを形成している。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52483/52483fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig2highres.jpg" /> 陰窩を単離するための図2の解剖工程（A）小腸specimenは延伸さシリコーンコートペトリ皿に平らに固定されている。 （B）粘膜下層の粘膜下組織から分離される。 （C）解剖粘膜延伸及びシリコーン被覆ペトリ皿に平らに固定されている。 （D）は、EDTAキレート化した後、陰窩の組織から単離される。 （E）One生検を延伸し、シリコーンコートペトリ皿に平らに固定されている。 （F）は 、EDTAのキレート化した後、陰窩は、生検から単離される。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52483/52483fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig3highres.jpg" /> 図3.墓所の文化と組織全体から人間enteroidとcolonoid世代。（A）単離後に基底膜マトリックス中にプレート空腸の陰窩。陰窩は、3〜4時間後に閉鎖し、この時間を超えてenterospheresを形成するようにバルーンを開始している。 7日目に、腸enteroidsが形成されている。 （B）の単離および培養後、回腸陰窩は腸陰窩のように振る舞うと回腸enteroidsを形成する。 （C）結腸陰窩を単離後に基底膜マトリックスに播種される。 7日（スケールバー：100μm）の後に陰窩近いとフォームcolonoids。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52483/52483fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig4highres.jpg" /> 生検から図4.墓所の文化と人間enteroidとcolonoid世代。（A）単離後に基底膜マトリックス中にプレート十二指腸陰窩。陰窩は4時間に3の後まで閉じてbeyoアップバルーンを開始しているndは、この時間はenterospheresを形成する。 7日目に、enteroidsが形成されている。 （B）の単離および培養後、結腸陰窩は、基底膜マトリックス中に播種する。陰窩は7日（スケールバー：100μm）をした後、次にcolonoids colonospheresを形成するためにクローズアップ。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52483/52483fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig5highres.jpg" /> 培養液中の6日後に、図5人間enteroidsの腸系統。（A）ヒトenteroid。 （A）中のenteroidsの（B）ヘマ ​​トキシリン-エオシン切片は、上皮ライニング（100ミクロンスケールバー）を実証する。 EDUの染色後enteroidsの（CD）、共焦点イメージング（マゼンタ）、増殖性細胞の存在を示している。 （E </str上皮細胞（ECAD、緑）（スケールバーのためのE-カドヘリン：オング&gt;）enteroidsの共焦点イメージングはの存在を示しています。50μm）を<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52483/52483fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig6highres.jpg" /> 病変組織から図6.墓所の文化や人間enteroid世代。（A）は、嚢胞性線維症の試料から確立Enteroids。 （B）Enteroidsは先天性のタフティング腸標本から確立（スケールバー：100μm）を。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52483/52483fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 培養中のヒトenteroidを形成する映画1. Enterosphere。32時間の時間、周e動画は、培養中enteroidを形成するために後退ヒト小腸から確立enterosphereを示している。 <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52483/Movie1_v2.mp4" target="_blank">このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 溶剤 </td><td> ストック濃度 </td><td> 最終濃度 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸は、生理食塩水のCa 2+、Mg 2+を無料（DPBS）バッファリング</td><td>ライフテクノロジーズ。ギブコ</td><td> 14190-144 </td><td> - </td><td> - </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン 四酢酸（EDTA） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 431788 </td><td>超純のdH 2 O </td><tD&gt; 0.5 M </td><td> 2 mMの</td><td></td></tr><tr><td>ソルビトール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> BP439-500 </td><td> DPBS </td><td>パウダー</td><td> 2％ </td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> BP220-1 </td><td> DPBS </td><td>パウダー</td><td> 1％ </td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン（BSA）フラクションV </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> BP1600-100 </td><td> DPBS </td><td>パウダー</td><td> 1％ </td><td></td></tr><tr><td> Gzntamycin /アムホテリシンB溶液</td><td>ライフテクノロジーズ。ギブコ</td><td> R-015から10 </td><td> - </td><td> 500X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td>のWnt-3Aは、メディアconditionned </td><td>家の中で</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td>高度なDMEM / F12 </td><td>ライフテクノロジーズ。ギブコ</td><td> 12634-028 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td>ライフテクノロジーズ。ギブコ</td><td> 15630-080 </td><td> - </td><td> 1 M </td><td> 10 mMの</td><td></td></tr><tr><td>グルタMAX（グルタミン） </td><td>ライフテクノロジーズ。ギブコ</td><td> 35050-061 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン（10,000 U / mL）を</td><td>ライフテクノロジーズ。ギブコ</td><td> 15140-148 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> N2サプリメント</td><td>ライフテクノロジーズ。ギブコ</td><td> 17502-048 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> B27サプリメント</td><td>ライフテクノロジーズ。ギブコ</td><td> 17504-044 </td><td> - </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> N-アセチルシステイン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A9165-5G </td><td> DPBS </td><td> 1 M </td><td> 1 mMの</td><td> &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td> Nicotidamide </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> N0636 </td><td> DPBS </td><td> 1 M </td><td> 10 mMの</td><td></td></tr><tr><td>マトリ、GFR、フェノール無料（基底膜マトリックス） </td><td>コー​​ニング</td><td> 356231 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> REQUIRED </td></tr><tr><td>ヒト組換えノギン</td><td>研究開発</td><td> 6057-NG / CF </td><td> DPBS </td><td> 100μg/ mlの</td><td> 100ng / mlの</td><td rowspan="3">他のサプライヤー：R＆D;アナスペックとPreprotech </td></tr><tr><td>ヒト組み換えRスポンジン</td><td> Preprotech </td><td> 120から38 </td><td> DPBS </td><td> 1 mg / mlの</td><td> 1μg/ mlの</td></tr><tr><td>ヒト組み換えEGF </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> E9644-.2MG </td><td> DBPS </td><td> 500 / mlの</td><td> 50ng / mlの</td></tr><tr><td> Y-27632 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> Y0503-1MG </td><td> DPBS </td><td> 10 mMの</td><td> 10μM </td><td></td></tr><tr><td> - 83から01 </td><td>トクリス</td><td> 2939 </td><td> DMSO </td><td> 500μM </td><td> 500 nMの</td><td></td></tr><tr><td> SB202190 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S7067-5MG </td><td> DMSO </td><td> 30 mMの</td><td> 10μM </td><td></td></tr><tr><td>人間[レイ] 15-ガストリン1 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G9145-.1MG </td><td> DPBS </td><td> 100μM </td><td> 10 nMの</td><td></td></tr><tr><td> CHIR99021 </td><td> Stemgent </td><td> 04から0004 </td><td> DMSO </td><td> 10 mMの</td><td> 2.5μM </td><td></td></tr><tr><td> Thiazovivin </td><td> Stemgent </td><td> 04から0017 </td><td> DMSO </td><td> 10 mMの</td><td> 2.5μM </td><td></td></tr><tr><td>のTrypLE Expressの酵素（1X）、フェノールレッド（細胞解離酵素） </td><td>ライフテクノロジーズ。ギブコ</td><td> 12605-010 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td>継代のために</td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>ライフテクノロジーズ。ギブコ</td><td> 10082-1​​47 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td>継代のために</td></tr><tr><td> CTSシンセ-フリーズミディアム（凍結培地） </td><td>ライフテクノロジーズ。ギブコ</td><td> A13713-01 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td>凍結のために</td></tr><tr><td> LのWnt-3A細胞株</td><td> ATCC </td><td> CRL-2647 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td>のWnt-3Aは、メディア制作をconditionned </td></tr><tr><td>ウミシイタケルシフェラーゼアッセイ</td><td>プロメガ</td><td> E2710 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td>のWnt-3Aは、メディアアクティビティconditionned </td></tr><tr><td>ヒト組み換えのWnt-3A </td><td>研究開発</td><td> 5036-WN / CF </td><td> DPBS </td><td> 100μg/ mlの</td><td> 100ng / mlの</td><td&gt;のWnt-3Aは、メディアアクティビティconditionned </td></tr><tr><td> HEK293 TOPFLASH細胞株</td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td>のWnt-3Aは、メディアアクティビティconditionned。ハンスCleversの研究室からの贈り物</td></tr></tbody></table> 好適な製造業者およびカタログ番号表1.詳細な試薬リスト。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 機器 </td><td> 消耗品 </td><td> ツール </td></tr><tr><td>層流フード</td><td> 15-と50ミリリットルコニカルチューブ</td><td>デュモン＃5標準鉗子（FST;＃11251から20） </td></tr><tr><td> CO 2インキュベーター</td><td>マイクロチューブ</td><td>デュモン＃7、湾曲した細い鉗子（FST;＃11274から20） </td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td> 24ウェルプレート</td><td>ファインはさみ（FST;＃14060から09） </td></tr><tR&gt; <td>遠心分離機</td><td> 0.22μmのフィルター（ザルトリウス） </td><td> Vannasスプリングはさみ（FST;＃15018から10） </td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>血清学的ピペット</td><td> 0.2ミリメートルの直径minutienピン（FST;＃26002から20） </td></tr><tr><td>凍結コンテナ（ナルゲン） </td><td>マイクロピペットのヒント</td><td> 0.1ミリメートルの直径minutienピン（FST;＃26002から10） </td></tr><tr><td>シルガード184シリコーン（ダウコーニング） </td><td> 150μmのメッシュ開口部、ナイロンスクリーニング（ダイナミックアクアサプライ） </td><td></td></tr><tr><td>ガラスシャーレ</td><td> 5ミリリットル丸底ポリプロピレンチューブ（ファルコン） </td><td></td></tr><tr><td>血清学的ピペッター</td><td> 18Gブラント塗りつぶし針（BD） </td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット</td><td>ルアーロックのヒントと3ミリリットルlsyringes（BD） </td><td></td></tr><tr><td></td><td>クライオバイアル</td><td></td></tr></tbody></table><s陰窩分離と文化のために必要·チョン&gt;表2.詳細な消耗品、ツール、および機器。

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Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

全組織生検からヒト上皮EnteroidsとColonoidsの確立

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

establishment-human-epithelial-enteroids-colonoids-from-whole-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

34.7K ビュー.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

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Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted in sophisticated in vitro models of the intestinal mucosa. Leveraging these emerging model systems will require adaptation of tools and techniques developed for 2D culture systems and animals. Here, we describe a technique for measuring epithelial barrier permeability in human intestinal organoids in real-time. This is accomplished by microinjection of fluorescently-labeled dextran and imaging on an inverted microscope fitted with epifluorescent filters. Real-time measurement of the barrier permeability in intestinal organoids facilitates the generation of high-resolution temporal data in human intestinal epithelial tissue, although this technique can also be applied to fixed timepoint imaging approaches. This protocol is readily adaptable for the measurement of epithelial barrier permeability following exposure to pharmacologic agents, bacterial products or toxins, or live microorganisms. With minor modifications, this protocol can also serve as a general primer on microinjection of intestinal organoids and users may choose to supplement this protocol with additional or alternative downstream applications following microinjection.

This protocol describes the measurement of epithelial barrier permeability in real-time following pharmacologic treatment in human intestinal organoids using fluorescent microscopy and live cell microscopy.

人間の腸 Organoids 上皮関門の透過性のリアルタイム計測

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

発生生物学

A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human intestinal epithelium, leading to increased intestinal permeability, impaired restitution, and increased cell death. Although there are numerous animal models of NEC, response to injury and therapeutic interventions may be highly variable between species. Furthermore, it is ethically challenging to study disease pathophysiology or novel therapeutic agents directly in human subjects, especially children. Therefore, it is highly desirable to develop a novel model of NEC using human tissue. Enteroids are 3-dimensional organoids derived from intestinal epithelial cells. They are ideal for the study of complex physiologic interactions, cell signaling, and host-pathogen defense. In this manuscript we describe a protocol that cultures human enteroids after isolating intestinal stem cells from patients undergoing bowel resection. The crypt cells are cultured in media containing growth factors that encourage differentiation into the various cell types native of the human intestinal epithelium. These cells are grown in a synthetic, collagenous mix of proteins that serve as a scaffold, mimicking the extra-cellular basement membrane. As a result, enteroids develop apical-basolateral polarity. Co-administration of lipopolysaccharide (LPS) in media causes an inflammatory response in the enteroids, leading to histologic, genetic, and protein expression alterations similar to those seen in human NEC. An experimental model of NEC using human tissue may provide a more accurate platform for drug and treatment testing prior to human trials, as we strive to identify a cure for this disease.

Enteroids are emerging as a novel model in the study of human disease. The protocol describes how to simulate an enteroid model of human necrotizing enterocolitis using lipopolysaccharide (LPS) treatment of enteroids generated from neonatal tissue. Collected enteroids demonstrate inflammatory changes akin to those seen in human necrotizing enterocolitis.

壊死性腸炎新規ヒト上皮 Enteroid モデル

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human ...

免疫・感染学

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

病原体、共生生物、およびホストの腸上皮間の相互作用を研究する人間 Colonoid 単分子膜

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

マウス小腸上皮オルガノイドと先天性リンパ球細胞との共培養

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have recently emerged as a promising system to model gastrointestinal pathologies. However, currently utilized methods for enteroid manipulation either lack access to the apical surface of the epithelium (three-dimensional [3D]) or are time-consuming and resource-intensive (two-dimensional [2D] monolayers). These methods often require additional steps, such as microinjection, for the model to become physiologically translatable. Here, we describe a physiologically relevant and inexpensive protocol for studying NEC in vitro by reversing enteroid polarity, resulting in the apical surface facing outward (apical-out). An immunofluorescent staining protocol to examine enteroid barrier integrity and junctional protein expression following exposure to tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) or lipopolysaccharide (LPS) under normoxic or hypoxic conditions is also provided. The viability of 3D apical-out enteroids exposed to normoxic or hypoxic LPS or TNF-&#945; for 24 h is also evaluated. Enteroids exposed to either LPS or TNF-&#945;, in combination with hypoxia, exhibited disruption of epithelial architecture, a loss of adherens junction protein expression, and a reduction in cell viability. This protocol describes a new apical-out NEC-in-a-dish model which presents a physiologically relevant and cost-effective platform to identify potential epithelial targets for NEC therapies and study the preterm intestinal response to therapeutics.

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

This protocol describes an apical-out necrotizing enterocolitis (NEC)-in-a-dish model utilizing small intestinal enteroids with reversed polarity, allowing access to the apical surface. We provide an immunofluorescent staining protocol to detect NEC-related epithelial disruption and a method to determine the viability of apical-out enteroids subjected to the NEC-in-a-dish protocol.

インビトロ 壊死性腸炎の頂端外腸炎モデル

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

医学

Testing Epithelial Permeability in Fetal Tissue-Derived Enteroids

Human fetal tissue-derived enteroids are emerging as a promising in vitro model to study intestinal injuries in preterm infants. Enteroids exhibit polarity, consisting of a lumen with an apical border, tight junctions, and a basolateral outer layer exposed to growth media. The consequences of intestinal injuries include mucosal inflammation and increased permeability. Testing intestinal permeability in vulnerable preterm human subjects is often not feasible. Thus, an in vitro fetal tissue-derived intestinal model is needed to study intestinal injuries in preterm infants. Enteroids can be used to test changes in epithelial permeability regulated by tight junction proteins. In enteroids, intestinal stem cells differentiate into all epithelial cell types and form a three-dimensional structure on a basement membrane matrix secreted by mouse sarcoma cells. In this article, we describe the methods used for establishing enteroids from fetal intestinal tissue, characterizing the enteroid tight junction proteins with immunofluorescent imaging, and testing epithelial permeability. As gram-negative dominant bacterial dysbiosis is a known risk factor for intestinal injury, we used lipopolysaccharide (LPS), an endotoxin produced by gram-negative bacteria, to induce permeability in the enteroids. Fluorescein-labeled dextran was microinjected into the enteroid lumen, and serial dextran concentrations leaked into the culture media were measured to quantify the changes in paracellular permeability. The experiment showed that apical exposure to LPS induces epithelial permeability in a concentration-dependent manner. These findings support the hypothesis that gram-negative dominant dysbiosis contributes to the mechanism of intestinal injury in preterm infants.

This protocol details the establishment of enteroids, a three-dimensional intestinal model, from fetal intestinal tissue. Immunofluorescent imaging of epithelial biomarkers was used for model characterization. Apical exposure of lipopolysaccharides, a bacterial endotoxin, using microinjection technique induced epithelial permeability in a dose-dependent manner measured by the leakage of fluorescent dextran.

胎児組織由来エンテロイドの上皮透過性の試験

Human fetal tissue-derived enteroids are emerging as a promising in vitro model to study intestinal injuries in preterm infants. Enteroids exhibit ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

オルガノイド由来の上皮単分子膜:腸管バリア機能のための臨床的に関連するインビトロモデル

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

生物学

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in the continuity of this barrier can result in inflammatory disorders such as inflammatory bowel disease. One of the limitations in the study of intestinal epithelial biology has been the lack of primary cell culture models, which has obliged researchers to use model cell lines derived from carcinomas. The advent of three dimensional (3D) enteroids has given epithelial biologists a powerful tool to generate primary cell cultures, nevertheless, these structures are embedded in extracellular matrix and lack the maturity characteristic of differentiated intestinal epithelial cells. Several techniques to generate intestinal epithelial monolayers have been published, but most are derived from established 3D enteroids making the process laborious and expensive. Here we describe a protocol to generate primary epithelial colon monolayers directly from murine intestinal crypts. We also detail experimental approaches that can be used with this model such as the generation of confluent cultures on permeable filters, confluent monolayer for scratch wound healing studies and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

In this protocol, we describe how to generate murine primary epithelial colon monolayers directly from intestinal crypts. We provide experimental approaches to generate confluent monolayers on permeable filters, confluent monolayers for scratch wound healing and biochemical studies, and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

腸管内窩からのネズミ原発結上皮単層の生成

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

腸オルガノイドモデルを用いたアプリカル特異的相互作用を研究する培養法

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

Generation and Characterization of Murine Oral Mucosal Organoid Cultures

The mucous lining covering the inside of our mouth, the oral mucosa, is a highly compartmentalized tissue and can be subdivided into the buccal mucosa, gingiva, lips, palate, and tongue. Its uppermost layer, the oral epithelium, is maintained by adult stem cells throughout life. Proliferation and differentiation of adult epithelial stem cells have been intensively studied using in vivo mouse models as well as two-dimensional (2D) feeder-cell based in vitro models. Complementary to these methods is organoid technology, where adult stem cells are embedded into an extracellular matrix (ECM)-rich hydrogel and provided with a culture medium containing a defined cocktail of growth factors. Under these conditions, adult stem cells proliferate and spontaneously form three-dimensional (3D) cell clusters, the so-called organoids. Organoid cultures were initially established from murine small intestinal epithelial stem cells. However, the method has since been adapted for other epithelial stem cell types. Here, we describe a protocol for the generation and characterization of murine oral mucosal organoid cultures. Primary epithelial cells are isolated from murine tongue tissue, embedded into an ECM hydrogel, and cultured in a medium containing: epidermal growth factor (EGF), R-spondin, and fibroblast growth factor (FGF) 10. Within 7 to 14 days of initial seeding, the resulting organoids can be passaged for further expansion and cryopreservation. We additionally present strategies for the characterization of established organoid cultures via 3D whole-mount imaging and gene-expression analysis. This protocol may serve as a tool to investigate oral epithelial stem cell behavior ex vivo in a reductionist manner.

We present a method for the generation and characterization of oral mucosal organoid cultures derived from the tongue epithelium of adult mice.

The mucous lining covering the inside of our mouth, the oral mucosa, is a highly compartmentalized tissue and can be subdivided into the buccal mucosa, ...

全組織生検からヒト上皮EnteroidsとColonoidsの確立

要約

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人間の腸 Organoids 上皮関門の透過性のリアルタイム計測

壊死性腸炎新規ヒト上皮 Enteroid モデル

病原体、共生生物、およびホストの腸上皮間の相互作用を研究する人間 Colonoid 単分子膜

マウス小腸上皮オルガノイドと先天性リンパ球細胞との共培養

インビトロ壊死性腸炎の頂端外腸炎モデル

胎児組織由来エンテロイドの上皮透過性の試験

オルガノイド由来の上皮単分子膜:腸管バリア機能のための臨床的に関連するインビトロモデル

腸管内窩からのネズミ原発結上皮単層の生成

腸オルガノイドモデルを用いたアプリカル特異的相互作用を研究する培養法

Generation and Characterization of Murine Oral Mucosal Organoid Cultures

全組織生検からヒト上皮EnteroidsとColonoidsの確立

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壊死性腸炎新規ヒト上皮 Enteroid モデル

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