この作品は、医学のウェイクフォレスト大学医学部との共同研究契約の下で、RJレイノルズ·タバコ·カンパニー（RJRT）によって資金を供給されている。 GLプラサドはRJRTのフルタイムの従業員である。

注：この研究を行うための書面によるインフォームドコンセントがグッド臨床プラクティスごとに、IRBの承認の下で地元の臨床研究ユニットで得られた。血液の処理は、PBMCおよび他の細胞培養実験の単離は、微生物学的に無菌用品および試薬を用いて、無菌条件下で行われる。 1. WS-CMの準備<ol><li>以前に12を説明したように、WS-CMを生成します。 <ol><li> 35-60-2、溶液にパフボリューム、秒でパフの間隔、及びパフ時間：以下の喫煙レジメンを使用したフェノールレッドを含まない1640培地（RPMI）ロズウェルパーク記念研究所を通じて4 3R4F参照タバコから煙を渡すことで、WS-CMを準備secである。各調製物を20mlのサンプルを生成する。 </li></ol></li><li>日付、時刻完了し、タバコの名前と番号付きラベルチューブ（S）。喫煙が完了した直後にC -80℃で500μlのアリコートに保管してください。 </li><li>凍結されたWSのアリコートを分析以前12に記載のように、ニコチン、タバコ特異的ニトロソアミン、および多環式芳香族炭化水素のレベルを決定する-CM。 </li></ol> PBMCの2の分離<ol><li> （タバコ製品の非消費者である）健康なドナーからの新鮮な血液を収集ウェイクフォレストバプテスト保健IRB 15とは別の承認の下に下記のように新鮮な血液由来のPBMCを分離します。 <ol><li>血液バッグの到着前に、500mlの瓶、はさみ、分離バッファ、及びダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）（RT）、バイオセーフティーレベル2（BSL-2）細胞培養フード中で準備している。分離バッファは、光から保護されなければならない。 </li><li>逆さまに血液バッグを持って、ちょうどそれがチューブの少なくとも3センチ残してクランプされた場所の下にチューブをカット。 </li><li> 500ミリリットルボトルからキャップを外し、ボトルの口の上にチューブを保持する。血液バッグをピックアップし、血液がTにバッグから自由に流れることができるようにそれを反転袋が空になるまで、彼は、ボトル。血液が気泡を作成しないようにまっすぐとして対ボトルの内壁上に流れるようになります。 </li><li>血液の分離バッファの5：1の比率でボトル内に分離バッファを注ぐ。転倒、10回、しっかりとボトルをキャップとそっとそれを反転。室温で1時間、ライトをオフにインキュベートし、細胞培養フードで瓶のままにしておきます。 </li><li>光、麦わら色の層は血の上に構築します。 50ミリリットルコニカルチューブに25ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、この層を除去する。血液を寄付被写体によって、300mlの - 収集量は50から異なる場合があります。 </li><li> RTで10分間、200×gでチューブを遠心。 </li><li>暗い血色のペレットを残して、半透明の上清を吸引除去する。ペレットはルーズが、粘性になります。 </li><li>ピペットで15ミリリットルコニカルチューブに単離緩衝の3ミリリットル。 </li><li>再懸濁ペレットに、Sに集め麦わら色の液体のすべての50ミリリットルのためにDPBSの20ミリリットルを追加TEP 2.1.5。ボルテックスは完全に混合し、複数の管からの再懸濁した液体を統合する。この液体は、血液細胞を懸濁含ま。 </li><li>トランスファーピペットで、ステップ2.1.8において分離緩衝液3mlに転写懸濁血液細胞を5ml。 2つの別個の層を作成するために、ゆっくりと静かに細胞懸濁液が含まれている15ミリリットルコニカルチューブを傾けます。最小限の加速とブレーキなしの室温で40分間400×gでチューブを遠心。 </li><li> 50ミリリットルコニカルチューブにしたPBMCを含む得られた濁った中間層（軟膜）を除去するために、転送ピペットを使用してください。その下に他の明確なレイヤを描画することは避けてください。各50ミリリットルコニカルチューブにせいぜい25ミリリットルを転送します。 </li><li>細胞を洗浄するために（50ミリリットルコニカルチューブの全体の残りの容量を埋めるために、またはそれ以上）の低温のランニングバッファーの25ミリリットルを追加します。 4℃で10分間400×gで細胞を遠心します。 </li><li>ランニング緩衝液10mlのペレットを再懸濁。これはPBMCを含まれています。細胞をカウントし、IMを使用凍結氷の上に置くmediatelyか。 </li></ol></li></ol> 3.凍結とのPBMCを解凍<ol><li>遠心分離機400×gで10分間のステップ2.1.13に回収したPBMCを。 </li><li>製造者の指示に従ってイソプロピルアルコールで冷凍コンテナを埋める。注意：イソプロピルアルコールは可燃性および急性毒性である。 </li><li> 20％ウシ胎児血清（FBS）および10％ジメチルスルホキシド（DMSO）を含有するRPMI 1640培地（4℃）でペレットを再懸濁する。これは凍結培地RPMI 1640である。約5×10 7細胞/ mlを有するサスペンションをもたらす凍結培地の量でペレットを再懸濁する。凍結のために利用可能な細胞の数が異なります。 </li><li>の2mlクリオチューブに細胞懸濁液の1mlアリコートを分配し、冷凍コンテナにクライオチューブを置き。 O / Nを格納し、クリオチューブを削除し、に格納する転送するために-80℃の冷凍庫にクライオチューブに冷凍コンテナを置きます-190℃〜-150℃の極低温冷凍機。 </li><li>低温貯蔵からのクライオチューブを外し、37℃の水浴中で穏やかに撹拌しながら急速に解凍。 </li><li>直ちに10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび1％L-グルタミンを含有する10ミリリットルRPMI 1640完全培地（4℃）にて15mlコニカルチューブにクライオチューブ中で解凍したPBMCを転送する。解凍したクライオチューブの内容物は、最大の細胞生存率15を得ることができる限り速やかに転送されるべきである。 </li><li> 10分間400×gでのPBMCを遠心。 </li><li> 5ミリリットルRPMI 1640完全培地でペレットを再懸濁し、細胞を数える。 </li><li>トリパンブルー排除法のような確立された方法により細胞生存率を測定する。 95％ - 一般に、この方法では、細胞生存率は約90である。 PBMCを今の実験で使用する準備が整いました。 </li></ol> 4.細胞死の決定注：ここに記載されている希釈はこのSTUのためのものでありDY。希釈は、それに応じて変更することができる。 <ol><li>以下に示すように、100μl/ウェルの全体積のRPMI完全培地を用いて96ウェルプレート中WS-CMまたはニコチンを希釈する。 </li><li>以下の濃度にWS-CMを希釈：0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、（WS-CM中のニコチン含有量に基づく）、等のニコチン単位の5μg/ mlの12。 </li><li> 100、200、500、750、1000,2000、および3000 / mlの以下の濃度にRPMI培地中でニコチンを希釈する。注意：ニコチンは急性毒性と環境に有害である。 </li><li>よく1×10 6細胞の濃度で/各ウェルにRPMI完全培地に懸濁したPBMCを100μlを追加。細胞+ WS-CMやニコチンの総容量は200μl/ウェルとなります。 </li><li>本研究の目的のために、上記のようにプレートの二組を準備。プレートを覆い、24時間、37℃で3時間、5％CO 2のための一つのプレートに1つのプレートをインキュベートする。必要に応じて時間点を調整します。 </li&gt; <li>氷冷ランニングバッファー200μlで細胞を再懸濁最終的に、3分間300×gで遠心分離し、上清を吸引し、カバープレートとプレートの底をボルテックスとすることにより、室温で細胞を洗浄し、洗浄工程をもう一度繰り返します。 </li><li> 100μl/ウェルの総容積のために各ウェルに7-アミノD（7AAD）5μlのに続いてバッファを実行しているの95を添加する。室温で15分間、暗所でプレートをインキュベートする。 </li><li>クラスターチューブにバッファを実行している100μlのを追加します。クラスターチューブ、プレートの各ウェルからの細胞懸濁液のボリューム全体を転送し、フローサイトメーターでサンプルを取得する。 </li><li>解析ソフトウェアフローサイトメトリーを使用して、7AAD陽性細胞の割合を決定します。 </li></ol> 5. EC 50の決定<ol><li> WS-CMとニコチンのEC 50値は、PBMCの7AAD陽性染色によって決定される。 </li><li> EC 50値は、濃として定義されentrationれる細胞の50％が24時間のアッセイにおいて、もはや生存可能ではなく、値は、等ニコチン単位/ mlのμgのように表現される。 </li><li>この研究の目的のために、EC 50値は、それぞれ、WS-CM及びニコチン1.56 / mlのと1650μgの/ mlであると決定された。 </li></ol> 6.分泌されたサイトカイン注：ここに記載されている希釈液を本研究の目的のためのものです。希釈は、それに応じて調整することができる。 <ol><li> 0.3、1.56、3の濃度、及び、等ニコチン単位を5μg/ mlの100μl/ウェルの全体積にRPMI完全培地を用いて96ウェルプレート中WS-CMを希釈する。 </li><li>以下の濃度にニコチンを希釈：100、200、500、750、1000,2000、及び3000μg/ mlの。注意：ニコチンは急性毒性と環境に有害である。 </li><li>よく1×10 6細胞の濃度で/各ウェルにRPMI完全培地に懸濁したPBMCを100μlを追加。細胞+ WS-CMやニコチンの総容量は200μl/ウェルとなります。 </li><li>プレートを覆い、37℃で3時間および5％CO 2でインキュベート。 </li><li> 、3分間300×gで遠心分離し、上清を吸引し、カバープレートとプレートの底をボルテックスし、最後の氷冷200μlのバッファーを実行し、洗浄工程をもう一度繰り返しで細胞を懸濁して室温で細胞を洗浄。 </li><li> RPMI完全培地200μlを追加し、洗浄工程をもう一度繰り返します。 </li><li>各ウェルに10μg/ mlのLPS培地200μlを追加します。 </li><li>プレートを覆い、4時間、24時間、48時間、または37℃で72時間、5％CO 2でインキュベート。必要に応じてインキュベーション時間を調整します。 </li><li> 3分間300×gでプレートを遠心します。 </li><li>ステップ7および8でアッセイを実行するために-80℃の冷凍庫でよく各店舗からの上清175μlをしてください。 </li></ol> 7.サイトメトリービーズアレイアッセイ &lt;OL&gt; <li> ステップ6.10とCBAアッセイでの使用から調製した細胞上清を解凍する。製造業者の指示に従ってサイトメトリービーズアレイ（CBA）アッセイを実行します。 </li></ol> 8. IL-8 ELISA <ol><li> ステップ6.10から細胞上清を解凍し、IL-8 ELISAで使用しています。製造業者の指示に従ってELISAアッセイを実行します。 </li></ol> 9.細胞内染色およびフローサイトメトリー注：ここに記載されている希釈液を本研究の目的のためのものです。希釈は、それに応じて調整することができる。 <ol><li> 0.3、1.56、3の濃度、及び、等ニコチン単位を5μg/ mlの100μl/ウェルの全体積にRPMI完全培地を用いて96ウェルプレート中WS-CMを希釈する。 </li><li> 2、10、50、100、500、2000、及び4000 / mlの：同じプレートにおいて、以下の濃度にニコチンを希釈する。注意：ニコチンは急性毒性があり、環境にハザルdous。 </li><li> /ウェル1×10 6細胞の濃度でRPMI完全培地に懸濁したPBMCを100μlを追加。細胞+ WS-CMやニコチンの総容量は200μl/ウェルとなります。 </li><li>プレートを覆い、37℃で3時間、5％CO 2でインキュベート。 </li><li>氷冷ランニングバッファー200μlで細胞を再懸濁最終的に、3分間300×gで遠心分離し、上清を吸引し、カバープレートとプレートの底をボルテックスとすることにより、室温で細胞を洗浄し、洗浄工程をもう一度繰り返します。 </li><li>プレートにRPMI完全培地200μlを追加し、洗浄ステップをもう一度繰り返します。 </li><li> RPMI完全培地を使用した2μL/ mlのGolgiPlugの使用濃度および10μg/ mlのLPSを準備し、各ウェルに200μlを添加する。 </li><li> 37℃で6時間、5％CO 2、プレートをインキュベートする。 </li><li>ステップ9.8の終了時に、バッファー（4℃）を実行し、300で回転で細胞を洗浄4℃で3分間XG。 </li><li>各ウェルにのCytofix100μlのを追加し、4℃で20分間インキュベートする。 </li><li> 4℃で3分間300×gで1倍Permwash（4℃）でステップ9.9で説明したように、細胞を3回洗浄する。 </li><li>に以下の抗体の1の各5μlの各ウェルに45μLの1x Cytopermをの追加各ウェル：TNF-α-アレクサフルオロ488、IFN-γV500、MIP-1αPE。 30分間4℃でインキュベートする。 </li><li> 1X Permwash（4℃）、4℃で3分間300×gでバッファー（4℃）を実行していると1時間にステップ9.9で説明したように、細胞を2回洗浄します。 </li><li> 2％パラホルムアルデヒド（4℃）200μlで細胞を再懸濁。 12×75mmのチューブに細胞を移し、フローサイトメーターでサンプルを分析する。注意：ホルムアルデヒドは急性毒性と健康被害、腐食性がある。 </li></ol> 10. K562キリングアッセイ NOTE：K562細胞を増殖されるべきであるRPMI完全培地で37℃、5％CO 2での培養では、それらは、アッセイの前に80％のコンフルエンスに達するまで。 <ol><li>バイアルにDMSOを18μLを追加することによって、スクシンイミジルエステル（CFSE）原液カルボ5 mMのを準備します。 </li><li>各ウェルに対して所望の等ニコチン単位またはニコチン濃度を達成するために、100μl/ウェルの全体積にRPMI完全培地を用いて96ウェルプレート中WS-CMまたはニコチンを希釈する。注意：ニコチンは急性毒性と環境に有害である。 </li><li> /ウェル1.5×10 6細胞の濃度でRPMI完全培地にPBMCの100μlのを追加。 WS-CMまたはニコチンでの細胞の総容積は200μl/ウェルであろう。 </li><li>プレートを覆い、37℃で3時間、5％CO 2でインキュベート。 </li><li>室温で8分間400×gでDPBSと遠心機の10ミリリットルを追加することによって、K562細胞を洗浄。 </li><li> DPBS 10mlの細胞を再懸濁し、K562細胞を数える。 </li><li> CFSE workiを準備1ミリリットルのDPBSにCFSEストック溶液1μlを追加することでNGソリューション。 </li><li> 2×10 7細胞- 1を含むK562細胞懸濁液1mlにCFSEワーキング溶液1mlを加える。ボルテックスし、室温で2分間正確にインキュベートする。 </li><li>すぐにFBSの200μlを添加する。ボルテックスし、室温で2分間正確にインキュベートする。 </li><li> RPMI完全培地の10ミリリットルを加え、室温で8分間400×gでチューブを遠心する。 </li><li> RPMI上清を除去し、ペレットを破るし、RPMI完全培地10mlで細胞を再懸濁し、CFSE標識K562細胞を数える。 </li><li> RTで3分間300×gでプレートを遠心分離することによりPBMCを洗浄する。液体をデカントすることによって、上清を吸引除去する。カバーを取り付け、プレートの底をボルテックス。 RPMI完全培地200μlを加え、洗浄工程をもう一度繰り返します。 </li><li>各サンプルPBMCプレートのウェル、さらに私に：1：15（1.5×10 6のPBMC10万K562s）の比率でCFSE標識K562細胞を追加37℃で5時間、5％CO 2のためncubate。 </li><li> RTで3分間300×gで遠心分離することにより細胞ミックスを洗ってください。液体を廃棄することにより、上清を吸引除去する。カバーを置き、プレートの底をボルテックス。 </li><li>ランニング緩衝液200μlを加え、ステップ10.14 1より多くの時間に記載されて洗浄工程を繰り返します。 </li><li> 100μl/ウェルの総容積のために各ウェルに7AAD5μlのに続いて実行されているバッファの95を添加する。室温で15分間、暗所でプレートをインキュベートする。 </li><li>各ウェルにバッファを実行している100μlのを追加し、クラスターチューブにプレートの各ウェルから細胞懸濁液のボリューム全体を転送し、フローサイトメーターでサンプルを取得する。 </li><li>解析ソフトウェアフローサイトメトリーを使用して、7AAD陽性とCFSE陽性細胞の割合を決定します。 </li></ol>

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The authors declare that there are no conflicts of interest.

我々は、他の以前のTPPによるPBMCの処理は、サイトカインおよび14を殺し、標的細胞として機能的措置の発現および分泌を含むいくつかの応答を抑制することを実証した。前作に記載された実験の方法はより長いインキュベーション時間を必要とし、大きさが14で控えめだった。基本のためにこの魅力的なex vivoでモデルの潜在的な応用を考えると応用研究、我々はこれら...

心血管疾患（CVD）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）および癌1,2を含む慢性喫煙の健康への悪影響に対する知識ポイントの大幅なボディ。慢性の喫煙は、技術が病態生理学的効果の分子基盤を解明することにおいて有用であり、炎症および免疫抑制を引き起こすことが知られており、これらの変化は、喫煙3における微生物感染および癌の危険性の増大に寄与することが報告されている。 インビトロおよびエキソビボタバコの煙4-9（ 表1）と、様々なタバコ製品10,11の新たな規制を案内するための重要なツールとして認識されている。 例えば、我々は、全煙馴化培地（WS-CM）および総粒子状物質（TPM）などの可燃タバコ製品製剤（のTPP）をはるかに細胞毒性および有害にあることを実証している不燃性のTPPまたはニコチン12,13よりDNA。公表された研究と一致して、最近、可燃のTPPまたはニコチン12,13ことが報告された。発表された研究と一致して、我々は最近、可燃のTPPが著しい免疫抑制を引き起こしたことを報告した。これは、受容体（TLR）-ligands Toll様の抑制によって証明された、サイトカイン分泌を刺激し、細胞（K562） のex vivoモデル14でのPBMCによる殺傷を狙っ。タバコの煙によって誘発される疾患プロセスにおける炎症の重要性を考えると、タバコの煙の免疫調節効果を評価するためのアッセイ条件のさらなる最適化は、このレポートに記載されている。 ex vivoでのアッセイは、典型的に、細胞内および分泌されるサイトカインなどアッセイ14を殺すK562細胞における細胞傷害性T細胞およびNK細胞の細胞溶解機能を測定した。アッセイは、WS-CM及びニコチン及びPBMCのその後の刺激とのプレインキュベーションを含んだ3日間にわたってTLRアゴニストとの;最終的な読み出しは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いて、および/またはフローサイトメトリーを行っている。我々は、TLR-4受容体に結合し、細胞内サイトカインおよびサイトカインの分泌の産生をもたらすのPBMCを刺激し、細菌性リポ多糖（LPS）を利用する。単離PBMCを、細胞死アッセイ、およびIL-8の定量化のためのTPP、我々はまた、本発明の方法の免疫調節効果を評価するための様々なアッセイ手順の最適化に加えて。これらの方法は、他の研究課題に対処するために適用され、さらなる調節文脈でタバコ製品を評価するために洗練されてもよい。 表1 のin vitroの報告書を発表し、ex vivoでの方法はたばこ製品製剤のvarilus病態生理学的効果を研究するために使用される CS、タバコの煙媒体。 CSC、タバコの煙凝縮。 CSE、タバコの煙抽出物; ELISA、酵素結合免疫吸着アッセイ; GADPH、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ。定量PCR、定量的ポリメラーゼ連鎖反応。 RT、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応。 TS、タバコの煙。 <table><tbody><tr><td> 著者（研究の年） </td><td> ラーンら （2004） </td><td> ムーディら （2004） </td><td> Oltmanns ら （2005） </td><td> Vayssier（1998） </td><td> Witherden ら （2004） </td><td> ビレルら （2008） </td></tr><tr><td> 細胞を使用 </td><td>ヒト気管支内皮細胞（BEAS-2B）、ヒト好中球</td><td>人間の肺胞上皮細胞（A549） </td><td>ヒト気道平滑筋細胞（HASMC） </td><td>ヒトpremonocytic U937細胞、ヒト単球</td><td>肺胞II型上皮細胞（ATII） </td><td>ヒト単球細胞株（THP-1）、ヒト肺マクロファージ</td></tr><tr><td> TPP使用 </td><td> CSE </td><td> CSC </td><td> CSE </td><td> TS </td><td> CSE </td><td> CS </td></tr><tr><td> メソッドの使用 </td><td> ELISA、定量PCR、マイグレーション、電気泳動移動度シフト</td><td>免疫組織化学、電気泳動、Arrayscanキット、RT-PCR、ELISA </td><td> ELISA、RT-PCR、定量PCR、電気泳動</td><td>ゲル移動度シフト</td><td>光学顕微鏡、電子顕微鏡、電気泳動、ELISA </td><td>定量PCR、ELISA、E-toxateキット（Sigma）を、p65のプレートアッセイ（のTransAM）、電気泳動、種々の免疫アッセイキット</td></tr><tr><td> メジャー </td><td> IL-8、GM-CF、AP-1、NF-κB、移行</td><td>ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、NF-κB、IL-8、pIがκB-α、GADPH </td><td> HO-1、GADPH、RANTES、IL-8、エオタキシン</td><td>ヒートショック/ストレスタンパク質（HSP / Hsp70が）、HF転写因子、NF-κB、TNF-α </td><td>界面活性剤タンパク質（SP-A、SP-C）、IL-8、MCP-1、GRO-α、TNF-α、IL-1β、IFN-γ </td><td> IL-8、IL-1β、IL-6、TNF-α、MIP1-α、GRO-α、MAPK / JNK / ERKリン酸化、cJUN：DNA結合、グルタチオン、P65：DNA結合</td></tr><tr><td> 最終結果 </td><td> CSEは、AP-1活性化の抑制を介してサイトカイン産生をダウンレギュレートする。 </td><td> H 2 O 2とCSC示差的炎症性サイトカインの放出を調節する、ヒストンデアセチラーゼ活性を低下させる、ヒストンタンパク質のアセチル化を高める。 </td><td>タバコの煙は、TNF-α、20％CSE少ないタバコの煙によるIL-8放出、エオタキシンおよびRANTESの阻害によって強化、HASMCからのIL-8の放出を引き起こすことがあります。 </td><td> TSは、Hsp70の過剰発現およびNFkBの結合活性およびTNF-α放出の阻害に関連したHFの転写因子を活性化した。 </td><td>減少ATII細胞由来ケモカインレベルが肺胞を損なうLAR修理、タバコの煙によって誘発される肺胞の損傷および肺気腫に貢献する。 </td><td>データは、喫煙者は呼吸器感染症が増加している理由のための機構的説明を提供する。生得的反応の抑制は、IL-8の増加を伴う。 </td></tr></tbody></table>

<table><tbody><tr><td>12 x 75 mm tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tubes</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>2 ml microtubes</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C-S</td><td></td></tr><tr><td>3R4F reference cigarettes</td><td>Univ. of Kentucky, College of Agriculture</td><td>3R4F</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical tubes</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>500 ml bottle</td><td>Corning</td><td>430282</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>96-well flat bottom plate</td><td>Termo Nunc</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>96-well round bottom plates</td><td>BD Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture hood</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 Series A2</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>58110R</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Molecular Probes Life Technologies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Cluster tubes</td><td>Corning</td><td>4401</td><td>Harmful if swallowed, carcinogen</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm (Permwash)</td><td>BD Biosciences</td><td>555028</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>DMSO (dimethyl sulfoxide )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>FCAP Array</td><td>BD Biosciences</td><td>652099</td><td>Software analyzes CBA data</td></tr><tr><td>Filter unit</td><td>Nalgene</td><td>156-4020</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td>8 colors, at Ex 405 and Em 785.</td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Calibur</td><td>4 colors at Ex 495 and Em 785.</td></tr><tr><td>Flow cytometry analysis software</td><td>Tree Star</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Freezing container</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>Contains DMSO, irritant</td></tr><tr><td>GogliPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td>Carcinogen, irritant, corrosive</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>Human Inflammatory Cytokine Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>551811</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&amp;gamma; V-500 Antibody</td><td>BD Horizon</td><td>561980</td><td>skin sensitizer</td></tr><tr><td>IL-8 ELISA Kit</td><td>R and D Systems</td><td>DY208</td><td></td></tr><tr><td>Isolation buffer</td><td>Isolymph, CTL Scientific Corp.</td><td>1114868</td><td>Flammable liquid, irritant</td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>MIP1-&amp;alpha; PE Antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>554730</td><td>Acute toxicity, oral</td></tr><tr><td>Monensin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5273</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Nicotine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3876</td><td>Acute toxicity, environmental hazard</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>&amp;ldquo;M&amp;rdquo;</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Flammable, skin irritation</td></tr><tr><td>Pen/strep</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Running buffer</td><td>MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Th1/Th2 CBA Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>551809</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&amp;alpha; Alexa Fluor 488 Antibody</td><td>BioLegend</td><td>502915</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr></tbody></table>

methods to evaluate cytotoxicity and immunosuppression of combustible tobacco product preparations

他の病態生理学的変化の中で、タバコの煙への慢性暴露は、微生物感染症および腫瘍発生に喫煙者の感受性の増加に関連している炎症および免疫抑制を引き起こす。 エクスビボのヒト末梢血単核細胞における受容体媒介性免疫応答の抑制（PBMC）を煙成分で処理されたメカニズムを研究し、タバコ製品への曝露の可能性のある長期的影響を評価するための魅力的なアプローチである。ここでは、細菌性リポ多糖、Toll様受容体4リガンドによって刺激したPBMCを使用してex vivoでのアッセイを実行するための方法を最適化した。全体煙馴化培地（WS-CM）、可燃タバコ製品製剤（TPP）、及びニコチンの効果はサイトカイン分泌に調査し、ex vivoでのアッセイでのPBMCによる細胞死滅を標的とした。者らは、分泌されたサイトカインIFN-γ、TNF、IL-10、IL-6、及びIL-8および細胞内サイトカインIFN-47 ;, TNF-α、および​​MIP-1αは、WS-CM-暴露PBMCにおいて抑制された。 K562標的細胞殺傷アッセイによって決定されるエフェクターPBMCの細胞溶解機能は、また、WS-CMへの曝露によって減少した。ニコチンはこれらのアッセイにおける最小有効だった。要約すると、我々は、生体外アッセイにおけるTPPの影響を評価するために改良されたアッセイのセットを提示し、これらの方法は、容易に関心のある他の製品をテストするために適合させることができる。

結果は、平均（4ドナーサンプル）の平均値±標準誤差として示した。処理および未処理の対照サンプルとの間のスチューデントのt検定は、対応するコントロールとのすべての治療のためにExcelソフトウェアならびにt検定比較を用い​​て行った。統計的有意性は次式で示された：*、P &lt;0.05; **、P &lt;0.005。 ***、P &lt;0.0005。 WS-CMおよびニコチンへの曝露の効果を測定する?...

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Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.

可燃たばこ製品製剤の細胞毒性および免疫抑制を評価するための方法

Among other pathophysiological changes, chronic exposure to cigarette smoke causes inflammation and immune suppression, which have been linked to ...

methods-to-evaluate-cytotoxicity-immunosuppression-combustible

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K ビュー.  Wake Forest University Health Sciences. Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure. 

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Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface  

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated respiratory epithelium. A protocol is described for isolating and exposing these cells to mainstream cigarette smoke (CS), in order to study epithelial cell responses to CS exposure. The protocol consists of three parts: the isolation of airway epithelial cells from mouse trachea, the culturing of these cells at air-liquid interface (ALI) as fully differentiated epithelial cells, and the delivery of calibrated mainstream CS to these cells in culture. The ALI culture system allows the culture of respiratory epithelia under conditions that more closely resemble their physiological setting than ordinary liquid culture systems. The study of molecular and lung cellular responses to CS exposure is a critical component of understanding the impact of environmental air pollution on human health. Research findings in this area may ultimately contribute towards understanding the etiology of chronic obstructive pulmonary disease (COPD), and other tobacco-related diseases, which represent major global health problems.

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface as a model of differentiated respiratory epithelium. A protocol is described for isolating, culturing and exposing these cells to mainstream cigarette smoke, in order to study molecular responses to this environmental toxin.

エアー液界面におけるマウスの呼吸器上皮細胞と実験たばこの煙への暴露の分離

Pulmonary epithelial cells can be isolated from the respiratory tract of mice and cultured at air-liquid interface (ALI) as a model of differentiated ...

医学

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease or lung cancer. To understand the underlying mechanisms of disease development, it would be important to examine the impact of CS exposure directly on lung tissues. However, this approach is difficult to implement in epidemiological studies because lung tissue sampling is complex and invasive. Alternatively, tissue culture models can facilitate the assessment of exposure impacts on the lung tissue. Submerged 2D cell cultures, such as normal human bronchial epithelial (NHBE) cell cultures, have traditionally been used for this purpose. However, they cannot be exposed directly to smoke in a similar manner to the in vivo exposure situation. Recently developed 3D tissue culture models better reflect the in vivo situation because they can be cultured at the air-liquid interface (ALI). Their basal sides are immersed in the culture medium; whereas, their apical sides are exposed to air. Moreover, organotypic tissue cultures that contain different type of cells, better represent the physiology of the tissue in vivo. In this work, the utilization of an in vitro exposure system to expose human organotypic bronchial and nasal tissue models to mainstream CS is demonstrated. Ciliary beating frequency and the activity of cytochrome P450s (CYP) 1A1/1B1 were measured to assess functional impacts of CS on the tissues. Furthermore, to examine CS-induced alterations at the molecular level, gene expression profiles were generated from the tissues following exposure. A slight increase in CYP1A1/1B1 activity was observed in CS-exposed tissues compared with air-exposed tissues. A network-and transcriptomics-based systems biology approach was sufficiently robust to demonstrate CS-induced alterations of xenobiotic metabolism that were similar to those observed in the bronchial and nasal epithelial cells obtained from smokers.

The aim of this protocol is to expose human organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream cigarette smoke (CS) at the air-liquid interface. The impact of CS on the tissues is then investigated using a cytochrome P450 activity assay, a cilia beating measurement, and a systems biology approach.

全体タバコ煙への器官型3D気管支及び鼻腔組織培養モデルの反復暴露の影響評価

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

生物工学

Generation of Electronic Cigarette Aerosol by a Third-Generation Machine-Vaping Device: Application to Toxicological Studies

Electronic-cigarette (e-cig) devices use heat to produce an inhalable aerosol from a liquid (e-liquid) composed mainly of humectants, nicotine, and flavoring chemicals. The aerosol produced includes fine and ultrafine particles, and potentially nicotine and aldehydes, which can be harmful to human health. E-cig users inhale these aerosols and, with the third-generation of e-cig devices, control design features (resistance and voltage) in addition to the choice of e-liquids, and the puffing profile. These are key factors that can significantly impact the toxicity of the inhaled aerosols. E-cig research, however, is challenging and complex mostly due to the absence of standardized assessments and to the numerous varieties of e-cig models and brands, as well as e-liquid flavors and solvents that are available on the market. These considerations highlight the urgent need to harmonize e-cig research protocols, starting with e-cig aerosol generation and characterization techniques. The current study focuses on this challenge by describing a detailed step-by-step e-cig aerosol generation technique with specific experimental parameters that are thought to be realistic and representative of real-life exposure scenarios. The methodology is divided into four sections: preparation, exposure, post-exposure analysis, plus cleaning and maintenance of the device. Representative results from using two types of e-liquid and various voltages are presented in terms of mass concentration, particle size distribution, chemical composition and cotinine levels in mice. These data demonstrate the versatility of the e-cig exposure system used, aside from its value for toxicological studies, as it allows for a broad range of computer-controlled exposure scenarios, including automated representative vaping topography profiles.

Electronic cigarette (e-cig) users are increasing worldwide. Little, however, is known about the health effects induced by inhaled e-cig aerosols. This article describes an e-cig aerosol generation technique suitable for animal exposures and subsequent toxicological studies. Such protocols are required to establish experimentally reproducible and standardized e-cig exposure systems.

第三世代機 Vaping デバイスによる電子タバコ エアロゾルの生成: 毒性学的研究への応用

Electronic-cigarette (e-cig) devices use heat to produce an inhalable aerosol from a liquid (e-liquid) composed mainly of humectants, nicotine, and ...

化学

A Microcontroller Operated Device for the Generation of Liquid Extracts from Conventional Cigarette Smoke and Electronic Cigarette Aerosol

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among adults. High quality, reproducible research on the consequences of electronic cigarette use is essential for understanding emerging public health concerns and crafting evidence based regulatory policy. While a growing number of papers discuss electronic cigarettes, there is little consistency in methods across groups and very little consensus on results. Here, we describe a programmable laboratory device that can be used to create extracts of conventional cigarette smoke and electronic cigarette aerosol. This protocol details instructions for the assembly and operation of said device, and demonstrates the use of the generated extract in two sample applications: an in vitro cell viability assay and gas-chromatography mass-spectrometry. This method provides a tool for making direct comparisons between conventional cigarettes and electronic cigarettes, and is an accessible entry point into electronic cigarette research.

Here, we describe a programmable laboratory device that can be used to create extracts of conventional cigarette smoke and electronic cigarette aerosol. This method provides a useful tool for making direct comparisons between conventional cigarettes and electronic cigarettes, and is an accessible entry point into electronic cigarette research.

マイクロ コント ローラーは従来のタバコの煙、電子たばこエアロゾル液体抽出物の世代のデバイスを運営

Electronic cigarettes are the most popular tobacco product among middle and high schoolers and are the most popular alternative tobacco product among ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

細胞毒性の評価と肺癌精密カット スライスで物質の免疫調節効果

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

免疫・感染学

Comparing the Effects of Electronic Cigarette Vapor and Cigarette Smoke in a Novel In Vivo Exposure System

Electronic cigarettes (E-cigarettes) are being widely used, and growing in popularity. It is estimated that more than 9 million adults use them regularly. The potential adverse health effects of electronic cigarette vapor (E-vapor) exposure are poorly defined. While several animal models of E-vapor exposure have been developed, few models expose rodents to clinically relevant quantities of nicotine and make direct comparisons to cigarette smoke within the same exposure system. Here, we present a method for constructing and operating an E-vapor chamber and cigarette smoke chamber. The chambers are constructed by outfitting anesthesia chambers with a computer controlled pumping system that delivers consistent amounts of E-vapor or cigarette smoke to rodents. Nicotine exposure is measured indirectly by quantifying pre and post-exposure serum cotinine levels. This exposure system can be modified to accommodate various types of E-cigarettes&#160;and tobacco cigarettes, and can be used to compare the effects of E-vapor&#160;and cigarette smoke in vivo.

Comparing the Effects of Electronic Cigarette Vapor and Cigarette Smoke in a Novel In Vivo Exposure System

This protocol describes a method for exposing rodents to electronic cigarette vapor (E-vapor) and cigarette smoke. Exposure chambers are constructed by modifying anesthesia chambers with an automated pumping system that delivers E-vapor or cigarette smoke to rodents. This system can easily be modified to accommodate many experimental endpoints.

電子たばこの蒸気とたばこの煙が小説に与える影響の比較<em&gt;インビボ</em&gt;露光システム

Electronic cigarettes (E-cigarettes) are being widely used, and growing in popularity. It is estimated that more than 9 million adults use them regularly. ...

Accessing the Cytotoxicity and Cell Response to Biomaterials

Biomaterials contact directly or indirectly with the human tissues, making it important to evaluate its cytotoxicity. This evaluation can be performed by several methods, but a high discrepancy exists between the approaches used, compromising the reproducibility and the comparison among the obtained results. In this paper, we propose a protocol to evaluate biomaterials cytotoxicity using soluble extracts, which we use for dental biomaterials. The extracts preparation is detailed, from pellets production to its extraction in a culture medium. The biomaterials cytotoxicity evaluation is based on metabolic activity using the MTT assay, cell viability using the Sulphorhodamine B (SBR) assay, cell death profile by flow cytometry, and cell morphology using May-Gr&#252;nwald Giemsa. Additional to cytotoxicity evaluation, a protocol to evaluate cell function is described based on the expression of specific markers assessed by immunocytochemistry and PCR. This protocol provides a comprehensive guide for biomaterials cytotoxicity and cellular effects evaluation, using the extracts methodology, in a reproducible and robust manner.

This methodology aims to evaluate biomaterial cytotoxicity through the preparation of soluble extracts, using viability assays and phenotypic analysis, including flow cytometry, RT-PCR, immunocytochemistry, and other cellular and molecular biology techniques.

生体材料に対する細胞毒性と細胞応答へのアクセス

Biomaterials contact directly or indirectly with the human tissues, making it important to evaluate its cytotoxicity. This evaluation can be performed by ...

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it is challenging to assess the contributions of individual constituents to its overall toxicity. Toxicological profiles of individual constituents as well as mixtures can be however established in vitro, by applying high through-put screening tools, which enable the profiling of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHCs) of tobacco smoke, as defined by the U.S. Food and Drug Administration (FDA).2
For an initial assessment, an impedance-based instrument was used for a real-time, label-free assessment of the compound&#39;s toxicity. The instrument readout relies on cell adhesion, viability and morphology that all together provide an overview of the cell status. A dimensionless parameter, named cell index, is used for quantification. A set of different staining protocols was developed for a fluorescence imaging-based investigation and a HCS platform was used to gain more in-depth information on the kind of cytotoxicity elicited by each HPHC.
Of the 15 constituents tested, only five were selected for HCS-based analysis as they registered a computable LD50 (&#60; 20 mM). These included 1-aminonaphtalene, Arsenic (V), Chromium (VI), Crotonaldehyde and Phenol. Based on their effect in the HCS, 1-aminonaphtalene and Phenol could be identified to induce mitochondrial dysfunction, and, together with Chromium (VI) as genotoxic based on the increased histone H2AX phosphorylation. Crotonaldehyde was identified as an oxidative stress inducer and Arsenic as a stress kinase pathway activator.
This study demonstrates that a combination of impedance-based and HCS technologies provides a robust tool for in vitro assessment of CS constituents.

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC

The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds.

有害と潜在的に有害な成分の毒性効果を評価するためにハイコンテントスクリーニング分析（HPHC）

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...

生物学

Analyzing the Effect of Tobacco Product Preparations on Cytokine Production via Intracellular Staining and Flow Cytometry

Source: Arimilli, S. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/52351">Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015)
This video demonstrates the effect of tobacco product preparations, TPPs, on cytokine production from human peripheral blood mononuclear cells using flow cytometry. Treatment of the cells with TPP downregulates the production of pro-inflammatory cytokines, which is estimated after lipopolysaccharide stimulation, followed by immunostaining and flow cytometry analysis.

細胞内染色およびフローサイトメトリーによるサイトカイン産生に対するタバコ製品調製物の影響の解析

Source: Arimilli, S. et al., Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations.&#160;J. Vis. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫学

免疫反応

免疫調節

An Assay to Measure Chemically-Induced Cytotoxicity in Human Precision-Cut Lung Slices

Source: Neuhaus, V. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/57042">Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2018)
This video illustrates a technique for evaluating cytotoxicity in human precision-cut lung slices through the WST-1 assay. Human precision-cut lung slices are subjected to incremental concentrations of a cytotoxic chemical to quantify their cytotoxicity. A decrease in color intensity serves as confirmation of the chemical&#39;s detrimental impact on lung cells.

ヒト精密切片肺切片における化学的に誘発される細胞毒性を測定するためのアッセイ

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. General Preparation of Human ...

可燃たばこ製品製剤の細胞毒性および免疫抑制を評価するための方法

要約

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この動画の章

エアー液界面におけるマウスの呼吸器上皮細胞と実験たばこの煙への暴露の分離

全体タバコ煙への器官型3D気管支及び鼻腔組織培養モデルの反復暴露の影響評価

第三世代機 Vaping デバイスによる電子タバコエアロゾルの生成: 毒性学的研究への応用

マイクロコントローラーは従来のタバコの煙、電子たばこエアロゾル液体抽出物の世代のデバイスを運営

細胞毒性の評価と肺癌精密カットスライスで物質の免疫調節効果

電子たばこの蒸気とたばこの煙が小説に与える影響の比較

生体材料に対する細胞毒性と細胞応答へのアクセス

有害と潜在的に有害な成分の毒性効果を評価するためにハイコンテントスクリーニング分析（HPHC）

細胞内染色およびフローサイトメトリーによるサイトカイン産生に対するタバコ製品調製物の影響の解析

ヒト精密切片肺切片における化学的に誘発される細胞毒性を測定するためのアッセイ

可燃たばこ製品製剤の細胞毒性および免疫抑制を評価するための方法

要約

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エアー液界面におけるマウスの呼吸器上皮細胞と実験たばこの煙への暴露の分離

全体タバコ煙への器官型3D気管支及び鼻腔組織培養モデルの反復暴露の影響評価

第三世代機 Vaping デバイスによる電子タバコ エアロゾルの生成: 毒性学的研究への応用

マイクロ コント ローラーは従来のタバコの煙、電子たばこエアロゾル液体抽出物の世代のデバイスを運営

細胞毒性の評価と肺癌精密カット スライスで物質の免疫調節効果

電子たばこの蒸気とたばこの煙が小説に与える影響の比較

生体材料に対する細胞毒性と細胞応答へのアクセス

有害と潜在的に有害な成分の毒性効果を評価するためにハイコンテントスクリーニング分析（HPHC）

細胞内染色およびフローサイトメトリーによるサイトカイン産生に対するタバコ製品調製物の影響の解析

ヒト精密切片肺切片における化学的に誘発される細胞毒性を測定するためのアッセイ

第三世代機 Vaping デバイスによる電子タバコエアロゾルの生成: 毒性学的研究への応用

マイクロコントローラーは従来のタバコの煙、電子たばこエアロゾル液体抽出物の世代のデバイスを運営

細胞毒性の評価と肺癌精密カットスライスで物質の免疫調節効果