The authors would like to thank Mr. Ryan Hart and Mr. Arriz Lucas for their invaluable feedback on this communication. This work was supported by NIH NINDS R01 NS065052 and Phoenix Children&#8217;s Hospital Mission Support Funds.

注：すべての手順は、アリゾナ大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）に準拠して実施しました。推奨される材料および機器のリストを 、 表1に見ることができます。 1.組織標本<ol><li>かん流<ol><li>ペントバルビタールナトリウム（25mgの/ kgのIP）の過剰摂取と齧歯類を安楽死させる、8 ml /分の流速で完全に放血（3-5分）まで、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で経灌流。徹底的灌流手順については、ゲージら2012 9を参照してください。 </li><li>即時/分で8ミリリットルの流速で15〜20分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒドで灌流することにより、組織を固定する、PBSフラッシュを以下。 </li><li> （順番に、15％、30％、30％と、生理食塩水緩衝トリスで調製した）傾斜スクロース溶液、続いて、24時間、4％パラホルムアルデヒド中で脳と場所を削除4℃。その後のスクロース溶液Oに脳を転送NLY脳の後、各溶液中に沈めました。注：通常、各溶液中の5日は、シンクする組織のために十分な時間です​​。 </li></ol></li><li>組織の凍結および凍結切片化<ol><li>このようなOCT化合物として、メディアを埋め込むには、脳を置き、-35℃の温度でイソペンタンに沈めます。脳は最低10分間凍結し、次いで-80℃で保存することができます。温度に勤勉が取られていない問題が発生する場合があります。トラブルシューティング情報を説明を参照してください。 </li><li> 20μmの厚さ、-20℃の温度で連続冠状断面をカットします。正に荷電したスライド上に組織を収集します。脳切片を-80℃でジップトップバッグと格納されている長期的に箔に包まれたスライドボックス内に配置することができます。ストレージのこの方法は、空気や霜への暴露を防止するために、二重の境界線を作成します。 </li></ol></li></ol> 2.組織処理注：例の機器や材料R染色のためにequiredは、図3に示されている。代替が利用可能である、しかしながら、これらの画像は、免疫組織化学的染色に新しいものの前に適切な購買アイテムを可視化するために役立ちます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig3highres.jpg" /> 図3：スライドは、箔のボックスをラップする必要がなく、光から保護されているように、免疫組織化学染色のために必要な例の項目（A）に示したブラックボックスは、免疫蛍光のための理想的な湿度室です。切片化後、スライドは、（B）に示すように黄色のボックスのボックスに保存することができます。ホイルでしっかり箱を包む前冷凍庫にジップトップバッグに配置すると、冷凍焼けから組織サンプルを保護するのに役立ちます。スライドの例は、E（異なる染色皿（D）に示されていると、（C）に示され</strong&gt;）。カバーガラスの厚さが1.2カバースリップは、ほとんど直立共焦点顕微鏡で撮影素晴らしい結果を提供する、大きさ及び厚さ（F）に変化することができます。このような（G）に示すような鉛筆スライドを標識するために使用することができます。インクを実行できるように恒久的なマーカーは、染色およびサンプルが何であるかを決定する能力の両方に影響を与え、避けるべきです。それは（H）に示すようなミニPAPペンは撥境界がスライド上に描画することが可能になります。 <ol><li>スライドの準備<ol><li>室温で冷凍庫と解凍からスライドを削除します。 <ol><li>オプション：セクションは、以前はスライドから浮いている場合は、スライドをオフに浮遊からの組織切片を防ぐためにこれ以上の4以上時間60℃のオーブン中で解凍したスライドを配置します。 </li></ol></li><li>スライドラックとそれに対応する皿にスライドを配置します。 </li><li>洗浄は、洗浄の間に溶液を変え、5分ごとに、PBSで3回スライドします。前進このステップから、sectiを回避長期間のための液体を取り付けずにONS。注意：セクションが乾燥した場合、バックグラウンド染色が増加し、意味のあるデータを確実に得ることができません。 </li></ol></li><li>組織染色<ol><li>光を通さない染色ボックスで、脱イオン水で浸したリントフリー組織と「湿度室」を作成。 </li><li>離れた組織切片から、スライドの非常にエッジに撥液性の境界線を作るためのミニPAPペンを使用し、糸くずの出ない組織とスライドの端を乾燥させます。この境界線は、液体のメニスカスと、その表面張力は染色に影響を与えないように、組織の縁部との間に十分なスペースを確保する必要があります。 注：目的の抗体は、マイクロ波抗原検索を必要としない場合は、PAPペン撥ボーダー前2.1.3に適用することができます。 PAPペンをPBS中で洗浄する前に適用されている場合は、撥液性の境界の整合性は、この段階でチェックする必要があります。国境のギャップを埋めるためにミニPAPペンを使用してください。 </li><liスライドを水平に配置して&gt;、ブロック非特異的抗原は、PBS（ブロッキング溶液）中の4％（v / v）の血清中でインキュベートすることにより結合します。室温で1時間のために、スライド当たりブロック溶液をピペットを300μl。ブロック·ソリューションは、スライドの端のPAPのペンに延びており、完全に組織の近くに表面張力によって引き起こされる不均一な染色を避けるために、組織をカバーしていることを確認します。 <ol><li>二次抗体が作られているのと同じ種からの血清を使用してください。注：この手順では、二次抗体は、ロバで行われ、したがって、ロバ血清が使用されます。二つ以上の異なる種に由来する二次抗体を使用する場合は、それぞれの種からの血清を含みます。 </li></ol></li><li>スライド上に一次抗体をピペット。注：この染色のための抗体の濃度が1で最適化されています：5000および1：それぞれIBA1とパン神経500、。これらの濃度は、バックグラウンド染色が存在しないと意味のある染色を示すことが見出されています。 <ol><li>にブロック溶液を希釈1％のPBS中の血清および一次抗体を追加します。スライドごとに1％の血清中の一次抗体溶液を300μlをピペット。ここでも、流体は、PAPペンの端にあることを確認してください。 4℃で一晩インキュベートします。 </li><li> IBA1も汎神経も抗体を含有するもの、汎神経抗体なしIBA1と1、およびIBA1なしの汎神経抗体と1：3つの制御スライドを含めます。しかし、二次抗体の非特異的結合をテストするために、一次抗体を省略し、同じソリューションと同じ実行中にこれらのスライドを染色します。 </li></ol></li><li>翌朝、洗浄は洗浄の間に溶液を変更し、5分ごとに、PBSで3回スライドさせます。 </li><li>蛍光抗体は前進このステップから、黒や暗所でインキュベートされているか、洗浄容器が箔とのハイブリダイゼーションボックスに包まれて保証することにより、露光量を最小限に抑えるため、光に敏感です。すべてのスライドに適切な二次抗体をピペットインキュベート光を通さない「湿度室」のブロック溶液中の250（ステップ2.2.3を参照）（ステップ2.2.1を参照してください）​​：1の濃度で室温で60分。 <ol><li>波長の異なる二次抗体を使用してください。ここでは、一次抗体ウサギ抗IBA1ために、適切な二次抗体としてロバ抗ウサギ594を使用しています。一次抗体マウス抗パン神経については、適切な二次抗体としてロバ抗マウス488を使用しています。あるいは、抗ウサギ488及び抗マウス594を使用しています。 </li></ol></li><li>洗浄は、5分ごとに、PBSで3回スライドします。 </li><li>オプション：核染色を行います。 <ol><li>正確に60秒間の二重蒸留H 2 0で0.03μg/ mlの濃度でヘキストに入れ（または他の核染色）。 </li><li>洗浄は、5分ごとに、PBSで3回スライドします。 </li></ol></li><li>のddH 2 0で洗浄します。 </li></ol></li><li>カバースリップ<ol><li>このようなフルーア水性マウント媒体とカバーガラススライド、omount-GまたはProlongGold。綿棒を使用して、すべての気泡を除去するように注意してください。 注：他の取り付け剤を使用することができた、しかし高ブリードスルー色素間は、カバースリップの日以内に、いくつかのことで注目されています。 </li><li>蒸発による乾燥からセクションを防止、エッジをシールするために透明なマニキュアを使用してください。スライドは平坦では室温に放置し、その後、4℃でホイルで包み遮光容器に保管しながらマニキュアは遮光容器に乾燥することができます。 </li></ol></li></ol> 3.ステンド組織を画像<ol><li>顕微鏡検査<ol><li>暗い部屋で行われるべき、マニキュアは、顕微鏡検査を開始する前に少なくとも1時間乾燥することができます。 </li><li>蛍光光源とデジタルカメラアタッチメントと共焦点や研究顕微鏡を用いて顕微鏡写真を取得します。付属のソフトウェアを使用して、各波長の露光設定 - 405、488、594 - 別途。注：徹底的イメージング命令は顕微鏡メーカーからオンラインで利用可能であるべきです。 </li><li>セクションを移動したり、フォーカスを調整することなく、各チャネルの顕微鏡写真を取得します。カラーの画像を取るか、または交互にグレースケールで、その後色に変換します。 注意：色または各チャンネルからグレースケール画像を後処理にまとめることができます。 </li><li>セクションの光退色が発生するように、組織切片を長時間、周囲光や顕微鏡の光にさらされないことを確認してください。これを避けるために、増大する光/レーザー強度ではなく、露光時間を増加させます。 </li><li>オンされてから30分以内に蛍光光源をオフにしないでください。 注：立て続けにオンとオフのソースを切り替えるには、蛍光灯の寿命が低下することがあります。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Marrack, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+antigens+and+antibodies.">Chemistry of antigens and antibodies.</a> Nature. 134, 468-469 (1934).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demonstration+of+pneumococcal+antigen+in+tissues+by+the+use+of+fluorescent+antibody.">The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody.</a> J Immunol. 45, 159-170 (1942).</li><li>Marshall, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+adrenocorticotropic+hormone+by+histochemical+and+immunochemical+methods.">Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods.</a> The Journal of experimental medicine. 94, 21-30 (1951).</li><li>Mellors, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemical+demonstration+of+the+in+vivo+localization+of+antibodies:+antigenic+components+of+the+kidney+and+the+pathogenesis+of+glomerulonephritis.">Histochemical demonstration of the in vivo localization of antibodies: antigenic components of the kidney and the pathogenesis of glomerulonephritis.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 3, 284-289 (1955).</li><li>Nakane, P. K., Pierce, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-labeled+antibodies:+preparation+and+application+for+the+localization+of+antigens.">Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).</li><li>Avrameas, S., Uriel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+antigen+and+antibody+labelling+with+enzymes+and+its+immunodiffusion+application.">Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application.</a> Comptes rendus hebdomadaires des seances de l'Academie des sciences. Serie D: Sciences naturelles. 262, 2543-2545 (1966).</li><li>Cuello, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunohistochemistry. , (1983).</li><li>Junqueira, L. C. U., Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Junqueira's basic histology : text and atlas. , (2013).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).</li><li>Christensen, N. K., Winther, L., Kumar, G. L., Rudbeck, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Education Guide: Immunohistochemical (IHC) staining methods. , 103-108 (2009).</li><li>Wang, G., Achim, C. L., Hamilton, R. L., Wiley, C. A., Soontornniyomkij, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyramide+signal+amplification+method+in+multiple-label+immunofluorescence+confocal+microscopy).">Tyramide signal amplification method in multiple-label immunofluorescence confocal microscopy).</a> Methods. 18, 459-464 (1999).</li><li>Feldengut, S., Del Tredici, K., Braak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraffin+sections+of+70-100+mum:+a+novel+technique+and+its+benefits+for+studying+the+nervous+system.">Paraffin sections of 70-100 mum: a novel technique and its benefits for studying the nervous system.</a> Journal of neuroscience methods. 215, 241-244 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

この通信の全体的な目標は、読者に、免疫組織化学の手順を導入することでした。このため、IBA1とパン神経抗原と二重標識の例は、ミクログリアおよび灌流パラホルムアルデヒド中でニューロンを観察するために、スクロース凍結保護、凍結切片ラットの脳を使用しました。 この技術は、無限の目的を果たすように構成することができます。脳、肺、肝臓、腎臓および?...

<html>免疫組織化学は、目的の抗原に特異的に結合する一次抗体を用いて、組織切片中の抗原（ すなわち、タンパク質）を検出するための処理です。免疫組織化学は、彼は抗体が大きな特異性1と抗原を局所化できることを決定し1934年にJR Marrackによって開拓されました。 1942年に始まって、免疫組織化学を可視化する蛍光抗体を用いた研究in vitroでの最初の一部は、 生体組織化学的研究では 、まず、4を発表した後の2,3を 、発表されました。 1960年代の間に、三十年免疫組織化学的方法の開始後に、酵素標識抗体を二次試薬として使用されるようになりました。これらの方法は、同時に独立し、フランスと米国の5,6に開発されました。今日では、抗体の広い配列は、免疫組織化学研究の7のための無限の可能性を提供します。 &quot;&gt;この対応の全体的な目標は、免疫組織染色への簡単な紹介を提供することにある。それは、この技術の包括的かつ徹底的な見直しとなるものではありません概説した方法では、2つの抗原のための免疫組織化学的技術は、ミクログリアのために（マーカーを提示しています。パラホルムアルデヒド灌流、スクロース凍結保護、凍結切片ラットの脳の染色のためのニューロン）。免疫組織化学染色は、バックグラウンド染色を低減するために非特異的抗原を遮断することから始まる。次に、一次抗体とのインキュベーションは、組織内の特定の抗原に結合することができます。一次抗体に続いて、別の抗体、二次抗体と呼ばれる、共役可視化信号8に一次抗体をリンクするために適用される。二次抗体は、一次抗体が発生された種に特異的な免疫グロブリンG（IgG）ドメインを標的とする。二次抗体は、シグナルを増幅します一次抗体のTののFab領域のため、彼一次抗体のIgGのドメイン上の複数のサイトへの二次抗体に結合します。二次抗体のF C領域に結合させ、酵素または蛍光分子は、可視化を可能にします。例えば、ウサギ抗IBA1一次抗体はIBA1に特異的なウサギIgG分子です。ロバ抗ウサギIgGを二次抗体として適用した場合、それを認識し、ウサギ抗IBA1 IgGの複数の領域（ 図1参照）に結合します。ロバ抗体は、種々の方法によって可視化することができます。この対応は、蛍光顕微鏡により可視化するために、一次抗体を認識する二次抗体にコンジュゲート蛍光団の検出に焦点を当てています。蛍光免疫組織化学では、例えば、ヘキスト又はDAPIなどの核染色はすべての核を可視化するために使用することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig1highres.jpg" /> 図1：のSch直接対間接的な抗体の標識技術のematic表現抗体は、目的の抗原に結合し、一次抗体の種に対して惹起二次抗体によって増幅することができます。この技術は、増幅およびDAB可視化のための（A）、または直接結合蛍光二次抗体（B）は、アビジン-ビオチン複合体（ABC）を用いて行うことができます。あるいは、一次抗体を直接ビオチンまたは蛍光団（C）を含む多くの異なるタグを用いて結合させることができる。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52293/52293fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> 免疫組織化学的染色を視覚化するための別の方法は、（DAB、 図1および図2を参照）3,3&#39;-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライドを使用しています。これは、ビオチン化を用いて、蛍光とは異なる、または明視野顕微鏡下に表示されている沈殿物にDABを変換する酵素を提供するホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）結合二次抗体。単一の抗原に関心があるか、染色が長く持続することが要求される事例では、DABは、蛍光染色よりも適切な場合があります。しかし、DAB染色は、2つの核抗原が注目されている場合は特に、複数のマーカーの間の区別には適していません。 DAB材料およびプロトコルの変更については、 表1を参照してください。代わりに、ニトロブルーテトラゾリウムクロリド/ 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート（NBT / BCIP）は、アルカリホスファターゼ（AP）を可視化するために用いることができる共役二抗体。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig2highres.jpg" /> 図2：ニッケル強化DAB単一標識ラット脳組織切片の代表的な画像ラット脳SEIBA1用ニッケル強化DAB（A）で標識し、汎神経されctions（B）は、単独でミクログリアまたは神経細胞の長期的な分析を可能にします。スケールバーは20μm。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/52293/52293fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> 一つは、分析されている組織内の目的の抗原の推定豊かさを考慮する必要があります。間接的な方法には​​、（上記のように）低量と目標のために有用です。目的の抗原が多量である場合、直接法を適用することができます。直接法は、直接可視化信号に結合している一次抗体を伴う、したがって、二次抗体は必要ありません。この方法は、染色プロセスを簡略化するが、間接的な方法によって達成増幅を排除します。直接結合一次抗体を使用すると、二次抗体の交差反応性を排除しますときに二重標識。 この通信は、IBA1とパンニューロン（ 表1の詳細）で二重標識のためのプロトコルの詳細について説明します。 IBA1は分岐し、ハイパー分岐し、活性化され、アメーバ状、及びロッドを含む多くの活性化状態において、ミクログリアを染色します。汎神経汚れ神経の軸索、樹状突起、およびソーマ。 IBA1が最もミクログリアとパン神経標的ニューロンを染色するので、汚れのこの組み合わせは、ミクログリア - ニューロン相互作用の広範な理解を得るのに有用です。 要するに、免疫組織化学染色は、抗体の慎重な選択に依存しています。調査の質問は、より具体的になるように、代替の抗原に対して惹起された抗体が所望され得ます。特定のミクログリアの活性化状態をターゲットとするためには、むしろIBA1よりも、CD45またはCD68抗体を使用することを選択することができます。また、マウスでの作業中に、F4 / 80は、必要な結果を提供することができます。同様に、神経細胞の要素は、具体的には、抗体のRAで標的とすることができます核に対するised、シナプス（前または後）、軸索と成長円錐。さらに、ニューロン（ダブルコルチン、のNeuN）の年齢を区別する他のマーカー、および神経再生（GAP-43）があります。

<table><tbody><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-034-979</td><td>Used for tissue mounting (1.2.2)</td></tr><tr><td>Oven</td><td>Thermo Scientific</td><td>51028112</td><td>Used for tissue drying (2.1.1)</td></tr><tr><td>Mini Pap pen</td><td>Life Technologies</td><td>00-8877</td><td>Used in step 2.2.2</td></tr><tr><td>Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-149-429</td><td>Used for all washes during staining (2.2), as well as the Hoechst step (2.2.8)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A</td><td>Used for drying slides (2.2)</td></tr><tr><td>Black Staining Box</td><td>Ted Pella</td><td>21050</td><td>Used for blocking and staining steps (2.2)</td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-413-253</td><td>Used for block and antibody incubation (2.2)</td></tr><tr><td>Mouse &amp;alpha;-Pan-neuronal</td><td>Millipore</td><td>MAB2300</td><td>Used for primary antibody (2.2.4)</td></tr><tr><td>Rabbit &amp;alpha;-Iba1</td><td>Wako Chemical</td><td>019-19741</td><td>Used for primary antibody (2.2.4)</td></tr><tr><td>Donkey &amp;alpha;-rabbit 594</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-585-152</td><td>Used for secondary antibody (2.2.6)</td></tr><tr><td>Donkey &amp;alpha;-mouse 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-545-150</td><td>Used for secondary antibody (2.2.6)</td></tr><tr><td>Caterer&#039;s foil</td><td>Any</td><td>N/A</td><td>Used in steps 1.2.2 and 2.3.2</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Used for coverslipping (2.2.8)</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td>Used for coverslipping (2.2.8)</td></tr><tr><td>Clear Nail Polish&amp;nbsp;</td><td>Any</td><td>N/A</td><td>Used for coverslipping (2.2.8)</td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal)</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Used for imaging (3)</td></tr><tr><td>Axioskop A2</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Used for imaging (3)</td></tr><tr><td>CitriSolv&amp;nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td></td><td>For DAB protocol</td></tr><tr><td>ABC</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td>For DAB protocol</td></tr><tr><td>DAB Peroxidase kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>For DAB protocol</td></tr><tr><td>Biotinylated horse &amp;alpha;-rabbit IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1100</td><td>For DAB protocol</td></tr><tr><td>Biotinylated horse &amp;alpha;-mouse IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-2001</td><td>For DAB protocol</td></tr><tr><td>30% Hydrogen Peroxide</td><td>FisherScientific</td><td>H325-500</td><td>For DAB protocol</td></tr><tr><td>Wheaton slide racks and staining dishes</td><td>TedPella</td><td>21043</td><td>For DAB protocol</td></tr><tr><td>Masterflex perfusion pump and tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>Used for perfusion (1.1.1 and 1.1.2)</td></tr><tr><td>Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td>Used for tissue freezing (1.2.1)</td></tr><tr><td>Thermometer (-50 to 50 C)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-059-228</td><td>Used for tissue freezing (1.2.1)</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>CM3500S</td><td>Used for tissue sectioning (1.2.2)</td></tr><tr><td>Staining Dish, Plastic with 2 Lids</td><td>Grale Scientific</td><td>353</td><td>For antigen retrival</td></tr><tr><td>20 Place Staining Rack, Slides Horizontal</td><td>Grale Scientific</td><td>354</td><td>For antigen retrival</td></tr><tr><td>Microwave</td><td>Any</td><td>N/A</td><td>For antigen retrival</td></tr></tbody></table>

primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons

免疫組織化学は、 その場での抗原の存在、位置、および相対的な存在量を検出するために広く用いられている技術です。この入門レベルのプロトコルは、試薬、装置、一例として、ミクログリアおよび神経要素のためのマーカーを用いて、げっ歯類の脳組織の免疫組織化学的染色を完了するために必要な技術を記載しています。具体的には、本論文では、それぞれIBA1と汎神経、免疫組織化学のために介してミクログリアと神経細胞の蛍光可視化するためのステップバイステップのプロトコルです。蛍光二重標識は、正確な細胞型、受容体、リガンドの間の相互作用を観察する機会を提供し、同じ試料中の複数のタンパク質の局在化のために特に有用であり、及び/又は互いにならびにタンパク質共に関連する細胞外マトリックス単一細胞内の局在。他の可視化技術とは異なり、蛍光免疫組織化学染色の強度が低下することがで適切な予防措置が取られない限り、染色後数週間​​から数ヶ月。蛍光はより多くの時間が効率的であり、2つ以上の間でより正確な区別を可能にするように、この制限にもかかわらず、多くの用途において蛍光二重標識は、3,3&#39;-ジアミノベンジジン四塩酸塩（DAB）またはアルカリホスファターゼ（AP）などの選択肢よりも好ましいですマーカー。議論は成功を促進するために、トラブルシューティングのヒントやアドバイスが含まれています。

この染色プロトコルミクログリア蛍光594チャネル（赤）で標識されているラット脳組織切片をもたらし、488チャンネルで標識されたニューロン（緑は、 図4を参照します）。核染色が行われた場合には、チャネル405（青）で表示されます。画像は、異なるチャネルに取り、3つのチャネルの直接比較のために重ね、または2つのチャンネル間ことができます。多くのデジタル取得ソ?...

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Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

ミクログリアとニューロンのための例染色：凍結切片ラット脳組織の免疫組織化学のためのプライマー

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

31.9K ビュー.  University of Arizona College of Medicine - Phoenix. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example. 

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Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

免疫電子顕微鏡のためのマウスの脳組織の準備

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

神経科学

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

ラット中枢神経系および末梢リンパ節の組織切片での免疫組織化学的解析

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Immunostaining of Biocytin-filled and Processed Sections for Neurochemical Markers

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing patterns. The inclusion of biocytin/neurobiotin in the recording electrode permits post-hoc recovery of morphological details, which are necessary to determine the dendritic arborization and the regions targeted by the axons of the recorded neurons. However, given the presence of morphologically similar neurons with distinct neurochemical identities and functions, immunohistochemical staining for cell-type-specific proteins is essential to definitively identify neurons. To maintain network connectivity, brain sections for physiological recordings are prepared at a thickness of 300 &#181;m or greater. However, this thickness often hinders immunohistological postprocessing due to issues with antibody penetration, necessitating the resectioning of the tissue. Resectioning of slices is a challenging art, often resulting in the loss of tissue and morphology of the cells from which electrophysiological data was obtained, rendering the data unusable. Since recovery of morphology would limit data loss and guide in the selection of neuronal markers, we have adopted a strategy of recovering cell morphology first, followed by secondary immunostaining. We introduce a practical approach to biocytin filling during physiological recordings and subsequent serial immunostaining for the recovery of morphology, followed by the restaining of sections to determine the neurochemical identity. We report that sections that were filled with biocytin, fixed with paraformaldehyde (PFA), stained, and coverslipped can be removed and restained with a second primary antibody days later. This restaining involves the removal of the coverslip, the washing of sections in a buffer solution, and the incubation of primary and secondary antibodies to reveal the neurochemical identity. The method is advantageous for eliminating data loss due to an inability to recover morphology and for narrowing down the neurochemical markers to be tested based on morphology.

This protocol presents a method for the morphological recovery of neurons patched during electrophysiological recordings using biocytin filling and subsequent immunohistochemical postprocessing. We show that thick biocytin-filled sections that were stained and coverslipped can be restained with a second primary antibody days&#160;or months later.

神経化学的マーカーのためのビオシチンで満たされたと加工セクションの免疫染色

Electrophysiological recordings of cells using the patch clamp technique have allowed for the identification of different neuronal types based on firing ...

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia selectively), when combined with IBA1 (which provides an exceptional visualization of their morphology), allows investigation of changes in density, distribution, and morphology. Quantifying these parameters is important in providing insights into the roles exerted by microglia, the resident macrophages of the brain. Under normal physiological conditions, microglia are regularly distributed in a mosaic-like pattern and present a small soma with ramified processes. Nevertheless, as a response to environmental factors (i.e., trauma, infection, disease, or injury), microglial density, distribution, and morphology are altered in various manners, depending on the insult. Additionally, the described double-staining method allows visualization of infiltrating macrophages in the brain based on their expression of IBA1 and without colocalization with TMEM119. This approach thus allows discrimination between microglia and infiltrating macrophages, which is required to provide functional insights into their distinct involvement in brain homeostasis across various contexts of health and disease. This protocol integrates the latest findings in neuroimmunology that pertain to the identification of selective markers. It also serves as a useful tool for both experienced neuroimmunologists and researchers seeking to integrate neuroimmunology into projects.

This protocol describes a step-by-step workflow for immunofluorescent costaining of IBA1 and TMEM119, in addition to analysis of microglial density, distribution, and morphology, as well as peripheral myeloid cell infiltration in mouse brain tissue.

マウス脳における微小グリア密度、形態および末梢骨髄細胞浸潤解析のためのIBA1およびTMEM119を用いた免疫蛍光染色

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

免疫・感染学

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study of neuroscience as cellular function is determined by the composition and activity of cellular proteins. In this article, we describe how immunocytochemistry can be combined with near-infrared high-resolution scanning to provide a semi-quantitative measure of protein expression in distinct brain regions. This technique can be used for single or double protein expression in the same brain region. Measuring proteins in this fashion can be used to obtain a relative change in protein expression with an experimental manipulation, molecular signature of learning and memory, activity in molecular pathways, and neural activity in multiple brain regions. Using the correct proteins and statistical analysis, functional connectivity among brain regions can be determined as well. Given the ease of implementing immunocytochemistry in a laboratory, using immunocytochemistry with near-infrared high-resolution scanning can expand the ability of the neuroscientist to examine neurobiological processes at a systems level.

Here, we present a protocol that uses near-infrared dyes in conjunction with immunohistochemistry and high-resolution scanning to assay proteins in brain regions.

げっ歯類の脳におけるタンパク質発現を測定するために近赤外蛍光と高解像度走査を用いること

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

Investigating Drivers of Antireward in Addiction Behavior with Anatomically Specific Single-Cell Gene Expression Methods

Increasing rates of addiction behavior have motivated mental health researchers and clinicians alike to understand antireward and recovery. This shift away from reward and commencement necessitates novel perspectives, paradigms, and hypotheses along with an expansion of the methods applied to investigate addiction. Here, we provide an example: A systems biology approach to investigate antireward that combines laser capture microdissection (LCM) and high-throughput microfluidic reverse transcription quantitative polymerase chain reactions (RT-qPCR). Gene expression network dynamics were measured and a key driver of neurovisceral dysregulation in alcohol and opioid withdrawal, neuroinflammation, was identified. This combination of technologies provides anatomic and phenotypic specificity at single-cell resolution with high-throughput sensitivity and specific gene expression measures yielding both hypothesis-generating datasets and mechanistic possibilities that generate opportunities for novel insights and treatments.

The combination of laser capture microdissection and microfluidic RT-qPCR provides anatomic and biotechnical specificity in measuring the transcriptome in single neurons and glia. Applying creative methods with a system's biology approach to psychiatric disease may lead to breakthroughs in understanding and treatment such as the neuroinflammation antireward hypothesis in addiction.

解剖学的に特異的な単一細胞遺伝子発現法による依存行動における反報酬の要因の調査

Increasing rates of addiction behavior have motivated mental health researchers and clinicians alike to understand antireward and recovery. This shift ...

<meta charset="utf8"></head><body>ラットMCAO脳卒中モデルにおける細胞死を研究するための免疫蛍光染色

Evaluating Cell Death Signaling by Immunofluorescence in a Rat Model of Ischemic Stroke

Stroke is a leading cause of death and disability worldwide. Most cases of stroke are ischemic and result from the occlusion of the middle cerebral artery (MCA). Current pharmacological approaches for the treatment of ischemic stroke are limited; therefore, novel therapies providing effective neuroprotection against ischemic injury following stroke are urgently needed. In the brain tissue following ischemic stroke, the area of the ischemic penumbra is salvageable but at risk of progressing to irreversible damage. The penumbral area surrounding the infarcted core is a conceptual target for neuroprotection. Since the blood flow is partially maintained in the penumbral area, neuronal and non-neuronal cells in this area transiently survive after stroke, and these cells that are still viable may be rescued by appropriate medical interventions. Understanding the pathophysiology of the penumbra is important in the development of neuroprotective therapies because the cell death pathways activated in the ischemic penumbra may indicate therapeutic targets, such as RUNX1 and cathepsins. These protein targets functioning as mediators of programmed cell death can be further exploited in translational research. With moderate size and similarity to the human brain, the in vivo rat model of MCA occlusion (MCAO) mimics the human ischemic stroke and offers an applicable tool to investigate the penumbral pathology, examine the cell death signaling, and evaluate the effects of potential targets in the context of MCAO. Here, we describe how to induce MCAO in rats and how to perform immunofluorescence staining for the detection of cell death signaling in the rat brain following MCAO.

<meta charset="utf8"></head><body>虚血性脳卒中のラットモデルにおける免疫蛍光法による細胞死シグナル伝達の評価

Rat in vivo models are indispensable tools to investigate the pathological mechanisms and therapeutic targets for ischemic stroke. This work will describe performing immunofluorescence staining in infarcted brain slices following middle cerebral artery occlusion (MCAO) in rats.

虚血性脳卒中のラットモデルにおける免疫蛍光法による細胞死シグナル伝達の評価

Stroke is a leading cause of death and disability worldwide. Most cases of stroke are ischemic and result from the occlusion of the middle cerebral artery ...

Immunohistochemical Staining of Rat Coronal Tissue Cryosections for Microglia and Neurons

<a href='https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/52293/primer-for-immunohistochemistry-on-cryosectioned-rat-brain-tissue'>Source: Evilsizor, M. N., et. al., Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons. J. Vis. Exp. (2015)</a>This video demonstrates a step-by-step immunohistochemistry staining procedure on cryosectioned rat brain tissue to visualize the spatial arrangement of microglia and neurons.

Source: Evilsizor, M. N., et. al., Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons. J. Vis. ...

ミクログリアとニューロンのための例染色：凍結切片ラット脳組織の免疫組織化学のためのプライマー

要約

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免疫電子顕微鏡のためのマウスの脳組織の準備

ラット中枢神経系および末梢リンパ節の組織切片での免疫組織化学的解析

神経化学的マーカーのためのビオシチンで満たされたと加工セクションの免疫染色

マウス脳における微小グリア密度、形態および末梢骨髄細胞浸潤解析のためのIBA1およびTMEM119を用いた免疫蛍光染色

げっ歯類の脳におけるタンパク質発現を測定するために近赤外蛍光と高解像度走査を用いること

解剖学的に特異的な単一細胞遺伝子発現法による依存行動における反報酬の要因の調査

虚血性脳卒中のラットモデルにおける免疫蛍光法による細胞死シグナル伝達の評価

虚血性脳卒中のラットモデルにおける免疫蛍光法による細胞死シグナル伝達の評価

虚血性脳卒中のラットモデルにおける免疫蛍光法による細胞死シグナル伝達の評価

Immunohistochemical Staining of Rat Coronal Tissue Cryosections for Microglia and Neurons