Name: 3-d imaging and analysis of neurons infected in vivo with toxoplasma gondii
Uploaded: 2014-12-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
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我々は有用な議論のための全体Koshyラボを感謝。私たちは、イメージングとのアドバイスや助けをパティジャンスマとアリゾナ大学の神経科学省に感謝します。我々はまた、彼らのビブラトームを使用するためのPorrecaラボに感謝。この研究は、米国国立衛生研究所（NIH NS065116、AAK）によってサポートされていました。

注：マウスは、アリゾナ大学で食物および水を自由摂取との明/暗サイクルを逆に飼育し、12時間と温度及び湿度制御された部屋で維持した。実験はガイドラインとアリゾナ大学の制度的動物実験委員会の承認の下で行った。すべての努力は、苦痛を最小限にするために行われた。のCreレポーターマウスは、C57BL / 6バックグラウンド11上にあり、商業的に入手可能である。 1.マウスの感染注： - 12 トキソプラズマ後述でマウス感染の方法は、以前に10を発表された研究で使用されている。 <ol style="margin-left: 40px;"><li>ヒト包皮線維芽細胞におけるトキソプラズマ株を成長ダルベッコ高グルコース中で培養（HFFS）がイーグル培地（DMEM）、10％FBS、100 U / mlのペニシリン、100mg / mlのストレプト変形omycin、および2mM L-グルタミン（CDMEM）、5％CO 2インキュベーター内部にT-25フラスコ中の寄生虫は、大きな寄生虫液胞を形成するまで。 </li><li>フラスコの底から細胞を掻き取り、フラスコの内側の3mlシリンジに接続された25ゲージの針に2回得られた溶液を通過させることによって、シリンジ放出寄生虫は、その27ゲージの針に接続された5ミリリットルの注射器の場合に、すべてのソリューションを転送する逆さまの15mlコニカルチューブ内部に配置されている。注射器にプランジャーを接続し、コニカルチューブに寄生虫ソリューションを渡す。 </li><li>遠心分離機300×gで10分間チューブ。上清はその後4〜6ミリリットルの滅菌USPグレード1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）pHが7.4（原液）にペレットを再懸濁吸引除去する。 </li><li>ストック溶液の10μLの血球計数器をセットし、寄生虫はミドル大きな正方形の四隅と中央の正方形で寄生虫の数をカウント後、決済するために5〜10分待ちます。 </li><li>パラを希釈100K /200μlの1×PBSの適切な接種サイズのサイトは、その後200μlの総容量で腹腔内（IP）をマウスに注射する。 注：この手順では、マウスを100KタイプIII（CEP）200μlの1×PBSで13タキゾイトを接種した。トキソプラズマの他の株をマウスに感染させる場合には、接種物の濃度は、毒性のレベルを考慮して調整される必要があり得る。 </li></ol> 2.灌流および脳収穫注：これはシストのピーク数がマウスの脳に見出されるが、他の時点が使用される時点を表すように、このプロトコルは、21日後に感染数（dpi）で行った。 17 -サイズ、数、位置、および嚢胞の有無マウス系統、寄生虫株型、ならびに接種サイズ7,14を含む多くの要因に依存する。調べでは、個別に、マウスとToxoplasのための適切な接種材料を決定する必要がありますMA株は彼/彼女が使用しています。 <ol style="margin-left: 40px;"><li>セットアップすべての手術収穫ツール（ 図1）。 </li><li>各マウスについて、準備し、氷上に保つ：1X無菌のUSPグレードPBS（ヘパリン/生理食塩水）で0.9％の塩化ナトリウム（NaCl）を+ 10 U / mlのヘパリンで満たされた20mlの注射器。 4％パラホルムアルデヒド（PFA）を充填した20mlの注射器。 15ミリリットル、4％PFAでシンチレーションバイアル。複数のマウスの場合、各灌流のためのソリューションの完全な新鮮な注射器を策定した後、全てのマウスに必要な各溶液の全体量を満たしたビーカーを準備します。 </li><li>興味のある日に200μL/ケタミン/キシラジンのカクテルの体重の25グラム（24 mg / mlの＆4.8 mg / mlのそれぞれ）で、マウスの腹腔内麻酔。つま先ピンチ反射をチェックすることによって、麻酔のレベルのためのマウスを監視します。マウスがしっかりとつま先のピンチへの応答を示していないだけで、一度プロトコルを続行します。 注：麻酔の適切なレベルが前に到達するように、麻酔の他の方法があればよいプロトコルを進める。 </li><li>カバーされたフォームプラットフォーム上仰臥位でマウスを置きます。その後、70％エタノール（EtOH）（ 図2A）と胸部と腹部をスプレー足元にすべての4つの手足をピン。マウスの下のいくつかの滅菌ペーパータオルの添加は、灌流液のオーバーフローを吸収助けるために使用することができる。 </li><li>その後切開を作るためにハサミを使用してピンセットでちょうど胸骨下の皮膚を持ち上げます。胸（ 図2B）を露出するために皮膚を引き戻す。 </li><li>剣状突起を持ち上げて、ちょうど横隔膜下の腹部切開を行い、ぶっきらぼうに、振動板から離れて解剖された肝臓を露出させる。 2切開、左側の1と絞りを右肋骨の底に1を加えます。その後胸腔（ 図2C）を開くために戻って反映されている胸郭、約1 / 2-2 / 3の方法が左と右の切開を拡張します。 注：すべての臓器や主要な血管デュをカットしないように注意してください灌流の品質を損なうなりそうとして、この手順を鳴らす。 </li><li> 10〜20ミリリットル4％PFAに続く10〜20ミリリットルヘパリン/生理食塩水で経灌流。 注：灌流が適切に行われた場合、肝臓は赤から黄褐色（ 図2D）に変わります。適切に行われない場合は、血管が目に見える（ 図2E）となる。 </li><li>その腹部の上にマウスを裏返し、再びピンの足は、70％EtOHで頭と首をスプレー。首の付け根から肌を持ち上げて、切開する。頭蓋骨（ 図2F）を露出するために皮膚を削除します。肩のレベルで頭を首を切る。頭蓋骨を外し、静かに脳を削除し、4％PFA（ 図2G-H）で満たされたシンチレーションバイアルに配置します。 注：よく灌流した場合、脳は目に見える血管（ 図2I）と白表示されます。脳が十分に灌流されていない場合は、血管が目に見える（ 図2J）となる。 </li><li> Scintillaのを置きます4℃で4％PFA中脳とションバイアルを一晩、光から覆った。非USPグレード1X PBS中に脳をすすぎ、チルド1×PBSで満たされた新しいシンチレーションバイアルに移す。光からカバーし、4℃で1×PBS中の脳を、保管してください。 注：成功清算およびイメージングは​​、最大1ヶ月1X PBS中に保存セクションで達成されてきたが、PBSで長期保存がPFA固定を逆にすると、最適な画像を以下につながる可能性としては、数日以内に脳セクションに最適です。自家蛍光の増加ブラーは1ヶ月以上のための1×PBSで貯蔵した後に画像化され、いくつかのセクションに記載されています。 </li></ol> 3.脳セクショニング<ol style="margin-left: 40px;"><li> 1×PBSから脳を取り出し、脳を通してカットしても、より正確で可能にするために、脳のマトリックス（ 図3A）にそれを配置します。存在する場合、小脳および嗅球を切り落とす、その後2または3つのセクションに冠状脳をカット。 <brは/&gt;注：トリミング及び脳の切断は、脳マトリックスを用いずに行うことができる。冠状に切断部の数は、使用されているビブラトームの切削距離に依存する。矢状及び冠状切片が、最も一般的に神経解剖学的同定のために使用されても脳には、任意の方向に切断することができる。 </li><li>シアノアクリレートで試料取付ブロックの上にそれぞれの脳切片を貼付。サポートのための脳切片（ 図3B）の後ろに5％のアガロースゲルの小さなブロックを貼付。 注：他の支持機構を用いることができるが、サポートなし、ビブラトームムラセクショニングを引き起こす脳に押すことができる。 </li><li>ビブラトームとの厚いセクションでは、4の速度と9の振幅に設定さ160ミクロン（イメージングに使用目的の作動距離）に組織を切断。 注：速度及び振幅の設定があっても、滑らかな部分を得るために使用される特定のマシンに応じて調整することができる。設定がある場合正しくない場合、結果は不均一な切片、組織またはびびりマークの引き裂きすることができる。 </li><li>彼らは1週間以内にクリアしようとしている場合には、新鮮な、冷蔵1×PBSで満たされたシンチレーションバイアルに組織切片を収集します。の項では、1週間以内にクリアする予定がない場合は、-20℃で凍結保存液と店舗で満たさ1.5ミリリットルのマイクロチューブに場所セクション。 </li></ol>脳組織切片の4オプティカルクリア注：このプロトコルは、以前に公開されたメソッド8から変更されている。 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 1×PBS + 2％のTween-20（胃腸/ PBST）中で25％、50％、75％及び90％容量/容量のグリセロールを準備する。 </li><li>凍結保存剤であれば、1×PBSですすぎ、25％GL / PBSTの10ミリリットルを含むシンチレーションバイアルに移し、1×PBSからセクションを削除するか。 12時間、暴露からの光に覆われて4℃でシェーカー、の上に置いてバイアル。 </li><li>すべてのセクションは、BOに沈んでいることを確認してくださいバイアルのttom。の項では、その後12時間、光への暴露からカバーし、4℃でシェーカー上で10ミリリットル50パーセントGL / PBSTでバイアルと場所を埋めるカバーするだけの十分な残して、25％のGL / PBSTを吸引。 75％のGL / PBSTその後90％のGL / PBSTこのプロセスを繰り返します。最大のクリアリングに到達するために24時間90％のGL / PBST中のセクションのままにしておきます。クリア処理の過程で、緩やかな光学クリアします（ 図4）を観察。 注：セクションでは、バイアルの底に沈んでた後に解決策がすぐに変更された場合は、このプロセスが迅速ことができる。 75パーセント＆90％のソリューションでは、セクションでは、すべての方法をバイアルの底に沈むことはありませんが、途中でフロートします。 </li></ol> 5.取付脳組織切片<ol style="margin-left: 40px;"><li>スペーサーを作成するために5個に第1.5カバースリップをカット。 図5（a）に示す点線に沿ってカバースリップを獲得し、破壊するために定規とダイヤモンドひっくり返された鉛筆を使用してください。破棄トン彼は、作品を中心にウィンドウを作成するために、プレーンガラススライド上に4アウターピースを配置してから、正しい構成（ 図5B）でスライドにスペーサーの部分を接着するために縫い目上に明確なマニキュアを磨く。 NOTE：スペーサスライドクリア部分を取り付けるためのカバーガラスの間に必要なスペースを作成するために使用される。カバーガラスは、必要な任意のサイズのウィンドウを作成するための様々な方法で切断されてもよい。プレカット発泡スペーサーも市販されている。マニキュアが完全に乾燥させるためには、少なくとも1日前取付部にスペーサーを有するスライドを作るのがベストです。 </li><li>先端がプラスチック製のトランスファーピペットを用いてスライドに転写部を切断。 90％のGL / PBSTで周辺地域に記入してください。慎重に確認してくださいすべての気泡を導入しないことセクション上にカバースリップを下げる。過剰GL / PBSTは糸くずの出ないワイプで離れて吸い上げてよい。 </li><li> RFP +を含む画像は、GFP +ニューロン<em&gt;共焦点顕微鏡すぐに（ 図7A-B）、ストアのスライドを平らにし、4℃で光からカバーとトキソプラズマ嚢胞。 注：あるいは、シールは保存し、後で画像化するために、すべてのエッジの周りに完全にスライドさせる。スライドをシールする明確なマニキュアの使用はオプションであり、1つは、さらなる処理のため、後日スライドからセクションを削除した場合、それがより困難にカバースリップを削除することがあります。 </li></ol> 6.イメージング注：すべての顕微鏡は、高解像度のzスタックを取得する能力を有することを使用することができる。 <ol style="margin-left: 40px;"><li>当初は10倍で、焦点面を見つけた後、20Xの目的に変更し、GFP +細胞の内側に位置する嚢胞を識別するためにセクションをスキャン。視野内の関心領域（ROI）を中心。 </li><li>対物レンズ40倍に変更します。ことを確認するためにROI全体を通して上下にフォーカス細胞全体とCYSTは、表示されます。 注：画像は、40X / 1.30オイルDIC M27の目的とした共焦点顕微鏡を用いて得られた。 </li><li>インストールイメージングソフトウェアを使用して、嚢胞全体セルを含むzスタックを得る。画像を得るために使用される平均の設定は、図6に示されている。 NOTE：設定は、各研究者の組織切片を、顕微鏡能力に応じて調整する必要がある。 </li><li> 64への投影の数を設定することにより、完全な回転のビューを取得し1に投影数を設定することにより、zスタックの最大投影画像を得る。 注：他のソフトウェアパッケージが利用可能であり、最大値投影、回転ならびにzスタック画像の他のビューを得るために使用することができる。 </li><li>画像解析ソフトで画像を分析します。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もない。

感染した宿主細胞における細胞変化は、HIV、狂犬病、およびクラミジア18,19などの他の細胞内生物による感染症の疾患転帰にリンクされていることを考えると、私たちは私たちがCNSとの間で発生する親密な相互作用を研究することを可能にする技術を開発セルおよびトキソプラズマを開催。ここで説明する方法は、慢性的に感染した神経細胞の効率的なイメージングを可能にす...

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 Anita A. Koshy, Carla M. Cabral
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Carla M. Cabral, Anita A. Koshy

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Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

この方法の全体的な目標は、高解像度、偏性細胞内寄生トキソプラズマ原虫に感染した個々のニューロンの三次元画像を得ることである。 トキソプラズマは、しばしば人間とげっ歯類が含まれ、その大きな中間宿主域、の中で最も成功した寄生虫の一つと考えられている。ヒトとげっ歯類の両方で、汚染された食物や水の摂取を通じて、急性感染後、 トキソプラズマがフォームをそのスロー複製にその速い複製形（タキゾイト）からの変換とシスト化によってCNSの持続感染を引き起こすことが可能である（ブラディゾイト）。免疫応答性個体では、この潜在的な中枢神経系の感染は比較的無症候性であると考えられているが、そのようなエイズ患者や移植レシピエントとして免疫無防備状態の個体では、寄生虫の再燃は、致命的なトキソプラズマ脳炎1,2につながることができます。加えて、最近の研究ヘクタールメカニズムは不明であるもののトキソプラズマと潜伏感染は、げっ歯類3,4における行動の変化につながる可能性があることを示したVEの。 驚くべきことに、CNS- トキソプラズマ相互作用の重要性を強調し、これらのデータにもかかわらず、比較的少ない、特に、細胞および分子レベルで、この関係について知られている。脳寄生虫相互作用のさえ単純な側面を研究する能力は、科学技術の限界によって一部に妨げられてきた。例えば、ニューロンは、嚢胞が持続する細胞であることを示す研究の大半は、電子顕微鏡（EM）5,6を用いて行われてきた。 EMは、高解像度を与えるが、それは時間がかかり、労働集約的で、かつ高価である。免疫蛍光（IF）アッセイは、最近、EM 7によって行われた作業を確認するために、共焦点顕微鏡と組み合わせて使用されてきた。アッセイは、実行することが技術的に容易で、比較的安価な、しかしアンダーにこれらの技術を使用している場合嚢胞、感染したニューロン間の空間的関係は、時間がかかるもの、シリアル再建を必要とする技術的に困難であり、貴重な情報の損失につながる可能性がTAND。したがって、我々は、CNSトキソプラズマ症のマウスモデルで使用し、EMまたは免疫組織化学（IHC）のない画像に感染した神経細胞の全体を私たちを可能にすることができる方法を開発した。このような技術を開発することにより、我々は、比較的迅速かつ安価な方法で感染細胞とシストの間に細胞の関係を探求し始めることができます。 私たちが開発した方法は、寄生虫タンパク質9,10に注入された生体細胞内のマークシステムと共焦点顕微鏡8による光学的にクリアとイメージング厚い脳切片の新しい技術を組み合わせたものです。このシステムでは、我々はトキソプラズマとのCre介在組換え後の11緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するのCreレポーターマウスを感染</em&gt;赤色蛍光タンパク質（RFP）を発現する宿主細胞9にCreリコンビナーゼを注入菌株。この組み合わせは、私たちはCNS感染が確立された後、感染したマウスの脳を収穫厚い脳切片を切断し、そして迅速にRFP +嚢胞を見つけることによって、画像に関 ​​連する領域を特定することができる。これは、GFPの宿主細胞発現はGFP +細胞の数は、寄生虫10が含まれていない、感染に寄生虫のCreの注入のみに依存する、としないように留意することが重要である。ニューロン-このプロトコルの目的は、画像全体に感染したニューロンにできることがあるので、焦点は唯一のもRFP +嚢胞が含まれていますが、プロトコルは、GFP + / RFPイメージにも使用することができ、GFP +ニューロンにある。 感染した脳を採取し、区分された後、切片をグリセロールクリアで透明なレンダリングされます。セクションの適切な領域は、その後、共焦点顕微鏡、らで撮像する感染した宿主細胞、および、それらの全体がシスト寄生虫のlowing前例のない可視化。ここでは、識別するための完全なプロトコル、光学的にクリアリング、およびイメージング感染ニューロンを提供する。

<table><tbody><tr><td>Vibratome Series 1000 Sectioning System</td><td>Technical Products International, Inc.</td><td></td><td>Other vibratomes are compatible</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Premium Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 Coverslips</td><td>VWR</td><td>48393 251</td><td></td></tr><tr><td>Diamond Scriber</td><td>VWR</td><td>52865-005</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Ketaject&amp;reg; Ketamine HCl Inj., USP 100 mg/ml</td><td>Western Medical Supply, Inc.</td><td>4165</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed&amp;reg; Injection Xylazine 20 mg/ml</td><td>Lloyd Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZsGreen Mice</td><td>Jackson Laboratories</td><td>7906</td><td>B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J</td></tr><tr><td>Surgical equipment</td><td></td><td></td><td>Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.</td></tr><tr><td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td><td></td><td></td><td>These are primary cells from human foreskins.&amp;nbsp; We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM)</td><td>HyClone</td><td>SH30081.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin Solution, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-alanyl-L-glutamine</td><td>Corning</td><td>25-015-Cl</td><td></td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Canted neck flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>1012639</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium</td><td>VWR</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline, 10x, USP Sterile Ultra Pure Grade</td><td>amresco</td><td>K813-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line Hemocytometer</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Brain Slicer Matrix</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS005-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td><td>Sigma-aldrich</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Disposable Scintillation Vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS74500-20</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof</td><td>In-house</td><td>17212945</td><td>This product is purchased from an in-house stockroom.&amp;nbsp; Other companies are compatible.</td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clear nail polish</td><td></td><td></td><td>Other brands are compatible</td></tr><tr><td>10 ml Syringe with Luer-Lok</td><td>VWR</td><td>BD309604</td><td>Other syringes are compatible</td></tr><tr><td>Three-way Stopcock</td><td></td><td></td><td>Any brand is compatible</td></tr><tr><td>Hypodermic needle</td><td></td><td></td><td>Any brand is compatible - used to pin down mouse.</td></tr><tr><td>Cell Scraper</td><td></td><td></td><td>Any brand is compatible</td></tr><tr><td>25 G x 12&quot; Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter</td><td>Greiner Bio-One</td><td>450099</td><td>Other brands are compatible</td></tr></tbody></table>

3-d imaging and analysis of neurons infected in vivo with toxoplasma gondii

トキソプラズマは、ヒト及びげっ歯類を含む広い宿主範囲、との偏性細胞内寄生虫である。ヒトとげっ歯類の両方で、 トキソプラズマは脳内の生涯持続感染を確立します。この脳の感染はほとんどの免疫担当の人で無症候性ですが、発育中の胎児や、後天性免疫不全症候群（AIDS）患者などの免疫無防備状態の個体では、脳内のためと永続この偏愛は壊滅的な神経疾患につながることができます。このように、脳- トキソプラズマ相互作用はトキソプラズマによって生成症候性疾患に重要である、まだ我々は、中枢神経系（CNS）および寄生虫の細胞との間の細胞または分子相互作用をほとんど理解していることは明らかである。 CNSのマウスモデルでは、それが神経細胞は寄生虫が解決している細胞であることを30年以上にわたって知られているが、ほとんど情報がどの程度利用可能であるトキソプラズマ症ニューロンの一部は、一般的に（ソーマ、樹状突起、軸索）を感染していると、この細胞の関係は、株の間で変更された場合。一部では、この欠如は、撮像の困難に二次であり、動物からの全感染ニューロンを可視化する。このような画像は、典型的には、連続切片および電子顕微鏡または免疫染色後に共焦点顕微鏡で画像化した組織のステッチを必要とするであろう。いくつかの技術を組み合わせることにより、ここで説明する方法は、免疫染色を必要とせずに個体、慢性的に感染した神経細胞の三次元可視化および解析を可能にする、厚い部分（160ミクロン）の使用は、嚢胞を含む全細胞を同定し、画像を可能にする、電子顕微鏡法、または連続切片とステッチ。この技術を用いて、寄生虫、感染したニューロン間の細胞の関係を理解し​​始めることができます。

図7は、2つの異なる160μmの厚さの切片だけでなく、 図7Bのための嚢胞対細胞体からの距離の代表的測定から2嚢胞含有GFP +ニューロンの代表的な画像が含まれています。7 AとBは 、この新しいことを示してプロトコルは、その全体が感染したニューロンの可視化を可能にする。 図7Cは、この撮像技術では、嚢胞...

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3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

このプロトコルを使用して、我々は、シスト化の寄生虫と感染したニューロン間の空間的関係の可視化と分析を可能にする寄生虫トキソプラズマに感染したマウスからの画像160の厚さの脳切片することができました。

感染ニューロンの3-Dイメージングと分析<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;トキソプラズマ</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

3-d-imaging-analysis-neurons-infected-vivo-with-toxoplasma

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

11.4K ビュー.  University of Arizona. このプロトコルを使用して、我々は、シスト化の寄生虫と感染したニューロン間の空間的関係の可視化と分析を可能にする寄生虫トキソプラズマに感染したマウスからの画像160の厚さの脳切片することができました。 

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A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

慢性二光子用薄型頭蓋骨のウィンドウテクニック in vivoで</em神経炎症のモデルのマウスミクログリアの>イメージング

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

神経科学

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

神経侵襲性脳炎ウイルスのin vivoイメージングシステム（IVIS）検出で

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

免疫・感染学

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

三次元画像と人間の表皮内神経線維内のミトコンドリアの解析

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

マウス大脳皮質における細胞組織の大規模三次元イメージング

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Concomitant Isolation of Primary Astrocytes and Microglia for Protozoa Parasite Infection

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central nervous system (CNS). The increasing evidences of their involvement in the control of infectious diseases justify the emerging interest in the improvement of methodologies to isolate primary astrocytes and microglia in order to evaluate their responses to infections that affect the CNS. Considering the impact of Trypanosoma cruzi (T. cruzi) and Toxoplasma gondii (T. gondii) infection in the CNS, here we provide a method to extract, maintain, dissociate and infect murine astrocytes and microglia cells with protozoa parasites. Extracted cells from newborn cortices are maintained in vitro for 14 days with periodic differential media replacement. Astrocytes and microglia are obtained from the same extraction protocol by mechanical dissociation. After phenotyping by flow cytometry, cells are infected with protozoa parasites. The infection rate is determined by fluorescence microscopy at different time points, thus enabling the evaluation of differential ability of glial cells to control protozoan invasion and replication. These techniques represent simple, cheap and efficient methods to study the responses of astrocytes and microglia to infections, opening the field for further neuroimmunology analysis.

The overall goal of this protocol is to instruct how to extract, maintain, and dissociate murine astrocyte and microglia cells from the central nervous system, followed by infection with protozoa parasites.

原虫性原虫感染に対する原発星およびミクログリアの同時分離

Astrocytes and microglia are the most abundant glial cells. They are responsible for physiological support and homeostasis maintenance in the central ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

溶媒クリア脳組織における狂犬病ウイルス感染の高解像度3Dイメージング

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs

Chagas disease is a neglected pathology that affects millions of people worldwide, mainly in Latin America. The Chagas disease agent, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), is an obligate intracellular parasite with a diverse biology that infects several mammalian species, including humans, causing cardiac and digestive pathologies. Reliable detection of T. cruzi in vivo infections has long been needed to understand Chagas disease&#39;s complex biology and accurately evaluate the outcome of treatment regimens. The current protocol demonstrates an integrated pipeline for automated quantification of T. cruzi-infected cells in 3D-reconstructed, cleared organs. Light-sheet fluorescent microscopy allows for accurately visualizing and quantifying of actively proliferating and dormant T. cruzi parasites and immune effector cells in whole organs or tissues. Also, the CUBIC-HistoVision pipeline to obtain uniform labeling of cleared organs with antibodies and nuclear stains was successfully adopted. Tissue clearing coupled with 3D immunostaining provides an unbiased approach to comprehensively evaluate drug treatment protocols, improve the understanding of the cellular organization of T. cruzi-infected tissues, and is expected to advance discoveries related to anti-T. cruzi immune responses, tissue damage, and repair in Chagas disease.

Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs

The present protocol describes light-sheet fluorescent microscopy and automated software-assisted methods to visualize and precisely quantify proliferating and dormant Trypanosoma cruzi parasites and T cells in intact, cleared organs and tissues. These techniques provide a reliable way to evaluate treatment outcomes and offer new insights into parasite-host interactions.

無傷の清澄化臓器における トリパノソーマクルジ感染細胞、休眠中のアマスティゴート、およびT細胞の定量的3Dイメージング

Chagas disease is a neglected pathology that affects millions of people worldwide, mainly in Latin America. The Chagas disease agent, Trypanosoma cruzi ...

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the neurotransmitter glutamate, and the excessive stimulation of its postsynaptic receptors. However, information on the subsequent molecular events that culminate in the distinct neuronal swelling morphology of this type of neurodegeneration is lacking. Other aspects, such as changes in specific subcellular compartments, or the basis for the differential cellular vulnerability of distinct neuronal subtypes, remain under-explored. Furthermore, a range of factors that come into play in studies that use in vitro or ex vivo preparations might modify and distort the natural progression of this form of neurodegeneration. It is therefore important to study excitotoxic necrosis in live animals by monitoring the effects of interventions that regulate the extent of neuronal necrosis in the genetically amenable and transparent&#160;model system of the nematode Caenorhabditis elegans. This protocol describes methods of studying excitotoxic necrosis in C. elegans neurons, combining optical, genetic, and molecular analysis. To induce excitotoxic conditions in C. elegans, a&#160;knockout of a glutamate transporter gene (glt-3) is combined with a neuronal sensitizing genetic background (nuls5 [Pglr-1::G&#945;S(Q227L)]) to produce glutamate receptor hyperstimulation and neurodegeneration. Nomarski differential interference contrast (DIC), fluorescent, and confocal microscopy in live animals are methods used to quantify neurodegeneration, follow subcellular localization of fluorescently labeled proteins, and quantify mitochondrial morphology in the degenerating neurons. Neuronal Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is used to distinctly sort at-risk neurons for cell-type specific transcriptomic analysis of neurodegeneration. A combination of live imaging and FACS methods as well as the benefits of the C. elegans model organism allow researchers to leverage this system to obtain reproducible data with a large sample size. Insights from these assays could translate to novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative diseases.

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

In a C. elegans excitotoxicity model, this protocol employs in vivo imaging to analyze the regulation of necrotic neurodegeneration, the effect of genes encoding candidate mediators, and involvement of mitochondria. Cell dissociation and sorting is used to specifically obtain at-risk neurons for cell-specific transcriptomic analysis of neurodegeneration and neuroprotection mechanisms.

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the ...

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent cerebellum is an ideal system to track the development and morphogenesis of a single cell type, the cerebellar granule neuron (CGN), across time. Here, in vivo electroporation of granule neuron progenitors in the developing mouse cerebellum was employed to sparsely label cells for subsequent morphological analyses. The efficacy of this technique is demonstrated in its ability to showcase key developmental stages of CGN maturation, with a specific focus on the formation of dendritic claws, which are specialized structures where these cells receive the majority of their synaptic inputs. In addition to providing snapshots of CGN synaptic structures&#160;throughout cerebellar development, this technique can be adapted to genetically manipulate granule neurons in a cell-autonomous manner to study the role of any gene of interest and its effect on CGN morphology, claw development, and synaptogenesis.

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Here we describe a method to visualize synaptogenesis of granule neurons in the mouse cerebellum over the time course of postnatal brain development when these cells refine their synaptic structures and form synapses to integrate themselves into the overall brain circuit.

in vivo生後エレクトロポレーションによる小脳顆粒ニューロンの形態とシナプス発生の研究

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent ...

Fluorescent Reporter 定量による全臓器病原体追跡(英語)

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen cells within this diverse environment significantly affects their stress levels, responses, fate, and contribution to the overall progression of the disease and treatment failure. However, due to the technical difficulties in locating &#181;m-sized pathogen cells within cm-sized host organs, this area of research has been relatively unexplored. Here, we present a method for addressing this challenge. We employ serial two-photon tomography and AI-enhanced image analysis to locate individual Salmonella cells throughout the entire spleen, liver lobes, and whole lymph nodes of infected mice. Using fluorescent reporters and in vivo antibody administration, the replication rate of single Salmonella cells, their local interaction with specific immune cells, and bacterial responses to antibiotics can be determined. These methodologies open avenues for a comprehensive examination of infections, their prevention, and treatment within the three-dimensional tissue context.

著者スポットライト:組織における抗生物質と免疫系に対する細菌の応答を解明する

Here, we describe a procedure that enables organ-wide detection of pathogenic bacteria during infection and quantification of fluorescent reporter activities.

微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

感染ニューロンの3-Dイメージングと分析

要約

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この動画の章

慢性二光子用薄型頭蓋骨のウィンドウテクニック in vivoでイメージング

神経侵襲性脳炎ウイルスのin vivoイメージングシステム（IVIS）検出で

三次元画像と人間の表皮内神経線維内のミトコンドリアの解析

マウス大脳皮質における細胞組織の大規模三次元イメージング

原虫性原虫感染に対する原発星およびミクログリアの同時分離

溶媒クリア脳組織における狂犬病ウイルス感染の高解像度3Dイメージング

無傷の清澄化臓器におけるトリパノソーマクルジ感染細胞、休眠中のアマスティゴート、およびT細胞の定量的3Dイメージング

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

in vivo生後エレクトロポレーションによる小脳顆粒ニューロンの形態とシナプス発生の研究

微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法

感染ニューロンの3-Dイメージングと分析

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慢性二光子用薄型頭蓋骨のウィンドウテクニック in vivoでイメージング

神経侵襲性脳炎ウイルスのin vivoイメージングシステム（IVIS）検出で

三次元画像と人間の表皮内神経線維内のミトコンドリアの解析

マウス大脳皮質における細胞組織の大規模三次元イメージング

原虫性原虫感染に対する原発星およびミクログリアの同時分離

溶媒クリア脳組織における狂犬病ウイルス感染の高解像度3Dイメージング

無傷の清澄化臓器における トリパノソーマクルジ感染細胞、休眠中のアマスティゴート、およびT細胞の定量的3Dイメージング

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

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微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法

無傷の清澄化臓器におけるトリパノソーマクルジ感染細胞、休眠中のアマスティゴート、およびT細胞の定量的3Dイメージング