Name: an ex vivo laser-induced spinal cord injury model to assess mechanisms of axonal degeneration in real-time
Uploaded: 2014-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
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DPS acknowledges past and present support in part from grant #2665 and #2934, respectively, from the PVA Research Foundation. PKS is an Alberta Innovates &#8211; Health Solutions Scientist, operating funds were provided by the Leblanc Chair for Spinal Cord Research, University of Calgary.

注：すべての動物の手順は、連邦規則に付着し、ルイビル大学の施設内動物管理使用委員会によって設定されたガイドラインの下で行った。 ローのCa 2+および2mMのCa 2+人工脳脊髄液（aCSFの）の調製灌流液<ol><li> 表1に記載されるように2倍低いのCa 2+（0.1 mm）株価Cバッファー、2倍、通常のCa 2+（2 mm）株価バッファ、および2X証券Bバッファを準備します。個々の原液をイオン含有量の変更を許可（ 例えば、低いまたはゼロのCa 2+）及び1ヶ月まで4℃で保存することができる。 </li><li>解剖時の心臓内灌流のため、1倍低いのCa 2+ aCSFのを作るためにプラスチック製のボトルに2倍低いのCa 2+証券Cの100ミリリットルと2倍株式Bの100ミリリットルを追加します。混合し、4℃で一晩保存したり、新鮮作る。 </li><li>虚部の間にex vivoでの脊髄の灌流のためのINGは、1X aCSFのを生成するために、1リットルのガラスボトルに2倍、通常のCa 2+株式Aの500ミリリットルと2倍株式Bの500ミリリットルを追加します。混合し、室温で一晩保存したり、新鮮作る。 </li><li> 7.4にaCSFのバッファのpHを調整する。室温でのaCSFを維持しながら、氷上で低Ca 2+のaCSFのを配置し、気泡カルボゲンガスとの両方のバッファ（95％O 2、5％CO 2）で30分間前に、灌流中に連続的に使用する。 </li></ol> 生体外イメージング商工の調製<ol><li> aCSFのボトルの周りに加熱ブランケット（なし自動シャットオフ）をラップし、低/中の設定に熱を調整します。 </li><li>灌流ポンプ及び図1Aに示すように、バイポーラ温度コントローラ及びフィードバック温度プローブによって制御されているインラインヒータに接続されたボトルに、専用のaCSF灌流ラインを挿入する。 </li><li> 2光子励起/ confにフラット顕微鏡ステージインサート（152 X 102ミリメートル）を取り付け流出コンテナを装着しOCALの顕微鏡ステージ。 </li><li> （適切なEXについては、図1（b）参照 ex vivoでの脊髄に新鮮な酸素のaCSFの連続的な流れに対応し、提供するために、流出容器に、大規模なオープン浴灌流チャンバー（12×24×8ミリメートル幅×長さ×H）を配置）チャンバ設計を撮像する体内 。 </li><li>適切なチューブを使用してex vivoでのイメージング室にインラインヒータの金属出力ポートに接続します。撮影時のバッファ/組織の温度を維持するのを助けるためのex vivoイメージング室の下に薄い吸収パッドを配置します。 </li><li>取り外し可能な粘着性のタックを使用して流出コンテナ/ステージインサートの底にex vivoでのイメージング室を接着。目的の光路は、組織表面に対して垂直であることを確認するために、必要に応じて粘着性の粘着性の可鍛性は、チャンバが調整されることを可能にする。必要に応じて、チャンバを調整するブルズアイレベルを使用する。 </li><li>確保するチャンバの流体入口およびチャンバ出口での真空ラインに接続されたステンレス製の吸引チューブの近くにインラインヒータフィードバック温度プローブ。磁気テープ、適切なマイクロピペットホルダは、この点で有用である。真空源をオンにします。 </li><li>酸素化aCSFの持つイメージングチャンバーを充填開始する灌流ポンプをオンにします。毎分1.5〜2ミリリットルに灌流ポンプを設定します。 </li><li>真空ラインを調整することにより、撮像チャンバ内のaCSFの音量を制御する。これは、十分なaCSFの脊髄セグメントをカバーし、水浸漬対物レンズと組織表面との間に十分な作動距離を可能にするために、撮像チャンバ内に存在することが重要である。組織セグメントは完全に実験者によって誘発されるアーティファクトをリードする新鮮な酸素aCSFの内に浸漬されていない場合、ミエリンと軸索は悪影響を受けることができます。 </li><li>撮像チャンバー内の灌流液の温度が室温付近になるように、インラインヒータ温度制御を調整する。 </li></ol> &lt;Pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 3。アダルトマウス頸部脊髄の解剖<ol><li>腹腔内注射によって麻酔を、ペントバルビタールナトリウム（200 mg / kgを）の過剰摂取を注入することによって（後根神経節ニューロンにおける蛍光タンパク質の発現を有し、適切な株を使用する）、成人6-10週齢THY1 -YFPトランスジェニックマウスを安楽死させる。 </li><li>一度麻酔の適切なレベル（つま先のピンチとまばたき反射の消失に例えば、無反応）の下で、慎重に手術用バリカンで脊髄と脳を覆う皮膚を剃る。ベタジンおよび70％エタノールパッドを使用して皮膚を清潔。 </li><li>その後冷やし、カーボゲン-バブリング低Ca 2+のaCSFのを使用して経心件名を灌流、70％エタノールで胸/腹部領域をスプレーします。 （推奨解剖ベンチについては、図1Cは 、トップのセットアップを参照）。 </li><li>肝臓は見劣りとして、小さなクリップを使用して心臓に灌流針を固定します。の毛を剃っ背側にアクセスするための主題を裏返し被写体と70％エタノールで剃毛面積を拭く。 </li><li>脳と脊柱（ 図2A）を露出するために解剖ハサミを使用して、腰に鼻から始まる正中線に沿って背側皮膚切開を行います。鼻とハンチでピンを配置することで準備を固定します。 </li><li>この点から、解剖顕微鏡を用いて、しっかりと嗅球のレベルで頭蓋骨の背側表面を横切る。切開の側縁にはさみのヒントの1を挿入し、小脳まで両側性タツナミソウの縁に沿ってカット。 注：それは（ 図2Bを参照）解剖を通して脊髄から上にある組織を持ち上げるために、後に必要とされるように完全にスカルキャップを切除しないでください。 </li><li>脳を公開するスカルキャップを持ち上げます。 図2C（静かに（小脳に位置する）interparietal骨の左右の端をカットし、脳幹/脊髄を露出させるために尾戻ってそれを引っ張る</stroNG&gt;）。 </li><li>テーブル面に対して45°の角度で保持細い先端ハサミを使用して、後部神経根への二国間だけで劣る椎骨をカット。 注：明るい白背側の列との接触を避ける。これらの繊維は、（ 図2D）画像化され、簡単に破損することができるものです。 </li><li>カットが脊髄を露出させているように優しくワンピースでその上の組織を引っ張って、細かい傾いて鉗子で脊柱のスカルキャップと背側表面を持ち上げます。その後のイメージングのため頸髄（ 図2E）1-2センチセグメントを分離するために、上部胸椎レベルに脊椎カットし続けます。 </li><li>脊柱と列の下に明確な組織への組織/骨の並列をカットするはさみを使用してください。できるだけ水平これらのカットを行います。これは、コードがイメージング用のレベルになるように組織がチャンバ内に平らにすることが非常に重要である。 </li><li>過ぎて（脳幹を横断するために＃11メスを使用してくださいGRACILE束繊維の終了）と頸髄セグメントを分離するために、上部胸椎レベルで（ 図2Fを参照してください）。これらの同じ2つの点での組織/骨をカットするはさみを使用してください。孤立した組織は、尾側脳幹、子宮頸拡大し、上部胸髄（ 図2G）を網羅する脊柱の2/3を含める必要があります。 </li><li>カルボゲン-バブリング、チルド低いのCa 2+のaCSFのシャーレに孤立した脊柱を置きます。必要であればそれは皿に平らになるまで、脊柱の下に組織をトリミング。 </li><li> ex vivoでのイメージング室に孤立した脊柱を転送し、徐々に36に1時間かけて灌流液の温度を上げる- 37℃。撮像中にこの温度を維持する。 </li></ol>ナイルレッドとイメージング商工およびミエリンの標識に生体外脊髄の4の配置<ol><li>慎重に私に脊柱を確保適切なフィッティングスライスとmaging室が（; 図3Aを参照してください脊髄用の領域を確保するために、グリッドプラットフォームの真ん中のスレッドを削除します）細かいライクラ糸からなる垂直グリッドプラットフォームで修飾された押し続けます。 </li><li> （DMSO中に5 mMストックし、ろ過し、0.22μmのは、4℃、または暗闇の中で-20℃で6ヶ月で1ヶ月間保存することができます）ナイルレッドのアリコートを解凍する。単に撮像チャンバーにナイルレッドを添加する前に、灌流ポンプの流量を減少させ、チャンバ内の流体は、常に脊髄を覆うことを確認するために真空ラインを調整する。 </li><li>コード（ 図3B）の尾終わり近くイメージング室に5〜10μlのナイルレッド原液を追加します。優しく室全体にナイルレッドを混合するために1ミリリットルピペットを使用してください。ナイルレッドが戻って真空ラインを配置し、継続的に脊髄を灌流する毎分1.5〜2ミリリットルに灌流ポンプを調整した後、1〜2分間チャンバー内に滞在することを許可する。 </li><li>慎重に顕微鏡ステージを上げる水浸対物レンズは、チャンバー内のaCSFの表面から約10mmになるまでと背側の列の上に脊髄セグメントの中心とし、内側に目標を合わせます。それは優しくaCSFの表面に触れるまでゆっくりと目的を持って来るために顕微鏡ノーズピースフォーカスホイールを使用してください。視野（ 図3C）に後柱をフォーカスする落射光源を用いる。 </li></ol> TPLSMとレーザ誘起脊髄損傷マウス脊髄の5 例vivoイメージング（LiSCI） 注：後部静脈がGRACILE束繊維のような組織を中央に有用なマーカーを提供していますが、（後根神経節の細胞体に由来し、T6から上昇し、下に脊髄の正中線に沿って）この血管平行に走る。繊維はYに横方向に昇降などの厚いYFP +頚椎後根の予測も有用なマーカーを提供FP +直径が小さい薄束束繊維。 <ol><li>脊髄組織を適切に位置合わせされると、昇順薄束束有髄線維のベースラインイメージングを実行するためにレーザ走査モードに切り替える。両方YFP及びナイルレッドを励起し、蛍光発光を分離するために950nmの波長（〜25X、1.1 NA対物レンズの出口で測定された17 mW）とし、適切な色性（DM）とバンドパスフィルタに同調二光子レーザー光源を使用フルオロフォアの（我々は黄橙色、および拡張赤チャンネル、それぞれにYFP、ナイルレッドを分離するために、50分の525のDM560、60分の600のDM640、および70分の685を使用します）。 <ol><li>軸索の3％以上がベースラインイメージング（30〜60分）の間に軸索スフェロイドを示した場合は、原因実験者によって誘発されるアーティファクトに準備を捨てる。 </li></ol></li><li> 30.3Xに視野を拡大しLiSCIを誘導する（〜20μmの直径アブレーションを作成するため）。曲が800nm​​のレーザー、および少なくとも〜110ミリワットのレーザーのパワーを増加させるサンプル。繊維が完全に離断されていることを確認するために、ビューのレーザースキャンの5完全なフィールドを許可します。 </li><li> （サンプル、2.08Xで950 nmの、17 MW）をイメージングの設定に戻ってレーザーの設定を変更することでLiSCIを確認し、アブレーションを可視化する組織をスキャンします。アブレーションの直径を確認して、主要なアブレーションされた軸索が完全に離断していること（ 図3Dを参照）。損傷後の8-10 +時間までの損傷に軸索とミエリンの動的応答を記録するために、Zキャプチャと組み合わせる顕微鏡タイムラプス設定を使用します。 注：切除が不完全である場合（ すなわち 、繊維の不完全な離断）、一次および二次損傷機構の判定が混同されるように、調製物を捨てる。さらに、単離された脊髄セグメントはLiSCI非依存組織損傷を緩和するために軽度に24時間後LiSCIまで撮像することができる。 </li></ol>

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P., Cummins, K., Wayne Chen, ., R, S., Stys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axoplasmic+reticulum+Ca(2+)+release+causes+secondary+degeneration+of+spinal+axons.">Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons.</a> Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

私たちは、表面のイメージングex vivoでの脊髄髄軸索（ すなわち、GRACILE束）時間をかけて、プライマリとセカンダリの両方の有髄軸索変性の動的な進行を研究するためにレーザ誘起脊髄損傷と組み合わせる。 生体外イメージングの方法を説明脊髄は、そのような動きアーチファクトと長時間のイメージングセッション中実験者誘発性低酸素症の可能性として、in vivo</em...

軸索の変性は神経外傷、脳卒中、自己免疫、および神経変性疾患を含むいくつかの神経学的状態にまたがる罹患率の顕著な原因である。末梢神経系（PNS）、中枢神経系とは異なり（CNS）の軸索は、一度による内因性および外因性障壁（ すなわち、ミエリン変性時の瘢痕形成の間に生成され、遊離した軸索成長の阻害分子）1の両方に負傷再生する限られた能力を有している-7。これらの障害のいくつかは、広く調査されてきたが、CNS軸索変性を防ぐ頑強な軸索再生を促進し、機能的な連結的に復元することを目的とした治療的介入は、限定されるもので残る。 一度彼らの相馬から分離軸索は軸索腫脹、回転楕円体の形成及び（8にレビュー）最終的な断片化することを特徴とするウォーラー変性として知られている変性のステレオタイプのプロセスを経る。で対照的に、離断周辺軸索の細胞体との連続性に残る近切り株は、その端部に腫脹を形成し、バックランヴィエの最も近いノードに死亡した後、その後の軸索再生のために必要な成長円錐の形成、重要な前提条件を開始することができます9-11。対照的に、多くの中央軸索の軸索近位末端は、特徴的な「endbulbs」または後退電球を形成成長円錐を形成し、その代わりに離れて、それらが損傷した後に12〜15ヶ月のままで、損傷部位から後退させることができない。主要な軸索損傷に加えて、追加の軸索損傷/損失も大幅に最初の損傷から免れた軸索に発生する可能性があります。最初は免れる軸索のこの遅延軸索損失は、二次的軸索変性と呼ばれている。傷害にCNSの軸索のこの固有の応答は、機能的な軸索再生の脳や脊髄に達成するために、さらに困難な目標をレンダリングします。 haであるが軸索損傷（ 例えば、回転楕円体の形成、後退電球）のllmarksがよく、死後組織と軸索変性の実験モデルから特徴づけられている、これらの動的プロセスの根底にある分子メカニズムの解明が制限されています。これらの研究のほとんどは、本質的に時間をかけて、個々の軸索の応答を捕捉するために失敗した静的なエンドポイントでの観察に依存していた。しかし、外因的に軸索トレーサーは静的セクションから、ライブイメージング中の軸索の応答を解明する有用であった適用、遺伝的にコードされた軸索マーカーの可用性が大幅に蛍光顕微鏡を用いてリアルタイムで軸索を可視化する当社の能力を向上させた。実際、ケルシェンシュタイナーや同僚からの精液報告書は、第一脊髄の背側の列に自分の予想を送るニューロンのサブセットで緑色蛍光タンパク質をコードしてはThy1 -GFP-Sのマウスを用いたin vivoでの軸索変性と再生の直接的な証拠を提供したコード16。ライブイメージングは、2光子レーザー走査顕微鏡（TPLSM）を使用して接近し、関心のある細胞の遺伝的蛍光タンパク質標識は、軸索変性のような多くの多様な動的プロセスへの直接的な証拠と機構的洞察を提供し続けたCa 2+シグナル伝達、軸索再生、星状細胞生理学、ミクログリア生理学、傷害17-25への応答。 軸索とは対照的に、ほとんどリアルタイムで負傷ミエリン反応知られている。ミエリンは、PNSにおけるCNSおよびシュワン細胞におけるオリゴデンドロサイトによって生成され、維持白質の重要なコンポーネントです。ミエリンは、軸索の表面の99％を絶縁し、そうすることによって、最近Buttermore らによる審査、迅速かつ効率的な跳躍インパルス伝播をサポートする高抵抗、低容量保護カバーを提供しています。26。傷害に対するミエリンの動的応答をキャプチャするために、我々はソルバ、親油性を使う蛍光染料ナイルレッド27。この生体染色のソルバトクロミック特性は、物理化学的環境28,29に依存し、その発光スペクトルのスペクトルシフトを可能にする。これらの特性は、axomyelinic損傷のメカニズムへの洞察を得るために有用であり、適宜選択ダイクロイックおよび発光フィルターを用いて可視化またはスペクトル顕微鏡27を使用して解決することができる。例えば、ナイルレッドの発光スペクトルは、ブルーシフトなどの脂肪細胞と正常なCNSミエリン（発光ピーク〜580から590 nm）の27に見られるような極性の低い、脂質の豊富な環境である。対照的に、〜625nmの軸索として形成endbulbsであるこの生体染色色素の発光スペクトルのピークは、軸索立ち枯れ27を受ける。通常のミエリンに対するendbulbsで特異的にこれらのスペクトルシフトの基礎となる正確なメカニズムは不明であるが、このようなスペクトルの変化は、タンパク質の蓄積や組織崩壊につながる基礎となる変化を明らかにすることができる疎水性結合部位27の露出。 in vivoイメージングは、それらのネイティブ環境で脊髄軸索損傷のダイナミクスを観察するための究極の測定基準であるが、それは技術的に困難であり、かなりの外科専門知識を必要とし、多くの場合、実験の成果物（ 例えば、炎症や傷跡を導入することが脊柱を露出するために手術を繰り返す形成）。また、高価な機器は、多くの場合、顕微鏡対物レンズ下で無傷動物の懸濁液及び位置決めを可能にするために必要とされる。動物は慎重に、彼らは、流体が補充されることを確認するために、そして長引く麻酔をイメージングセッションに低酸素症の兆候がないことを確認するために、温かいまま確保するためにも監視する必要がある。軸索とミエリンは絶対生存したまま一定灌流および適切な酸素レベルを必要とする後者は非常に重要である。しかし、これは、しばしばin vivo研究ほとんどの報告または監視されていない日付。による心拍数及び（イソフルラン麻酔成体マウスの呼吸に加えて、動きアーチファクト：〜毎分300〜450ビート（BPM）は、97から98パーセントの酸素飽和度（通常レート〜632 BPM）および〜55-65呼吸を維持するために最適であるでも最速のレーザースキャンが避けられないこれらの動きを受けますように、生体内の脊髄イメージング中に発生した））は、それぞれ、（通常のレートは毎分〜163呼吸である）毎分30は、挑戦的な高解像度の蛍光顕微鏡を使用して、プライマリおよびセカンダリ軸索損傷応答を差別化するアーティファクト。移植可能な剛性椎フレームウィンドウと組み合わせる超共鳴スキャナの進歩は、覚醒動物におけるマウス脊髄のイメージングを可能にすることができるが、より速いスキャン時間が必然的に画質を劣化させる信号対雑音比を減少させる。 、現在、脳イメージングに使用脊髄イメージング技術の更なる改善は、これらの障害の多くを克服し、伊那によって導入ポテンシャル交絡を制限することができるdequate組織灌流、 例えば、31-33。 白質生理学および白質損傷のメカニズムについては知られていることの多くは、 インビトロまたは視神経、末梢神経、および脊髄白質34-41のストリップからの白質のエクスビボ調製物において使用して決定されている。これらの製剤は、彼らが環境要因で制御さの変化、薬剤や試薬の制御された適用、電気生理学を用いて機能の評価、および生体組織における軸索とミエリンの直接の蛍光顕微鏡観察を可能にするように白質傷害メカニズムの知識を進めるために続けている。しかし、脊髄後カラムストリップまたは腹側白質ストリップから軸索を観察するためにいくつかの以前のアプローチは、不可避的に密接に反対した軸索の応答に影響を与える可能性が除去段階で表面軸索を傷つける。上記の実験操作を活用し、VEのへの損傷を避けるため、それはコードの背側面の直接接触を防止するように、調査中のryの繊維は、我々は、ex vivoで頸髄モデルを使用する。このように、軟膜と隣接する表面的な脊柱軸索のアーキテクチャでは、単離の間生存可能で、非摂動残る。 損傷後の10+時間 - ここでは、それらが動的に最大8リアルタイムで局所損傷に反応するように、中央髄軸索の直接可視化を可能にする比較的単純なアプローチを説明します。レーザー誘起脊髄損傷（LiSCI）モデルが空間的に時間をかけて拘束されたままに原発巣（アブレーション部位）などの一次および二次軸索損傷メカニズムの間の区別を可能にします。オープンバス撮像チャンバは、治療的介入、試薬送達、および環境の操作にアクセス可能である。推定上のaxomyelinic保護剤は、迅速に組織プロセスを伴う長くて費用のかかる実験に対して直接観察によりリアルタイムで評価することができる、る、免疫染色、画像キャプチャ、および分析を区画ため、生きた動物で実験的なエージェントをテストする前に急性応答および保護の操作を評価するための有用な代理モデルを提供します。

<table><tbody><tr><td>Large bath chamber with slice supports</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27L</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Standard Slice Supports</td><td>Warner Instruments</td><td>SS-3</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers</td><td>Warner Instruments</td><td>SHD-27LP/10</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed</td><td>Warner Instruments</td><td>ST-1L</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Solution In-line heater/cooler</td><td>Warner Instruments</td><td>SC-20</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Bipolar temperature controller</td><td>Warner Instruments</td><td>CL-100</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Liquid Cooling System</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Cable assembly for heater controllers</td><td>Warner Instruments</td><td>CC-28</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Replacement bead thermisitor for CC-28 cable</td><td>Warner Instruments</td><td>TS-70B</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Magnetic holder with suction tubing</td><td>Bioscience Tools</td><td>MTH-S</td><td>To hold the stainless steel vacuum suction tubing&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Adjustable holder</td><td>Bioscience Tools</td><td>MTH</td><td>To hold the temperature probe</td></tr><tr><td>clear silicone sealant</td><td></td><td></td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>superglue</td><td></td><td></td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>thin plexiglass strips</td><td></td><td></td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>nile red</td><td>Life Technologies</td><td>N-1142</td><td>For labeling myelin</td></tr></tbody></table>

an ex vivo laser-induced spinal cord injury model to assess mechanisms of axonal degeneration in real-time

負傷CNSの軸索が再生し、多くの場合、離れて、損傷部位から退避に失敗する。最初の損傷から免れる軸索は、後に二次的軸索変性を受けることができる。脊髄内の追加髄軸索投射の成長円錐の形成の欠如、再生、および損失が大幅に損傷後の神経学的回復を制限します。脊髄の髄軸索が傷害に応答するかを中央評価するために、我々は、軸索に黄色蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを用いたex vivoでの生活脊髄モデルとの運命を文書化するための焦点と再現性の高いレーザー誘起脊髄損傷を開発二光子励起タイムラプス顕微鏡を用いて軸索と時間をかけてミエリン（親油性蛍光色素ナイルレッド）。そのような急性の軸索損傷、軸索退縮、およびミエリン変性などの動的プロセスは、最高のリアルタイムで研究されている。しかし、挫傷ベースの怪我や運動アーチファクトの非焦点性質が遭遇in vivoでの脊髄撮影時の挑戦的な高解像度の顕微鏡を使用して、プライマリおよびセカンダリ軸索損傷応答を差別化する。ここで説明するex vivoでの脊髄モデルは軸索腫脹、回転楕円体の形成、軸索切断し、リアルタイムでこれらの動的過程を研究するために有用なモデルを提供して腫れ周囲の軸索を含む臨床的に関連する挫傷/圧縮によって誘発される軸索の病態のいくつかの側面を模倣。このモデルの主な利点は、直接軸索と二次的損傷のメカニズムを傷つける主要侮辱間の区別を可能にする優れた時空間分解能である。直接灌流液入浴コードへの試薬の制御注入。環境環境（ 例えば、カルシウム、ナトリウムイオン、軸索損傷に対する既知の貢献者が、 生体内で操作することが不可能に近い）の正確な変化は、それらは可視化する機会を提供したように、マウスモデルも利点を提供遺伝的に同定された細胞集団および細胞内構造を操作します。ここでは、急性の軸索損傷のダイナミクスをキャプチャするためにマウスから住んで脊髄を分離して画像にする方法について説明します。

単離生存能力を維持するために必要な設定の適切な研究室の詳細、および画像エキソビボ脊髄は、 図1に示されている。顕微鏡は波長可変パルスフェムト秒レーザー、適切dicroicsおよび発光フィルター、および水を装備する必要がある高開口数の対物レンズを浸漬（≥1.0）。解剖時に脊髄の生存を確保するために、手順42を封止する、単離された軸索の膜のための十...

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An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

アン<em&gt;エクスビボ</em&gt;レーザー誘起脊髄損傷モデルがリアルタイムで軸索変性のメカニズムを評価するために

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

an-ex-vivo-laser-induced-spinal-cord-injury-model-to-assess

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

10.8K ビュー.  University of Louisville. We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability. 

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In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

神経科学

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

根切断術後の後根の軸索のライブイメージング

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

小脳軸索のレーザーNanosurgery<em&gt;インビボ</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

縦断のために脊髄商工を移植するための手順<em&gt;インビボ</emマウス脊髄の&gt;イメージング

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

マウス背側列のクラッシュ損傷におけるミクログリアおよびマクロファージと軸索の相互作用の生体内イメージング

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

Photothrombosis-induced Focal Ischemia as a Model of Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) below the site of injury. The secondary ischemia that develops following the initial mechanical insult is a serious complication of the SCI and severely impairs the function and viability of surviving neuronal and non-neuronal cells in the SC. In addition, ischemia is also responsible for the growth of lesion during chronic phase of injury and interferes with the cellular repair and healing processes. Thus there is a need to develop a spinal cord ischemia model for studying the mechanisms of ischemia-induced pathology. Focal ischemia induced by photothrombosis (PT) is a minimally invasive and very well established procedure used to investigate the pathology of ischemia-induced cell death in the brain. Here, we describe the use of PT to induce an ischemic lesion in the spinal cord of mice. Following retro-orbital sinus injection of Rose Bengal, the posterior spinal vein and other capillaries on the dorsal surface of SC were irradiated with a green light resulting in the formation of a thrombus and thus ischemia in the affected region. Results from histology and immunochemistry studies show that PT-induced ischemia caused spinal cord infarction, loss of neurons and reactive gliosis. Using this technique a highly reproducible and relatively easy model of SCI in mice can be achieved that would serve the purpose of scientific investigations into the mechanisms of ischemia induced cell death as well as the efficacy of neuroprotective drugs. This model will also allow exploration of the pathological changes that occur following SCI in live mice like axonal degeneration and regeneration, neuronal and astrocytic Ca2+ signaling using two-photon microscopy.

Photothrombosis is a minimally invasive and highly reproducible procedure to induce focal ischemia in the spinal cord and serves as a model of spinal cord injury in mice.

マウスの脊髄損傷のモデルとしての光血栓誘発性局所虚血

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) ...

医学

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

In Vivoデュオ カラー霊長類脊髄損傷血管動態のイメージング手法

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

再生に関する末梢および中枢神経系を研究するため生体内でショウジョウバエ損傷モデル

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Real-Time Assessment of Spinal Cord Microperfusion in a Porcine Model of Ischemia/Reperfusion

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its incidence is still considerably high and therefore, influences patient outcome. Microcirculation plays a key role in tissue perfusion and oxygen supply and is often dissociated from macrohemodynamics. Thus, direct evaluation of spinal cord microcirculation is essential for the development of microcirculation-targeted therapies and the evaluation of existing approaches in regard to spinal cord microcirculation. However, most of the methods do not provide real-time assessment of spinal cord microcirculation. The aim of this study is to describe a standardized protocol for real-time spinal cord microcirculatory evaluation using laser-Doppler needle probes directly inserted in the spinal cord. We used a porcine model of ischemia/reperfusion to induce deterioration of the spinal cord microcirculation. In addition, a fluorescent microsphere injection technique was used. Initially, animals were anesthetized and mechanically ventilated. Thereafter, laser-Doppler needle probe insertion was performed, followed by the placement of cerebrospinal fluid drainage. A median sternotomy was performed for exposure of the descending aorta to perform aortic cross-clamping. Ischemia/reperfusion was induced by supra-celiac aortic cross-clamping for a total of 48 min, followed by reperfusion and hemodynamic stabilization. Laser-Doppler Flux was performed in parallel with macrohemodynamic evaluation. In addition, automated cerebrospinal fluid drainage was used to maintain a stable cerebrospinal pressure. After completion of the protocol, animals were sacrificed, and the spinal cord was harvested for histopathological and microsphere analysis. The protocol reveals the feasibility of spinal cord microperfusion measurements using laser-Doppler probes and shows a marked decrease during ischemia as well as recovery after reperfusion. Results showed comparable behavior to fluorescent microsphere evaluation. In conclusion, this new protocol might provide a useful large animal model for future studies using real-time spinal cord microperfusion assessment in ischemia/reperfusion conditions.

Spinal cord microcirculation plays a pivotal role in spinal cord injury. Most methods do not allow real-time assessment of spinal cord microcirculation, which is essential for the development of microcirculation-targeted therapies. Here, we propose a protocol using Laser-Doppler-Flow Needle probes in a large animal model of ischemia/reperfusion.

イシュ血症/再灌流の豚モデルにおける脊髄微小灌流のリアルタイム評価

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its ...

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes this animal model very useful for studying spinal cord injury and regeneration. The standard protocol for inducing such lesions is to transect the dorsal part of the trunk manually. However, this technique requires extensive training and damages additional tissues. A protocol was developed for laser-induced lesions to circumvent these limitations, allowing for high reproducibility and completeness of spinal cord transection over many animals and between different sessions, even for an untrained operator. Furthermore, tissue damage is mainly limited to the spinal cord itself, reducing confounding effects from injuring different tissues, e.g., skin, muscle, and CNS. Moreover, hemi-lesions of the spinal cord are possible. Improved preservation of tissue integrity after laser injury facilitates further dissections needed for additional analyses, such as electrophysiology. Hence, this method offers precise control of the injury extent that is unachievable manually. This allows for new experimental paradigms in this powerful model in the future.

The present protocol describes a method to induce tissue-specific and highly reproducible injuries in zebrafish larvae using a laser lesion system combined with an automated microfluidic platform for larvae handling.

ゼブラフィッシュ幼虫の脊髄再生を研究するための制御された半自動レーザー誘発傷害

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...

アン

要約

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二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

根切断術後の後根の軸索のライブイメージング

小脳軸索のレーザーNanosurgery

縦断のために脊髄商工を移植するための手順

マウス背側列のクラッシュ損傷におけるミクログリアおよびマクロファージと軸索の相互作用の生体内イメージング

マウスの脊髄損傷のモデルとしての光血栓誘発性局所虚血

In Vivoデュオカラー霊長類脊髄損傷血管動態のイメージング手法

再生に関する末梢および中枢神経系を研究するため生体内でショウジョウバエ損傷モデル

イシュ血症/再灌流の豚モデルにおける脊髄微小灌流のリアルタイム評価

ゼブラフィッシュ幼虫の脊髄再生を研究するための制御された半自動レーザー誘発傷害

アン

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二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

根切断術後の後根の軸索のライブイメージング

小脳軸索のレーザーNanosurgery

縦断のために脊髄商工を移植するための手順

マウス背側列のクラッシュ損傷におけるミクログリアおよびマクロファージと軸索の相互作用の生体内イメージング

マウスの脊髄損傷のモデルとしての光血栓誘発性局所虚血

In Vivoデュオ カラー霊長類脊髄損傷血管動態のイメージング手法

再生に関する末梢および中枢神経系を研究するため生体内でショウジョウバエ損傷モデル

イシュ血症/再灌流の豚モデルにおける脊髄微小灌流のリアルタイム評価

ゼブラフィッシュ幼虫の脊髄再生を研究するための制御された半自動レーザー誘発傷害

In Vivoデュオカラー霊長類脊髄損傷血管動態のイメージング手法